一種改造的家蠶桿狀病毒載體及利用其提高ns1表達量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種改造的家蠶桿狀病毒載體，該載體是在家蠶桿狀病毒載體Bm-Bacmid中，幾丁質酶和半胱氨酸蛋白酶基因被串聯的Cm表達盒和egfp表達盒替換。該載體中整合表達egfp基因，可用來實時監測細胞轉染或感染及昆蟲被感染后的情況。利用該載體，在其轉座位點插入家蠶二分濃核病毒ns1基因表達盒，通過制備的重組病毒感染BmN細胞或者家蠶，可獲得靶基因的表達。結果表明：該載體中缺失Chitinase和CysteinProtease基因，可延遲細胞裂解及昆蟲的液化，有利于外源基因的表達，在一定程度上抑制靶蛋白的酶切，從而提高ns1基因的表達產量，為深入研究NS1蛋白結構與功能奠定堅實的基礎。
【專利說明】一種改造的家蠶桿狀病毒載體及利用其提高NS1表達量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程技術，公開了一種新穎的家蠶桿狀病毒表達載體的構建流程及其在蛋白表達中的應用。
【背景技術】
[0002]桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(BEVS)通過制備攜帶有外源基因的重組桿狀病毒，感染昆蟲或昆蟲細胞進行外源蛋白的表達，表達廣物具有正確的空間折置和糖基化等修飾，其生物活性接近其對應的天然產物。在BEVS中，常用苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)或者家蠶核型多角體病毒(BmNPV)用作重組病毒構建的載體，而在表達外源蛋白時，我們傾向選擇家蠶桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統，這與我國的家蠶資源豐富及大規模養殖密切相關(Maeda et al., Nature, 1985，315:592 - 594)，容易獲得大量的目標蛋白。家蠶桿狀病毒具有容納外源大片段DNA或同時表達多個外源基因的能力；另外，家蠶桿狀病毒不感染人、畜等脊椎動物，表達外源蛋白所需時間周期也遠短于動物或植物系統，可通過昆蟲或細胞培養對外源蛋白進行大規模生產，這些特性使BEVS成為目前最有效、應用最廣泛的一種真核表達系統(Kato et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85:459-470)。
[0003]家蠶是我國一種具有重要經濟價值的昆蟲，主要以桑葉為食，只需要簡單的設備就可對家蠶進行大規模飼養，其生產的蠶絲是我國農業經濟的重要組成部分，在改善民生和可持續發展中起著重要作用；同時，由于家蠶飼養成本低廉，在家蠶體內表達外源蛋白，所需時間較短，容易對靶蛋白進行大規模生產，是一種非常優良的生物反應器，也是實現基因工程產業化的理想載體；2009年已完成對家蠶全基因組序列的測定和分析(Xia et al., Science, 2009，326:433 - 436)，遺傳背景清楚，有利于我們對家蠶進行遺傳改造，培育出更適合外源蛋白表達的家蠶新品種。另外，Luckow等(Luckow et al.，JVirol, 1993, 67:4566-4579 ；Possee et al., Biotechnol Bioeng, 2008, 101:1115 - 1122)建立了 一種高效、快速的用來構建重組病毒的篩選體系，剔除了多輪空斑篩選的繁瑣程序，提高重組病毒的陽性得率，由此，極大地簡化了家蠶重組桿狀病毒的構建、分離、鑒定以及定量，家蠶桿狀病毒表達系統的應用由此得到了推廣。自1985年利用該系統首次成功表達人干擾素-α (IFN-α) (Maeda et al., Nature, 1985, 315:592 - 594)以來，截止到目前為止，已通過BEVS在家蠶體內成功地表達了乙型肝炎表面抗原、人酸性/堿性成細胞生長因子、熒光素酶以及纖維素酶等上千種具有重要功能的重組蛋白(Lihoradova et al.,MolBiolj 2004，38:603 - 607 ；Wu et al.，Protein Expr Purifj 2001，21:192-200 ；Palhan et al.，Biotechniques，1995，19:97 - 104 ；Lee et al.，Biotechnol Lett, 2006，28:645 - 650)，現已廣泛應用于重組蛋白藥物的研發、疫苗生產以及重組病毒殺蟲劑等系列研究領域中，在生產實踐中具有廣闊的應用空間和發展前景。
