一株好氧反硝化菌及在水體中脫氮的應用的制作方法
【專利摘要】一株好氧反硝化菌，為假單胞菌屬(Pseudomonas)物種，菌株命名為AO0049，該菌株已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO.9089。本發明的好氧反硝化菌可以用于景觀水體及其他富營養化水體的脫氮治理。90892014.04.25
【專利說明】一株好氧反硝化菌及在水體中脫氮的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于環境微生物【技術領域】，具體地涉及一株好氧反硝化菌。
[0002] 本發明還涉及上述好氧反硝化菌株的篩選及擴大培養方法。
[0003] 本發明還涉及上述好氧反硝化菌株在水體中脫氮的應用。
【背景技術】
[0004] 隨著經濟的發展，人們的居住環境也在不斷改善。城市景觀水體作為城市建設的 一項重要內容，引入了人們的生活。景觀水體包括天然湖泊、人造湖泊、人造景觀湖和各種 景觀河道，可以調節區域小氣候，美化環境。但由于水源水質較差，雨水徑流污染，底泥及人 為污染，同時景觀水體多數為靜態水，且水域面積小，水體自凈能力較差，極易造成氮磷元 素及有機物的累積，造成水體富營養化，嚴重可引起水華。
[0005] 水體微生物修復就是通過合適的方法利用微生物對水體中的污染物進行吸收、富 集、降解和脫除，減少或最終消除水體污染的過程，該方法在靜態景觀水體的修復中具有治 本性、經濟性和高效性的特點。由于景觀水體碳氮比較低，且溶解氧濃度一般為4mg/L以 上，因此，強化氮循環微生物系統好氧轉化和去除氮營養鹽污染物對于景觀水體的富營養 化控制和生態重建具有重要的意義。好氧反硝化菌能夠在有氧條件下將含氮化合物轉化為 氮氣等氣態氮化物，多數同時還具有異養硝化的能力，為水體脫氮提供了一種全新的思路。
[0006] 自20世紀80年代研究人員首次分離得到好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha(Paracoccus pantotrophus)以來，學者們相繼從土壤、活性污泥、養殖水體等 多種環境中分離得到此類菌株。目前，好氧反硝化菌種在景觀水體脫氮中應用多停留在實 驗小試階段，一個規模化應用的主要瓶頸是高性能好氧反硝化菌種的獲得以及簡易、可靠 的擴大化培養方法的建立。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一株高效好氧反硝化菌株。
[0008] 本發明的另一目的是提供一種篩選和擴大培養上述好氧反硝化菌株的方法。
[0009] 本發明的又一目的是上述好氧反硝化菌株應用于景觀水體及其他富營養化水體 脫氮。
[0010] 為實現上述目的，本發明提供的好氧反硝化菌株，為假單胞菌屬（Pseudomonas) 物種，囷株命名為A00049,該囷株已保減于中國普通微生物囷種保減管理中心（CGMCC)，保 藏編號為 CGMCC N0. 9089。
[0011] 所述的好氧反硝化菌，為革蘭氏陰性菌，在LB固體培養基上為土黃色，利用硝酸 鹽為唯一氮源生長。
[0012] 本發明的好氧反硝化菌的篩選方法，是將采集的水體于富集馴化培養基中進行培 養、篩選，得到好氧反硝化菌。
[0013] 所述的篩選方法中，采集水體是用滅菌采樣瓶取深度在0. 5m左右的表層水。
[0014] 所述的篩選方法中，富集馴化培養基組成為：KN03lg/L，KH2P0 4lg/L， FeCl2 · 6Η200· 5g/L，CaCl2 · 7Η200· 2g/L，MgS04 · 7H201g/L，琥珀酸鈉 8. 5g/L，ρΗ7· 0。
[0015] 本發明的好氧反硝化菌的擴大化培養方法，是將上述篩選得到的好氧反硝化菌， 于發酵培養基中維持培養液pH為6. 5-7. 5,溶解氧濃度在2mg/L以上，培養液總氮和C0D均 降至較低濃度，此時擴大化培養完成。
[0016] 所述的擴大化培養方法中，發酵培養基組成為：NH4C10. 4?1. 2g/L ;KH2P040. 75? 1. 5g/L，FeCl2 · 6Η200· 4 ?1. 2g/L，CaCl2 · 7Η200· 1 ?0· 3g/L，MgS04 · 7Η200· 75 ?1. 2g/L， 檸檬酸三鈉5?10g/L，ρΗ6· 8?7· 5。
[0017] 本發明的好氧反硝化菌可以應用在景觀水體及其他富營養水體中進行脫氮。
[0018] 本發明的好氧反硝化菌對硝態氮轉化率能達到90%以上，并且亞硝態氮很少累 積，無二次污染。
[0019] 本發明的好氧反硝化菌對景觀水體中氨氮、硝態氮、亞硝態氮及C0D均去除效果 良好，具有很大的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例2中菌株A00049景觀水脫氮效果。
