一株梨樹枝條降解真菌及其菌劑的制作方法
【專利摘要】本發明屬于農業廢棄物資源利用技術，公開了一株能分解梨樹修剪枝條的降解真菌及其菌劑，該菌株D10屬于撕裂蠟孔菌(Ceriporia?lacerata)，2013年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC?NO.7852。該菌株可在以梨樹枝條為唯一碳源的培養基上生長。在21d的液態發酵過程中，菌株D10的漆酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶的酶活力最高值分別為11.03，36.71和152.75U·mL-1。本發明是利用微生物發酵的方法降解農業廢棄梨樹修剪枝條，使其轉化為有機肥料，可以變廢為寶、保護環境，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一株梨樹枝條降解真菌及其菌劑
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業集約化生產技術，涉及一株梨樹枝條降解真菌及其菌劑，專用于降解廢棄梨樹枝條生產有機肥料，實現有機廢棄物資源化利用。
【背景技術】
[0002]修剪是一項梨樹栽培和管理的重要技術措施，適量的修剪對果樹的生長和果實的產量品質都有積極的影響。處于盛果期的梨園，修剪枝條量一般在1500-2250kg.1ιπm2。農業部市場與經濟信息司統計的數據表明，2011年我國梨樹的栽培面積為110萬多公頃，據這個數字推算，我國梨園每年枝條的修剪數量可達161-242萬噸。枝條中含有豐富的纖維素、木質素、蛋白質、糖類和脂肪等有機物，以及各種大中微量無機養分，是寶貴的農業資源，因此，梨樹枝條資源的開發和利用有著非常廣闊的前景。然而，梨樹枝條中含有大量的木質素和纖維素，因此不易腐爛，不能就地進行還田處理。除了部分枝條應用于食用菌的栽培以外，絕大部分梨樹枝條都被隨意堆放在路邊或就地焚燒，焚燒會造成嚴重的大氣污染，堆放會誘發田間的病蟲害，同時也造成了寶貴資源的浪費。
[0003]研究表明，修剪枝條等園林廢棄物，作為堆肥物料的調理劑，對堆肥物料的含水率、孔隙度和碳氮比等有良好的調節作用。隨著果樹修剪枝條資源規模的不斷擴大和再利用難度的困擾，將果樹修剪枝條作為主要堆肥材料進行堆肥技術化的研究逐步增加。通過聯合堆肥化實驗的結果顯示，枝條堆肥養分豐富全面，病菌數量達到無害化，是一種成熟穩定和富含營養的優質 有機肥和土壤改良劑。可見將梨樹枝條進行固體有機廢棄物資源化(堆肥)是解決梨樹枝條再利用問題的簡單有效途徑。
[0004]然而在堆肥過程中，纖維素、半纖維素和木質素等大分子的分解是限制堆肥腐熟的主要因素，白腐真菌是目前報道對木質素降解效果最強的一類真菌。在堆肥中接種木質素降解真菌，可以利用真菌菌絲對木材的機械穿透作用和降解真菌分泌的降解酶類，加快堆肥底物中木質素的分解，從而縮短堆肥腐熟的周期。若能篩選到相應的高效降解功能菌株，并將其用于梨樹修剪枝條堆肥生產，具有良好的應用前景和實用價值。
【發明內容】
[0005]1.技術問題
[0006]本發明的目的在于篩選一種能夠高效分解梨樹枝條木質素的真菌，通過其對木質素的高效降解效果，達到加速梨樹枝條堆肥腐熟的目的，從而使梨樹修剪枝條能夠通過堆肥化得以大規模的資源化再利用，確保可持續農業的順利發展。
[0007]2.技術方案
[0008]—株能降解梨樹枝條的真菌D10,該菌株屬于撕裂臘孔菌(Ceriporia Iacerata),2013年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，菌種保藏號為CGMCC N0.7852。其生物學特性為，在PDA平板上，10天后長滿平板，菌落呈白色絨毛狀，菌絲生長蓬松，速度慢，多為氣生菌絲，菌絲在顯微鏡下觀察無隔，有旱螺旋狀扭結。菌絲直徑4.1-5.5 μ m。
[0009]梨樹枝條降解真菌DlO在PDA-愈創木酚培養基上產生紅棕色氧化圈；在PDA-苯胺藍培養基上產生褪色圈。PDA-愈創木酚培養基為:PDA培養基中加入Ig.L-1愈創木酚。PDA-苯胺藍培養基為:PDA培養基中加入0.1g.L-1苯胺藍。PDA培養基為:土豆200.0g,蔗糖 20.0g，瓊脂 18.00g,水 1000mL.