[0004]盡管BEVS系統有諸多優勢以及技術上的不斷改進，但在實踐中還是面臨著一些挑戰，比如在培養的昆蟲細胞中表達外源蛋白，其生產成本較為昂貴(Tiwari et al.,MolBiotechnol, 2010, 46:80 - 89);在家蠶等昆蟲體內表達外源蛋白，其成本雖然較低，但又增加了從昆蟲體內分離及靶蛋白純化的難度；BEVS系統中缺乏有效的熒光信號，難以對轉染的細胞中是否產生感染性的重組病毒粒子進行快速判定，影響外源蛋白表達的進程；另外，與原核表達系統相比，BEVS表達的外源蛋白，其產量相對較低，尤其是感染后的細胞最終會裂解，致使靶蛋白的表達水平及其修飾還未達到最佳狀態(Ikonomou et al., ApplMicrobiol Biotechnol, 2003，62:1 - 20)，而通過iel早期啟動子替代多角體晚期啟動子可以連續表達靶源蛋白，使其糖基化修飾得到高效加工，但降低了靶蛋白的表達量(Jarviset al.，Biotechnology, 1990，8:950 - 955)，這些不足之處在一定程度上都限制了 BEVS系統的使用。因此，為優化家蠶桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統，有必要對家蠶桿狀病毒穿梭載體上的一些序列進行改造，簡化重組病毒粒子鑒定的方法，縮短外源蛋白表達所需時間，提高BEVS中外源蛋白的表達產量及其穩定性。
[0005]家蠶桿狀病毒基因組大小為128kb,理論預計有143個開放閱讀框(Gomi etal.，J Gen Virol, 1999，80:1323-1337)，其中包含有幾丁質酶和半胱氨酸蛋白酶基因，這兩個基因緊挨排列在一起，相互之間有48bp的間隔序列。幾丁質酶基因全長1659bp，編碼一個由552個氨基 酸組成的蛋白質；半胱氨酸蛋白酶基因全長972bp，編碼一個由323個氨基酸組成的蛋白質，研究表明幾丁質酶能水解家蠶內外表皮、中腸及圍食膜組織中的幾丁質，促進蟲體液化，而半胱氨酸蛋白酶與細胞裂解直接相關(Hawtin etal.，Virology, 1997，238:243 - 253 ；Hodgson et al.，J Virol,2011，8:3918 - 3929)，而在家蠶體內表達的外源蛋白也經常發生降解,研究表明這與BEVS系統中的CysteinProtease (半胱；氛酸蛋白酶)有關(Kadono-Okuda et al., Biochem Biophys ResCommun, 1995，213:389 - 396)，因此延遲細胞裂解及蟲體液化的時間可提高外源蛋白的表達產量。Chitinase和Cystein Protease是家蠶桿狀病毒復制的非必需基因，通過構建缺失Chitinase和Cystein Protease的病毒表達載體,獲得這兩種基因缺失型的病毒，可延長該病毒感染的昆蟲細胞存活時間，并抑制靶蛋白的降解，從而提高外源蛋白的表達量和其穩定性。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是:建立一種新穎、高效表達外源基因的家蠶桿狀病毒載體(Bm-Bacmid)，并利用該載體來表達家蠶二分濃核病毒NSl蛋白，提高NSl蛋白的表達量。主要技術路線:通過酶切、連接的方式，構建氯霉素基因(Cm)表達盒和綠色熒光蛋白基因(egfp)表達盒串聯的重組質粒；通過同源重組,將串聯的Cm表達盒和egfp表達盒替換家蠶桿狀病毒載體中的Chitinase和Cystein Protease兩個基因，從而獲得帶突光標記的家蠶桿狀病毒穿梭載體；通過轉座，將多角體啟動子控制的nsl基因定點插入到改造后的Bm-Bacmid中,在脂質體Cellfectin的介導下,將鑒定后的重組Bm-Bacmid轉染BmN細胞，通過觀察細胞中產生的綠色熒光信號，可快速判定感染性的重組病毒粒子的產生，將收集后的重組病毒上清液皮下注射4齡家蠶，從而建立了表達NSl蛋白的家蠶生物反應器體系O