[0021] 圖2為實施例3中基于16S rRNA基因序列構建的菌株A00049的系統發育進化樹。
【具體實施方式】
[0022] 本發明提供的好氧反硝化菌株，為假單胞菌屬（Pseudomonas)物種，命名為 A00049。該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區北 辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC N0. 9089,保藏日期為2014年4月25號。
[0023] 本發明的菌株A00049為革蘭氏陰性菌，在LB固體培養基上為土黃色，可利用硝酸 鹽為唯一氮源生長。
[0024] 本發明對菌株A00049進行了系統進化分析，獲得全長1401bp的16S rRNA基因序 列，在 GenBank 的登錄號為 KJ734677。經 BLAST((Basic Local Alignment Search Tool) 序列同源性比對及系統發育進化樹的構建，初步鑒定該菌株為Pseudomonas屬物種。
[0025] 菌株A00049從景觀水體篩選得到，其中水樣取自北京市某公園。將新鮮水樣接種 至好氧反硝化菌富集馴化培養基TB中，待培養液中總氮濃度降至較低水平時，采用溴百里 酚藍（BTB)分離培養基進行平板篩選并采用TB培養基進行菌株好氧反硝化性能的測定。經 初篩和復篩實驗，得到一株高效好氧反硝化脫氮菌株，命名為A00049。
[0026] TB 富集馴化培養基：KN03lg/L，KH2P04lg/L，FeCl 2 · 6Η200· 5g/L，CaCl2 · 7Η200· 2g/ L，MgS04 · 7H201g/L，琥珀酸鈉 8. 5g/L，ρΗ7· 0。
[0027] 溴百里酚藍（BTB)分離培養基：Agar20g/L，KN03lg/L，KH2P04lg/L， FeCl2 · 6Η200· 5g/L，CaCl2 · 7Η200· 2g/L，MgS04 · 7H201g/L，琥珀酸鈉 8. 5g/L，BTB(1%溶解 于無水乙醇）lmL，pH7. 0。
[0028] 本發明的菌株A00049擴大化培養的優化方法如下：
[0029] 采用培養基SCT，維持培養液pH為6. 5-7. 5,溶解氧濃度在2mg/L以上，培養 4d以上，總氮和C0D均降至較低水平，此時擴大化培養完成。培養基SCT :NH4C10. 4? 1. 2g/L ;ΚΗ2Ρ040· 75 ?1. 5g/L，FeCl2 · 6Η200· 4 ?1. 2g/L，CaCl2 · 7Η200· 1 ?0· 3g/L， MgS04 · 7Η200· 75 ?1. 2g/L，檸檬酸三鈉 5 ?10g/L，ρΗ6· 8 ?7· 5。
[0030] 以下具體實施例詳細闡述了本發明的技術方案，其目的是為了更好地理解本發 明，而不是用于限制本發明。
[0031] 實施例1 :景觀水體中好氧反硝化菌的篩選及好氧反硝化性能測定
[0032] 采樣地點為北京市某公園景觀水體，用滅菌采樣瓶取深度在0. 5m左右的表層水。 在超凈工作臺中將10mL水樣加入到90mL滅菌的TB培養基中，置于30°C、160rpm轉速的搖 床。每隔24h取培養液，離心后測定上清液中總氮的濃度并計算除氮率。約72h后，培養液 中總氮含量降低80%以上，完成好氧反硝化菌的富集馴化過程。
[0033] 從培養液中取樣依次稀釋至10_4、10_5、10_ 6、10_7、10_8、10_9六個梯度，吸取10(^1^ 至溴百里酚藍（BTB)分離培養基涂布均勻后置于30°C恒溫培養箱培養2天。好氧反硝化菌 可利用硝酸鹽產生堿度，因而會使菌落周圍培養基變為藍色。觀察并挑取出現藍色暈圈的 單菌落至新的BTB培養基，三線法劃線純化，將純化后菌株進行編號和保藏，至此完成好氧 反硝化菌的初篩，共20株。
[0034] 從固體培養基取一環生長良好菌體接種至LB液體培養基，取10mL處于對數生長 期的培養液，8000rpm轉速離心洗滌后接種至100mL滅菌的TB培養基，設置3個重復，置于 30°C，160rpm轉速搖床培養，每隔24h測定培養液中硝態氮和亞硝態氮濃度。經過48h的培 養，20株細菌有18株總氮去除率在50%以上，3株在90%以上，其中菌株A00049總氮去除 率為98. 94%，亞硝態氮累積量僅為0. 01mg/L，是除氮效果最好菌株。表1為菌株A00049 在TB培養基中脫氮效果。
[0035] 溴百里酚藍（BTB)分離培養基：Agar20g/L，KN03lg/L，KH2P04lg/L， FeCl2 · 6Η200· 5g/L，CaCl2 · 7Η200· 2g/L，MgS04 · 7H201g/L，琥珀酸鈉 8. 5g/L，BTB(1%溶解 于無水乙醇）lmL，pH7. 0 ;
