利用dna納米折紙結構作為信號放大探針的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，將生物素分子通過折紙的過程嵌入到DNA納米結構上，所制備的產物為含有多生物素活性位點的DNA納米結構，此結構可作為信號放大探針應用于生物檢測領域中，從而實現抗原、抗體、蛋白質、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測。
【專利說明】利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于DNA納米技術發展及應用領域，涉及一種將生物素分子通過折紙方式嵌入到DNA納米結構上從而制備出信號放大探針，通過此探針與親和素、鏈霉親和素、或鏈霉親和素標記的辣根過氧化酶的連接從而將此信號放大探針應用于生物檢測領域中，從而實現抗原、抗體、蛋白質、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測的分析方法。
【背景技術】
[0002]癌癥是導致人類死亡的主要疾病之一，我國的癌癥發病率成逐年快速上升趨勢。而多數腫瘤如果早期發現即有手術根治機會，因此提高腫瘤的早期檢測水平是改善癌癥臨床療效的關鍵之一，早發現、早診斷、早治療成為當前癌癥臨床治療的重要目標。在癌癥初始階段實現相關靶蛋白的痕量檢測對于控制癌癥惡化和有針對性治療癌癥無疑具有極為重要的意義。目前癌癥的早期檢測和篩查主要基于高特異性腫瘤標志物的血清學檢測。然而，現有的血清學檢測技術在靈敏度上存在明顯的不足。因此，如何建立一種高靈敏度又具較好特異性的生物檢測系統是目前分子診斷及癌癥治療等領域亟待解決的生命科學問題。
[0003]新型的納米材料以及結構的制備與應用不僅給納米技術注入了新的活力，也給腫瘤早期診斷的研究及發展起了巨大的推動作用。目前利用納米顆粒或納米結構作為信號放大探針進行生物分子的高靈敏檢測的研究已相當成熟，但尚未充分滿足目前對于腫瘤早期診斷的檢測限要求；近幾年國際上基于DNA分子進行設計的納米生物復合結構，因其結構可控、且高效負載等優點而有望成為新一代的信號放大探針。在充分利用和發展納米技術特有的優勢的基礎上，有望基于DNA納米折紙結構制備聞效及多功能的納米生物復合結構作為信號放大探針從而大大提升目前的腫瘤早期診斷水平，為抗腫瘤研究工作累計理論基礎和實踐經驗。
【發明內容】
[0004]為克服現有技術的不足，本發明提供一種利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法。
[0005]一種利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，將生物素分子通過折紙的過程嵌入到DNA納米結構上，所制備的產物為含有多生物素活性位點的DNA納米結構，此結構可作為信號放大探針應用于生物檢測領域中，從而實現抗原、抗體、蛋白質、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測。
[0006]所述的DNA納米結構由DNA通過自組裝、延伸、折疊等技術構成的一類納米結構，組成此結構的單鏈DNA，可經過如巰基、或生物素、或氨基修飾。
[0007]包括以下幾個步驟:
(1)長鏈DNA溶液中，加入訂書釘鏈DNA，混合均勻后由高溫緩慢降至室溫；
(2)向(I)步驟所得產物中，加入連接分子，混合均勻后水浴中連接；
(3)構建基于特定生物分子的檢測系統； (4)將(2)步驟所得產物應用到(3)步驟中的檢測系統中；或通過納米載體應用到(3)步驟中的檢測系統中。
[0008]所述長鏈DNA為合成的長鏈DNA、或噬菌體M13、或經過滾環擴增技術所得的長單鏈DNA ;所述訂書釘鏈DNA，為多條能與長鏈DNA互補雜交的單鏈DNA，其中一條或多條為生物素修飾。
[0009]步驟(I)所述高溫為95°C，室溫為25°C，降溫時間為12小時以上。
[0010]所述連接分子為親和素、或鏈霉親和素、或鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶。
[0011]所述與連接分子作用條件為25?37°C，水浴30分鐘以上。
[0012]所述特定生物分子為蛋白、抗原、腫瘤標志物、一段DNA，或RNA序列、多肽或腫瘤細胞。
[0013]所述檢測系統為蛋白質微陣列芯片、或基因芯片、或微流控蛋白質芯片、或酶聯免疫吸附試驗，方式為三明治法、或間接法、或競爭法。
[0014]所述納米載體為納米金、或納米銀、或磁性納米粒子。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1 DNA納米折紙結構負載鏈霉未和素原子力顯微鏡下成像結果；aftf頭處為DNA納米折紙結構；b箭頭處為鏈霉親和素。
【具體實施方式】
[0016]實施例1:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環 DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產物40 μ L經過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環DNA及引物DNA0取回收所得產物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25。C。產物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2μ LlOmM鏈霉親和素，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入10yLMill1-Q水。取5 μ L滴到平整清潔云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗，原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0017]實施例2:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環 DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產物40μ L經過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環DNA及引物DNA0取回收所得產物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2μ LlOmM鏈霉親和素-量子點，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0018]利用點樣儀將1yL lyg/mL AFP抗原固定在醛基化玻片表面，4° C環境下過夜后PBST洗滌三次，加入20 μ L 100 μ g/mL生物素標記的AFP抗體37° C孵育Ih后，PBST洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，PBST洗滌后，熒光顯微鏡下檢測。
[0019]實施例3:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環 DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產物40 μ L經過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環DNA及引物DNA0取回收所得產物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0020]將lyg/mL AFP抗原固定96孔板表面，4° C環境下過夜后PBST洗滌三次，加入50 μ L 100 μ g/mL生物素標記的AFP抗體37° C孵育Ih后，洗滌并加入50 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，PBST洗滌后，加入10yL TMB溶液(四甲基聯苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