[0007]本發明所要解決的問題是通過以下技術方案來實現的:
[0008]一種改造的家蠶桿狀病毒載體，包括家蠶桿狀病毒載體Bm-Bacmid，所述家蠶桿狀病毒載體Bm-Bacmid中，幾丁質酶和半胱氨酸蛋白酶基因被串聯的Cm表達盒和egfp表達盒替換。所述的egfp表達盒是iel早期啟動子控制的egfp表達盒。
[0009]本發明還公開了一種提高家蠶二分濃核病毒NSl蛋白真核表達產量的方法，在所述改造的家蠶桿狀病毒載體轉座位點，插入一個多角體啟動子控制的家蠶二分濃核病毒nsl基因表達盒，將其轉染BmN昆蟲細胞，通過觀察細胞中產生的綠色熒光信號，判定感染性的重組病毒粒子的產生，將收集后的重組病毒上清液皮下注射4齡家蠶，建立了表達NSl蛋白的家蠶生物反應器體系。
[0010]本發明的方法具體是:通過構建串聯有Cm表達盒和egfp基因表達盒的pUC119-US-Cm-egfp-DS重組質粒，其中US片段長度為538bp，其來源于待敲除的Chitinase基因上游序列；DS片段長度為514bp,來源于待敲除的Cystein Protease基因下游序列。以構建的pUC119-US-Cm-egfp-DS重組質粒為模板，通過PCR擴增可獲得長度為3675bp的US-Cm-egfp-DS片段，將純化的該DNA片段轉化含有Bm-Bacmid的大腸桿菌DHlOB感受態細胞，涂布在氯霉素和卡那霉素抗性平板上，通過多輪PCR對平板上的重組克隆進行驗證；利用酶切、連接的方法構建供體質粒pFastHTB-ns I,在轉座酶的作用下，該供體質粒與改造后的Bm-Bacmid載體間發生轉座,從而獲得可表達nsl基因的重組Bm-Bacmid穿梭載體,將其轉染家蠶BmN細胞，對轉染后的細胞進行熒光顯微連續觀察，可確定轉染上清溶液中是否已產生重組病毒粒子 ，收集轉染后的病毒上清溶液，對4齡家蠶進行皮下注射，通過觀察綠色熒光來監測病毒在家蠶體內增殖的情況，建立高效表達NSl蛋白的家蠶生物反應器體系，為深入研究NSl蛋白的結構與功能提供基礎。
[0011]所述Cm基因表達盒與egfp基因表達盒是串聯排列的。
[0012]本發明公開了缺失Chitinase和Cystein Protease基因的家蠶穿梭載體,利用該分子載體，構建整合表達nsl基因的整合型重組桿粒，通過對轉染后的BmN細胞、及皮下注射重組病毒的家蠶體內熒光進行觀察，可作為重組病毒粒子BV增殖及NSl蛋白在家蠶體內表達的情況的一個判定依據。
[0013]本發明:家蠶桿狀病毒穿梭載體中缺失幾丁質酶(Chitinase)和半胱氨酸蛋白酶(Cystein Protease)基因，缺失位點插入了串聯的Cm基因表達盒和egfp表達盒:Cm基因表達盒用于對目的片段缺失的篩選和鑒定，egfp表達盒可用于轉染與感染的情況判定。
[0014]利用該改造的家蠶桿狀病毒載體表達NSl蛋白，其重組病毒感染昆蟲細胞后，由于幾丁質酶(Chitinase)和半胱氨酸蛋白酶(CysteinProtease)基因的缺失,延遲細胞裂解及昆蟲液化的時間，提高了昆蟲或昆蟲細胞中NSl蛋白的表達產量。
[0015]本發明將串聯的氯霉素基因(Cm)表達盒和綠色熒光蛋白基因(egfp)表達盒取代家蠶桿狀病毒穿梭載體中的幾丁質酶(Chitinase)和半胱氨酸蛋白酶基因(CysteinProtease),通過轉座將家蠶二分濃核病毒nsl基因定點插入到改造后的家蠶穿梭載體中，制備缺失Chitinase和Cystein Protease基因、多角體啟動子控制下的nsl基因重組病毒；同時制備未缺失Chitinase和Cystein Protease基因、多角體啟動子控制下的nsl基因的重組病毒，對它們感染細胞后的NSl蛋白量進行比較分析，發現缺失型病毒感染的細胞中靶蛋白表達量是對照組的3倍，從而建立了一種高效表達可溶性NSl蛋白的方法，為該蛋白的結構與功能研究奠定基礎，同時為有效表達其它功能基因提供技術策略上的參考。【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1.重組質粒pUC119-US-Cm-egfp_DS的構建流程示意圖。