[0010]本發明所述的用于降解梨樹枝條的真菌在梨樹修剪枝條降解方面的應用。
[0011]一種含有所述的梨樹枝條降解真菌DlO的真菌菌劑，其制備方法為:將上述菌株DlO接種至梨樹枝條粉末培養基上，25~35°C條件下靜止培養6~8天，加無菌水震蕩，過濾培養物后得到孢子懸液菌劑，調節孢子懸液菌劑中孢子數不少于IO4個/mL得到真菌菌劑；
[0012]所述的梨樹枝條粉末培養基的配制方法為:梨樹枝條粉末中添加等質量的無機營養液，至濕潤狀態，在121°C高壓滅菌20min。
[0013]所述的無機營養液為:NH4C12.0g, MgSO4.7Η200.5g，KH2PO4L 0g, Na2HPO40.2g，MnSO40.0035g, CuSO4.5H200.007g, FeSO4.7H200.007g, ZnSO40.002g, CoCl2,0.003g,水1000mL, pH 自然。
[0014]所述的梨樹枝條粉末的制備方法:梨樹枝條烘干至恒重，粉碎過20目篩。
[0015]上述含有梨樹枝條降解真菌DlO的真菌菌劑在降解梨樹枝條方面的應用。
[0016]3.有益效果
[0017]菌株DlO通過以梨樹枝條為唯一碳源的液態和固態培養基富集，可以在愈創木酚選擇培養基上生長良好且得以分離純化。在PDA-愈創木酚培養基上產生紅棕色氧化圈；在PDA-苯胺藍平板上產生褪色圈。試驗表明，30°C條件下，固態降解30天，接種真菌DlO的培養基失重率可到達26%。經過21天的液體發酵，測定粗酶液中漆酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶活力。期間菌株DlO的漆酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶活力最高值分別為:11.03,36.71 和 152.75U.mL'
[0018]本發明是利用微生物發酵的方法降解農業廢棄物梨樹修剪枝條，促進梨樹枝條堆肥的腐熟進程，為梨樹枝條堆肥化的推廣利用提供技術支持。達到變廢為寶、保護環境，促進農業可持續發展的目的，具有廣闊的應用前景。
[0019]附圖表說明
[0020]圖1為本發明菌株DlO的PDA-愈創木酚平板第10天顯色反應圖。
[0021]圖2為本發明菌株DlO的PDA-苯胺藍平板第8天退色反應圖。
[0022]圖3為本發明菌株DlO基于rDNA-1TS序列相似性的系統發育樹。
[0023]圖4為本發明菌株DlO的漆酶的活性。
[0024]圖5為本發明菌株DlO的木質素過氧化物酶的活性。
[0025]圖6為本發明菌株DlO的錳過氧化物酶的活性。
[0026]生物材料保藏信息
[0027] D10,分類命名為Ceriporia Iacerata,于2013年7月8日保藏于位于的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.7852。
【具體實施方式】[0028]實施例1梨樹枝條降解真菌DlO篩選及鑒定
[0029]I)梨樹枝條降解真菌的篩選:降解菌樣品采自河北辛集常年堆置的梨樹腐爛枝條。分別通過30天以梨樹枝條為唯一碳源的固態富集培養基富集(固態富集培養基為:烘干粉碎后過20目篩的梨樹枝條粉末20g，均勻添加超純水20g)，挑選生長良好且快速的菌落，接種到新的固態富集培養基上繼續培養第二代，獲得對梨樹枝條有高效降解效果的菌株。將在固態富集培養基上生長良好的菌落分別接種到愈創木酚選擇培養基(愈創木酚選擇培養基為:愈創木酚 lg，KN032g, MgSO40.5g，KH2PO4Ig, NaCl lg，Na2HPO4Ig,瓊脂 20g，水1000mL)上，挑選生長較快尤其是可以產生紅棕色氧化圈的菌株進行分離純化，最終得到能高效降解梨樹枝條的真菌DlO。
[0030]2)梨樹枝條降解真菌的鑒定:真菌DlO生物學特性:在PDA平板上，10天后長滿平板，菌落呈白色絨毛狀，菌絲生長蓬松，速度慢，多為氣生菌絲，菌絲在顯微鏡下觀察無隔，有旱螺旋狀扭結。菌絲直徑4.1-5.5 μ m。
[0031]真菌DlO接種到PDA-愈創木酚平板和PDA-苯胺藍平板，觀察其顯色圈和退色圈產生的時間和大小(見表1)，在PDA-愈創木酚平板上產生紅棕色氧化圈(見圖1)，在PDA-苯胺藍平板上產生褪色圈(見圖2)。PDA-愈創木酚培養基為:PDA培養基中加入Ig.L-1愈創木酚。PDA-苯胺藍培養基為:PDA培養基中加入0.1g.L-1苯胺藍。PDA培養基為:土豆 200.0g，蔗糖 20.0g，瓊脂 18.00g, 7jC 1000mL0
[0032]表1菌株的平板顯色反應和退色反應結果
[0033]
【權利要求】
1.一株梨樹枝條降解真菌DlO,該菌株屬于撕裂臘孔菌(Ceriporia Iacerata), 2013年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCN0.7852。
2.權利要求1所述的梨樹枝條降解真菌DlO在降解梨樹枝條方面的應用。
3.一種含有權利要求1所述的梨樹枝條降解真菌DlO的真菌菌劑。
4.權利要求3所述的真菌菌劑的制備方法，包括:將權利要求1所述的菌株DlO接種至梨樹枝條粉末培養基上，25~35°C條件下靜止培養6~8天，加無菌水震蕩，過濾培養物后得到孢子懸液菌劑，調節孢子懸液菌劑中孢子數不少于IO4個/mL得到真菌菌劑； 所述的梨樹枝條粉末培養基的配制方法為:梨樹枝條粉末中添加等質量的無機營養液，至濕潤狀態，在121°C高壓滅菌20min ； 所述的無機營養液為=NH4Cl2.0g, MgSO4.7Η200.5g，KH2PO4L 0g, Na2HPO40.2g，MnSO40.0035g, CuSO4.5Η200.007g, FeSO4.7Η200.007g, ZnSO40.002g, CoCl2,0.003g,水1000mL, pH 自然。
5.根據權利要求4所述的真菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的梨樹枝條粉末為經烘干至恒重、粉碎后過20目篩的梨樹枝條粉末。
6.權利要求3所述的含有梨樹枝條降解真菌DlO的真菌菌劑在降解梨樹枝條方面的應 用。
【文檔編號】C12N1/14GK103992957SQ201410228275
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】徐陽春, 張乃文, 韋中, 沈其榮 申請人:南京農業大學