草木犀劍菌在生物轉化3-吲哚乙腈合成3-吲哚乙酰胺中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于微生物【技術領域】，開了草木犀劍菌Ensifer?meliloti?CGMCC7333在生物轉化3-吲哚乙腈生成3-吲哚乙酰胺中的應用。本發明使用的菌株易于培養，應用于生物催化3-吲哚乙腈合成3-吲哚乙酰胺具有工藝簡單，轉化率高等特點。產物3-吲哚乙酰胺可用作醫藥中間體以及用于合成如植物激素3-吲哚乙酸等。
【專利說明】草木犀劍菌在生物轉化3-吲哚乙腈合成3-吲哚乙酰胺中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物【技術領域】，具體涉及草木犀劍菌CGMCC7333應用于催化3_吲哚乙腈生成3-吲哚乙酰胺。
【背景技術】
[0002]生物催化是指利用酶或者全細胞作為催化劑進行化學轉化的過程。由于生物催化反應的本質是酶催化反應，因而具有酶反應的高效性、多樣性、底物專一性、區域選擇性、化學選擇性、對映選擇性以及溫和的反應條件等特點。目前生物催化反應已廣泛運用在化工、醫藥、農藥和食品等行業中。
[0003]腈化合物是一類重要的化工合成原料。由腈化合物出發可以獲得酰胺、酸等價值更高、應用范圍更廣的一類化合物。其中催化腈化合物生成相應的酰胺化合物的酶類為腈水合酶。微生物產生的腈水合酶具有反應條件溫和、產率高、副產物少、區域和立體選擇性強等優點。含腈水合酶的微生物細胞如綠針假單胞菌Pseudomonas chlororaphis B23,紅球菌屬Rhodococcus sp.N-774和玫瑰紅球菌Rhodococcus rhodochrous Jl已成功應用于生物轉化丙烯腈生產丙烯酰胺、3-氰基吡啶生產煙酰胺以及己二腈生產5-氰基戊酰胺。
[0004]3-吲哚乙酰胺可用于合成植物生長激素3-吲哚乙酸，合成色胺，即3-(2-氨乙基)吲哚，色胺是合成具有治療腦動脈硬化作用的長春胺和脫水長春胺乙酯等生物堿的中間體。3-吲哚乙酰胺 還可以用于合成蛋白激酶C抑制劑雙吲哚馬來酰亞胺IV。目前尚未見有來源于劍菌屬(Ensifer)的細菌催化3-吲哚乙腈合成3-吲哚乙酰胺的文獻報道。
[0005]在先的中國專利申請(申請號2013101207993)公開了一株草木犀劍菌CGMCC7333，及該菌在噻蟲啉微生物降解中的應用，未公開該菌的其他應用。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種用于生物催化3-吲哚乙腈生成3-吲哚乙酰胺的微生物
轉化方法。
[0007]本發明提供了草木犀劍菌CGMCC7333菌株在生物轉化3_吲哚乙腈生成3_吲哚乙酰胺中的應用(如圖1所示)。
[0008]本發明使用的菌株易于培養，應用于生物催化3-吲哚乙腈合成3-吲哚乙酰胺具有工藝簡單，轉化率高等特點。產物3-吲哚乙酰胺可用作醫藥中間體以及用于合成如植物激素3-吲哚乙酸等。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1:微生物轉化3-吲哚乙腈合成3-吲哚乙酰胺示意圖。
[0010]圖2:草木犀劍菌CGMCC7333生物轉化3_吲哚乙腈合成3_吲哚乙酰胺的HPLC圖。
[0011]圖3:草木犀劍菌CGMCC7333生物轉化3_吲哚乙腈產物的質譜圖。【具體實施方式】
[0012]實施例一：將草木犀劍菌CGMCC7333劃線于LB固體瓊脂培養基上。LB培養基組成為：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC110g/L, pH調節至7. 0，配制固體培養基加入20g/L瓊脂粉。培養基于115°C高壓滅菌20min。待固體平板上長出單菌落后，挑取一個單菌落接種至加入終濃度為O. lmmol/L氯化鈷的IOmL的LB液體培養基中，30°C，220rpm振蕩培養24h后，8000rpm離心10min收集細胞，懸浮于0.05mol/L的pH7. 5磷酸鉀緩沖液中，細胞濃度(0D600)調節為5.0。取5mL上述細胞懸浮液于50mL離心管中，加入3-吲哚乙腈O. 5mg (濃度為O. 5g/L)。離心管于30°C,220rpm的搖床中進行反應，反應12h后取樣，8000rpm離心lOmin，取上清，用O. 22 μ m孔徑的水相過濾膜過濾后，采用安捷倫1200型高效液相色譜儀檢測反應產物。結果如圖2所示，草木犀劍菌CGMCC7333可將3-吲哚乙腈（保留時間為10. 6min)轉化為保留時間為4.0min的產物（圖2)，該產物的保留時間與標準品3-吲哚乙酰胺一致。液相色譜質譜聯用檢測結果如圖3所示。其中質荷比為175為分子母體化合物加氫離子峰（M+H)，質荷比為197的離子峰為加鈉離子峰（M+Na)，質荷比為213的離子峰為加鉀離子峰（M+K)。上述結果表明，草木犀劍菌CGMCC7333轉化產物為3-吲哚乙酰胺。
[0013]實施例二 ：用無菌牙簽挑取一環經活化的草木犀劍菌CGMCC7333于裝有20mL液體LB培養基的IOOmL三角瓶中，三角瓶置于30°C的恒溫搖床中于220rpm轉速下振蕩培養16h后，取ImL接種于含O. lmmol/L氯化鈷的IOOmL的LB液體培養基中30°C，220rpm振蕩培養12h后，1000Orpm離心10min，收集細胞并懸浮于0. 05mol/L的pH7. 5磷酸鉀鹽緩沖液中，細胞濃度（0D600)調節為5.0。轉化12h后取樣測定3-吲哚乙酰胺的含量，結果表明在上述條件下，生成的3-吲哚乙酰胺的濃度為0. 76g/L。
[0014]實施例三：與實例二基本相同，轉化時間為24h，HPLC定量分析結果表明，生成的3-吲哚乙酰胺的濃度為I. 03g/L。 [0015]實施例四：將保藏的草木犀劍菌CGMCC7333劃線于LB固體瓊脂培養基上。待固體平板上長出單菌落后，挑取一單菌落接種至IOmL含0. lmmol/L氯化鈷的LB液體培養基中，300C，220rpm振蕩培養24h后，然后在該體系中加入3-吲哚乙腈10mg，繼續在30°C，220rpm振蕩培養24h后，HPLC法檢測產物3-吲哚乙酰胺的生成。結果顯示，草木犀劍菌CGMCC7333可在該體系中將3-吲哚乙腈轉化為3-吲哚乙酰胺。定量分析表明，轉化24h后，生成的3-吲哚乙酰胺的濃度為0. 125g/L。
【權利要求】
1.草木犀劍菌CGM CC7333在生物轉化3-吲哚乙腈生成3-吲哚乙酰胺中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK104031953SQ201410236045
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】戴亦軍, 周玲艷, 王鑫, 孫仕磊 申請人:南京師范大學, 南京諾生生物科技有限公司