[0017]圖2.重組質粒 pUC119-US-Cm-egfp_DS 的鑒定。
[0018]1:通過US-F/US-R引物對擴增長度為551bp的US片段，擴增結果與理論預計一致；2:通過Cm-F/Cm-R引物對擴增長度為1079bp的Cm表達盒，擴增結果與理論預計一致；3:通過egfp-F/egfp-R引物對擴增長度為1544bp的egfp表達盒,擴增結果與理論預計一致；4:通過DS-F/DS-R引物對擴增長度為514bp的DS片段，擴增結果與理論預計一致；5:通過US-F/Cm-R引物對擴增長度為1630bp的US+Cm片段，擴增結果與理論預計一致；6:通過US-F/egfp-R引物對擴增長度為3174bp的US+Cm+egfp片段，擴增結果與理論預計一致；7:通過US-F/DS-R引物對擴增長度為3688bp的US+Cm+egfp+DS片段，擴增結果與理論預計一致；8:通過Cm-F/egfp-R引物對擴增長度為2623bp的Cm+egfp片段,擴增結果與理論預計一致；9:通過Cm-F/DS-R引物對擴增長度為3137bp的Cm+egfp+DS片段，擴增結果與理論預計一致；10:通 過egfp-F/DS-R引物對擴增長度為2058bp的egfp+DS片段，擴增結果與理論預計一致。
[0019]上述PCR擴增體系中，均用重組質粒pUC119-US-Cm-egfp_DS作為DNA模板。
[0020]圖3.缺失型重組Bm-Bacmid的構建流程示意圖和PCR鑒定。
[0021]A:通過同源重組對Bm-Bacmid進行改造,使串聯的Cm和egfp基因表達盒替換Chitinase和Cystein Protease基因中的部分DNA片段；B:在野生型和缺失型的Bm-Bacmid上標識引物所對應的具體位置；C:以不同的引物對，從野生型和缺失型Bm-Bacmid中進行PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。泳道1，3，5，7，9:以缺失型Bm-Bacmid為模板，分別通過Cm-F/Cm-R擴增Cm基因表達盒、egfp-F/egfp-R擴增egfp基因表達盒、Cm-F/egfp-R擴增Cm與egfp基因表達盒、US-F/Cm-R擴增US與Cm表達盒，以及US-F/DS-R擴增包括US、Cm表達盒、egfp基因表達盒與DS四個DNA片段，所有的擴增產物與理論序列長度都一致；泳道 2，4，6，8，10:以野生型 Bm-Bacmid 為模板，以 Cm-F/Cm-R、egfp-F/egfp-R、Cm-F/egfp-R、US-F/Cm-R及US-F/DS-R為引物對進行擴增，擴增產物(用作陰性對照)與理論預計相一致。
[0022]圖4.缺失型重組Bm-Bacmid轉染及感染BmN細胞后的熒光顯微觀察。
[0023]A:將缺失 Chitinase 和 Cystein Protease 基因的重組桿粒 pBm-Bacmid 轉染 BmN細胞，對其在不同時間點進行突光顯微觀察；B:將缺失Chitinase和Cystein Protease基因的重組病毒vBm-Bacmid感染BmN細胞，對其在不同時間點進行熒光顯微觀察。
[0024]圖5.利用改造后的重組Bm-Bacmid構建表達nsl基因的重組穿梭桿粒
[0025]泳道1:以未發生轉座的Bm-Bacmid為模板，以M13-F/M13-R引物對進行擴增，PCR產物大小理論長度為283bp ;泳道2:以轉座后的Bm-Bacmid為模板，以M13-F/M13-R引物對進行擴增，PCR產物大小理論長度為338Ibp。
[0026]圖6.重組病毒粒子感染后的家蠶表型觀察及家蠶體內表達的NSl蛋白鑒定。
[0027]A:將重組病毒粒子皮下注入家蠶體內，觀察其個體的生長情況；1，感染了野生型BmNPV的家蠶個體；2，感染了野生型病毒(不缺失Chitinase和Cystein Protease基因,表達NSl蛋白)的家蠶個體；3,感染了缺失型重組病毒(缺失Chitinase和Cystein Protease基因，表達NSl蛋白)的家蠶個體。B:通過Western blot對三種病毒感染后的家蠶血液NSl蛋白產量進行半定量分析。泳道1，空白對照；泳道2，重組表達NSl的野生型病毒感染家蠶后，其血液中NSl的鑒定；泳道3，重組表達NSl的缺失型病毒感染家蠶后，其血液中NSl的鑒定。