[0036] TB 富集馴化培養基：KN03lg/L，KH2P04lg/L，FeCl 2 · 6Η200· 5g/L，CaCl2 · 7Η200· 2g/ L，MgS04 · 7H201g/L，琥珀酸鈉 8. 5g/L，pH7. 0 ;
[0037] LB 培養基：Tryptonel0g/L，Yeast Extract5g/L，NaC110g/L，pH7. 0。
[0038] 實施例2 :菌株A00049景觀水脫氮實驗
[0039] 以取樣地點的景觀水為實驗用水，測定其pH為7.0,氨氮，硝態氮，亞硝態氮，總氮 濃度及C0D分別為34、44、2、80、30mg/L。取500mL水樣于1L搖瓶中，加入檸檬酸鈉調節碳 氮比至15:1。
[0040] 取LB培養基中處于對數生長期菌液，離心后棄去上清，加入生理鹽水洗滌兩次， 將菌懸液接種至上述水樣中，在30°C、160rpm轉速的搖床中震蕩培養，每隔24h測定水樣 的pH,氨氮，硝態氮，亞硝態氮，總氮濃度及C0D。至48h，總氮降至5mg/L，C0D降至20mg/L， 總氮去除率達93. 75%。氨氮，硝態氮，亞硝態氮的濃度變化如圖2所示。該景觀水經菌株 A00049脫氮處理后，總氮及C0D得到了較好去除效果，，可見該菌株在景觀水體及其他富營 養水體脫氮中具有很大的應用潛力。
[0041] 實施例3 :菌株A00019擴大培養方法
[0042] 基于上面的研究成果，可以發現菌株A00049在景觀水脫氮治理中效果良好，而在 實際的應用中，不僅要保證菌株的脫氮性能，又要采用優化培養使得菌體密度達到最高，以 利于制劑化研究和應用。下面為好氧反硝化菌株擴大培養的優化方法。
[0043] 從斜面挑取菌體至滅菌后的SCT培養基，置于30°C搖床以160rpm轉速培養。約 24h菌體生長至對數期，將其離心洗滌后按10%比例（v/v)接種至放有10L新鮮培養基SCT 的無菌培養瓶中，室溫下培養。為了保證好氧反硝化菌的氧氣需求，采用曝氣裝置以維持培 養基中的溶解氧濃度在2mg/L以上。
[0044] 菌株擴大培養過程中，維持培養液pH為6. 5-7. 5。隨著亞鐵的氧化，培養液顏色由 淺綠色逐漸變為紅棕色。經過5d的培養，培養液總氮降至10mg/L左右，C0D降至100mg/L 左右。此時菌株的擴大培養完成，可將培養液投加至反應器或待處理污水中。
[0045] SCT 發酵培養基：NH4C10. 47g/L ;ΚΗ2Ρ041· Og/L，FeCl2 · 6Η201· 07g/L， CaCl2 · 7Η200· 2g/L，MgS04 · 7H20L 0g/L，檸檬酸三鈉 5g/L，ρΗ7· 0。表 1 :菌株 A00049 在 TB 培養基中脫氮效果
[0046]
【權利要求】
1. 一株好氧反硝化菌，為假單胞菌屬（Pseudomonas)物種，菌株命名為A00049,該菌株 已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO. 9089。
2. 根據權利要求1所述的好氧反硝化菌，為革蘭氏陰性菌，在LB固體培養基上為土黃 色，利用硝酸鹽為唯一氮源生長。
3. 權利要求1所述好氧反硝化菌的篩選方法，將采集的水體于富集馴化培養基中進行 培養、篩選，得到好氧反硝化菌。
4. 根據權利要求3所述的篩選方法，其中，采集水體是用滅菌采樣瓶取深度在0. 5m左 右的表層水。
5. 根據權利要求3所述的篩選方法，其中，富集馴化培養基組成為：KN03lg/L， KH2P04lg/L，FeCl2 · 6Η200· 5g/L，CaCl2 · 7Η200· 2g/L，MgS04 · 7H201g/L，琥珀酸鈉 8. 5g/L， ρΗ7· 0。
6. 權利要求1所述好氧反硝化菌的擴大化培養方法，將權利要求3篩選得到的好氧反 硝化菌，于發酵培養基中維持培養液pH為6. 5-7. 5,溶解氧濃度在2mg/L以上，培養液總氮 和COD均降低，此時擴大化培養完成。
7. 根據權利要求6所述的擴大化培養方法，其中，發酵培養基組成為：NH4C10. 4? 1. 2g/L ;ΚΗ2Ρ040· 75 ?1. 5g/L，FeCl2 · 6Η200· 4 ?1. 2g/L，CaCl2 · 7Η200· 1 ?0· 3g/L， MgS04 · 7Η200· 75 ?1. 2g/L，檸檬酸三鈉 5 ?10g/L，ρΗ6· 8 ?7· 5。
8. 權利要求1所述的好氧反硝化菌在景觀水體及其他富營養水體中進行脫氮的應用。
【文檔編號】C12R1/38GK104250625SQ201410229739
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】李安峰, 駱堅平, 劉玉娟, 潘濤, 董娜, 郭行 申請人:北京市環境保護科學研究院