[0021]實施例4:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環 DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產物40 μ L經過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環DNA及引物DNA0取回收所得產物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5 ’ -CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0022]將20 μ L 100 μ g/mL AFP抗體加入到20 μ L lmg/mL的醛基化磁珠中37° C孵育lh, PBST洗滌三次后，加入1yL I μ g/mL AFP抗原，37° C反應lh，洗滌后加入生物素化的AFP抗體，連接后洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，洗滌后，力口入10uL TMB溶液(四甲基聯苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
[0023]實施例5:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環 DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產物40 μ L經過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環DNA及引物DNA0取回收所得產物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0024]將20 μ L lmg/mL AFP抗體加入到ImL 3nM的納米金中37° C孵育lh，離心洗滌三次后，加入1yL I μ g/mL AFP抗原，37° C反應lh，洗滌后加入20 μ L lmg/mL生物素化的AFP抗體，連接后離心洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，洗滌后，加入10uL TMB溶液(四甲基聯苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
[0025]實施例6:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環 DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產物40 μ L經過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環DNA及引物DNA0取回收所得產物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記 5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0026]將20 μ L lmg/mL CEA抗體加入到ImL 3nM的納米金中37° C孵育lh，離心洗滌三次后，加入1yL I μ g/mL CEA抗原，37° C反應lh，洗滌后加入20 μ L lmg/mL生物素化的CEA抗體，連接后離心洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，洗滌后，加入10uL TMB溶液(四甲基聯苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
【權利要求】
1.一種利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，將生物素分子通過折紙的過程嵌入到DNA納米結構上，所制備的產物為含有多生物素活性位點的DNA納米結構，此結構可作為信號放大探針應用于生物檢測領域中，從而實現抗原、抗體、蛋白質、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測。
2.根據權利要求1所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述的DNA納米結構由DNA通過自組裝、延伸、折疊等技術構成的一類納米結構，組成此結構的單鏈DNA，可經過如巰基、或生物素、或氨基修飾。
3.根據權利要求1所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，包括以下幾個步驟: (1)長鏈DNA溶液中，加入訂書釘鏈DNA，混合均勻后由高溫緩慢降至室溫； (2)向(I)步驟所得產物中，加入連接分子，混合均勻后水浴中連接； (3)構建基于特定生物分子的檢測系統； (4)將(2)步驟所得產物應用到(3)步驟中的檢測系統中；或通過納米載體應用到(3)步驟中的檢測系統中。
4.根據權利要求3所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述長鏈DNA為合成的長鏈DNA、或噬菌體M13、或經過滾環擴增技術所得的長單鏈DNA ;所述訂書釘鏈DNA，為多條能與長鏈DNA互補雜交的單鏈DNA，其中一條或多條為生物素修飾。
5.根據權利要求3所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，步驟(I)所述高溫為95°C，室溫為25°C，降溫時間為12小時以上。
6.根據權利要求3所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述連接分子為親和素、或鏈霉親和素、或鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶。
7.根據權利要求3所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述與連接分子作用條件為25?37°C，水浴30分鐘以上。
8.根據權利要求3所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述特定生物分子為蛋白、抗原、腫瘤標志物、一段DNA，或RNA序列、多肽或腫瘤細胞。
9.根據權利要求3所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述檢測系統為蛋白質微陣列芯片、或基因芯片、或微流控蛋白質芯片、或酶聯免疫吸附試驗，方式為三明治法、或間接法、或競爭法。
10.根據權利要求3所述根據權利要求3所述利用DNA納米折紙結構作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述納米載體為納米金、或納米銀、或磁性納米粒子。
【文檔編號】C12Q1/68GK104133053SQ201410229096
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】何丹農, 顏娟, 宋世平, 樊春海 申請人:上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司