【具體實施方式】
[0028]實驗材料Hind III>PstI>Xba I>SacI>T4DNA ligase、Taq 酶和 pMD18_T 載體購自寶生物工程(大連)有限公司，引物合成和序列測定由上海生工生物工程公司完成，pUC18-Cm(Tang et al., J Invertebr Pathol, 2013, 113:70-77)、家香穿梭載體 Bm-Bacmid> pFastHTB質粒及DHlOB菌株(Invitrogene公司)、pUC119質粒和大腸桿菌菌株DH5 a (TaKaRa公司)、pFastHTB-Piel-egfp-sv40 (Li et al.，生物工程學報，2014，30(4):625-635)本實驗室保存，CellIcclinli II (Cat.n0.10362-100)購自Invitrogen公司，抽提質粒的試劑盒和切膠回收的試劑盒(Omega公司)，卡那霉素、氨卞青霉素、氯霉素慶大霉素和四環素購自Sigma公司，其它試劑均為國產分析純。
[0029]實施例1.重組質粒pUC119-US-Cm-egfp_DS的構建
[0030]利用Primer Premier5.0軟件設計四對特異性引物。首先，通過 US-F: 5' -GCAAGCTTCGTA TGCGTTTTGCTCGT-3’ (Hind III ) (SEQ ID N0.1)和US-R:5’ -AACTGCAGCGCGCCAAGTTGG AACT-3’ (PstI) (SEQ ID N0.2)兩條特異性引物，從家蠶桿狀病毒基因組中特異性擴增538bp特異性的US片段，將純化后的DNA片段與經過同樣雙酶切的PUC119質粒進 行連接，獲得重組質粒pUC119-US ;通過Cm-F: 5’ -AACTGCAGCTTCGAATAAATACCTGTGA-3’ (PstI)(SEQ ID N0.3)和 Cm-R:5’-AATCTAGAAACCAGCAATAGACATAAGC-3’(XbaI) (SEQ ID N0.4)引物對，從pUC18_Cm質粒中擴增長度為1039bp的Cm基因表達盒，將PstI和XbaI雙酶切后的Cm基因表達盒與經過同樣雙酶切的pUC119_US進行連接，獲得重組質粒 pUC119-US-Cm ;通過 egfp_F:5’ -GCTCTAGAGTAGGTTATTGATAAAATGAAC-3’ (XbaI) (SEQID N0.5)和 egfp-R:5’-CGAGCTCGATCCAGACATGATAAGATACATTG-3’ (SacI)(SEQ ID N0.6)引物對，從pFastHTB-Piel-egfp-sv40質粒中擴增長度為1544bp的egfp基因表達盒，將XbaI與SacI雙酶切后的egfp基因表達盒與經過同樣雙酶切的pUC119-US_Cm進行連接，獲得重組質粒 pUC119-US-Cm-egfp:通討 DS-F: 5’ -GCGAGCTCGGAATTGATTAATCTGTCG-3’ (SacI) (SEQID N0.7)和 DS-R:5' -AGAGCTCAGCAGTAGACGCAAGTTCG-3，(SacI) (SEQ ID N0.8)引物對，從家蠶桿狀病毒基因組中擴增514bp特異性的DS片段，將SacI酶切的DS片段與SacI酶切的pUC119-US-Cm-egfp載體進行連接，由于DS片段兩端都是SacI酶切位點，該片段可以正向或者反向的形式同時與pUC119-US-Cm-egfp連接，因此挑取平板上的克隆進行測序，對正向連接的重組質粒命名為pUC119-US-Cm-egfp-DS(如圖1所示)。
[0031]實施例2.重組質粒pUC119-US-Cm-egfp_DS的鑒定
[0032]由于該重組質粒中具有復雜的酶切位點，通過多輪PCR對該重組質粒進行鑒定(如圖2所示)。泳道1:US-F/US-R引物對擴增US，產物長度為551bp ;泳道2:Cm-F/Cm-R引物對擴增Cm基因表達盒，產物長度為1079bp ；lane3:egfp-F/egfp-R引物對擴增egfp表達盒，產物長度為1544bp ;泳道4:DS-F/DS-R引物對擴增DS片段，產物長度為514bp ；泳道5: US-F/Cm-R引物對擴增US_Cm，產物長度為1630bp ;泳道6:US-F/egfp-R引物對擴增 US-Cm-egfp，產物長度為 3174bp ；lane7:US-F/DS-R 引物對擴增 US-Cm-egfp-DS，產物長度為 3688bp ;泳道 8: Cm-F/egfp-R 引物對擴增 Cm-egfp，產物長度為 2623bp ；lane9:Cm-F/DS-R引物對擴增Cm-egfp-DS,產物長度為3137bp ；泳道10: egfp-F/DS-R引物對擴增egfp-DS，產物長度為2058bp。
[0033]上述PCR反應中，所用DNA模板均為重組質粒pUC119-US-Cm_egfp-DS。
[0034]實施例3.將串聯的Cm與egfp基因表達盒整合到家蠶Bm-Bacmid中
[0035]通過US-F/DS-R對鑒定的重組質粒pUCl 19-US-Cm-egfp-DS進行PCR擴增，獲得四聯體目的片段US-Cm-egfp-DS，取5ng純化的擴增產物，轉化捕獲有家蠶穿梭載體Bm-Bacmid的大腸桿菌DHlOB感受態細胞中，理論上在同源重組酶的作用下，US-Cm-egfp-DS 與家香穿梭載體 Bm-Bacmid 中的 Chitinase 和 Cystein Protease 基因發生雙交換，獲得Chitinase和Cystein Protease基因缺失型的Bm-Bacmid,同時，在缺失的Chitinase和Cystein Protease基因位點插入了串聯的Cm-egfp基因表達盒。通過添加有K+A+Cm+(50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml氨卞青霉素、25 μ g/ml氯霉素)三種抗生素的平板對重組Bm-Bacmid進行初篩，對平板上的克隆進行培養并抽提其重組Bacmid，利用不同的引物對對其進行多輪PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳對擴曾產物進行分析(如圖3C所示)，該結果證實了 Cm-egfp基因表達盒取代了 Chitinase和Cystein Protease基因中的部分DNA片段，獲得了這兩個基因的缺失重組桿粒。
[0036]實施例4.Chitinase和Cystein Protease基因缺失對病毒增殖的影響
[0037]為鑒定缺失Chitinase和Cystein Protease基因的家蠶重組桿粒,是否會影響病毒粒子的產生。抽提Chitinase和Cystein Protease基因缺失的家蠶重組桿粒,通過脂質體Ccmbctin? II(Cat.n0.10362-100)的介導，使其進入BmN細胞。對轉染后的細胞進行熒光顯微觀察，結果表明: 轉染24h后，有散落的綠色熒光分布在細胞之中，隨著時間的延長，在細胞中分布的綠色熒光信號越來越多，在轉染96h后，80%的視野中都布滿了熒光信號(如圖4A所示)。
[0038]為鑒定在細胞上清中產生的病毒粒子是否具有感染能力，收集轉染96h后的細胞上清，將其與BmN細胞孵育lh，吸掉培養細胞的上清，添加完全培養基，通過熒光顯微對其進行連續觀察，結果表明:感染24h后，能觀察到綠色熒光，且均勻分布在細胞之中，隨著時間的延長，綠色熒光信號越來越多，至感染96h后，整個視野中都布滿了綠色熒光(如圖4B所示)，說明細胞上清中的病毒粒子具有感染性，能啟動第二輪感染。由此說明，缺失Chitinase和Cystein Protease兩個基因的家蠶桿粒,能夠在轉染的BmN細胞中產生具有感染性的病毒粒子。因此，以該缺失型桿粒作分子載體，可構建高效表達外源基因的重組病毒。
[0039]實施例5.利用改造后的重組Bm-Bacmid制備表達nsl基因的重組病毒
[0040]利用Primer Premier5.0 軟件設計 nsl_F:5，-ATGAATTCATGGAATCGAAGTCAAATTT-3’ (EcoR I)(SEQ ID N0.9)和 nsl_R:5’-TACTCGAGCTACCCATAATATTTATTATATACG-3’(Xho I) (SEQ ID N0.10)，通過nsl_F和nsl_R從家蠶二分濃核病毒基因組中擴增nsl基因片段，對PCR擴增的目的片段進行EcoR I與Xho I雙酶切，將純化后的酶切片段與經過同樣雙酶切的pFastHTB進行連接，獲得重組供體質粒pFastHTB-nsl，通過轉座，將多角體啟動子控制的nsl基因表達盒定點插入到改造后的家蠶Bm-Bacmid轉座位點中。將100 μ I的懸液涂布于含三抗K+T+G+(50 μ g/ml卡那霉素、10 μ g/ml四環素、7 μ g/ml慶大霉素)以及添加有40 μ g/ml IPTG和20mg/ml X-gal的LB培養基平板上，在37 °C的烘箱中對其培養36~48h，對平板上較大的白色單菌落進行PCR鑒定(如圖5所示)，從而獲得能整合性表達nsl基因的重組Bm-Bacmid。
[0041]實施例6.制備整合型表達nsl的重組病毒粒子及感染的家蠶體內NSl蛋白的表達
[0042]從DHlOB大腸桿菌中抽提上述鑒定后的重組Bm-Bacmid，通過脂質體的介導，將其轉染貼壁培養的BmN細胞，對轉染后的細胞進行熒光顯微觀察，對能觀察到綠色熒光的轉染孔做好標記，轉染96h后，收集這些轉染孔中的細胞培養上清；將收集的轉染上清感染貼壁培養的BmN細胞，對感染后的細胞進行熒光顯微觀察，可進一步證實收集的上清中有感染性的重組病毒粒子，收集感染96h后的細胞培養上清，從而提高上清溶液中的病毒滴度。
[0043]對4齡家蠶(306品系，易感品種)從皮下注射5 μ I的病毒上清溶液，共注射50頭易感品系家蠶；以不表達nsl基因的野生型病毒(不缺失Chitinase和Cystein Protease基因)和整合表達nsl基因的野生型病毒分別注射家蠶作為對照，每組對照共注射50頭，每天以新采摘的桑葉對它們進行喂飼，在27°C的室溫條件下進行生長，6天后，發現不表達nsl基因的野生型病毒及整合表達nsl基因的野生型病毒，感染后的家蠶有明顯的感染癥狀，食欲較差、體型相對偏小；而整合表達nsl基因的缺失型病毒感染的家蠶食欲較好，體型偏大。通過體式熒光顯微鏡對整合表達nsl基因的病毒感染的家蠶進行熒光觀察，發現感染的家蠶整個體表都呈綠色，表明家蠶體內已感染整合有目的基因的重組病毒，并通過再次感染遍及家蠶的所有組織，對感染后的家蠶血液總蛋白進行Western blot分析，結果表明:缺失了 Chitinase和Cystein Protease基因的重組病毒感染的家蠶血液中，其NSl的表達量是野生型病毒感染的家蠶靶蛋白表達產量的3倍(如圖6B所示)。
[0044] 綜上所述，通過同源重組技術，使串聯的Cm基因表達盒和iel早期啟動子控制的egfp表達盒替換Chitinase和Cystein Protease,從而創建一種新穎、高效的外源基因表達載體，利用該載體可制備外源基因表達的重組病毒，與不缺失Chitinase和CysteinProtease的野生型病毒比較，該缺失型重組病毒可通過延遲細胞裂解時間及昆蟲液化時間，確實有效地提高了 nsl基因在感染的細胞及昆蟲體內的表達量，為NSl蛋白的功能與結構研究奠定基礎，同時也為大規模表達其它功能蛋白提供參考。
【權利要求】
1.一種改造的家蠶桿狀病毒載體，包括家蠶桿狀病毒載體Bm-Bacmid，其特征在于，所述家蠶桿狀病毒載體Bm-Bacmid中,幾丁質酶和半胱氨酸蛋白酶基因被串聯的Cm表達盒和egfp表達盒替換。
2.根據權利要求1所述改造的家蠶桿狀病毒載體，其特征在于，所述的egfp表達盒是iel早期啟動子控制的egfp表達盒。
3.利用權利要求1所述家蠶桿狀病毒載體提高NSl表達量的方法，其特征在于，在所述改造的家蠶桿狀病毒載體轉座位點，插入一個多角體啟動子控制的家蠶二分濃核病毒nsl基因表達盒，將其轉染BmN昆蟲細胞，制備重組的芽生型BV病毒粒子，將該重組病毒感染BmN細胞或者家蠶， 可提高靶蛋白NSl的表達產量。
【文檔編號】C12N15/866GK104017826SQ201410240766
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】李國輝, 李芒芒, 唐琦, 胡朝陽, 姚勤, 周倩, 陳克平 申請人:江蘇大學