用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群及其應用方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群，病原體包括人巨細胞病毒、腺病毒等14種呼吸道傳染性疾病的病原體，所述的引物群包括上述14種病原體的引物中的任意1組或者2組以上的引物；本發明還提供與引物群中的引物一一對應配對的探針組成的探針群；并提供將上述引物群和探針群用于液態芯片快速檢測方法中的應用方法。此應用方法可檢測1種或者同時檢測多種急性呼吸道傳染性疾病病原體，且，靈敏度高、特異性好。
【專利說明】用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群及其應用方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及疾病檢測領域，尤其是一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群及其應用方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]急性呼吸道傳染性疾病一旦爆發，便以極迅速的方式進行傳播，因此，防治急性呼吸道傳染性疾病的關鍵在于早期診斷、早期隔離、早期治療。
[0003]現有的急性呼吸道傳染性疾病的檢測方法主要有:(I)病原體分離培養法:此法不僅操作過程繁瑣，靈敏度低，時間長，且技術上難度高，普通醫務場所難以開展；(2)免疫檢測法:該方法為回顧性方法，患者需感染產生抗體后方可得以檢測，無法適應快速檢測的需求，且由于抗體交叉反應易出現假陽性；(3)病原體為病毒時，對于病毒種類的檢測，需將病毒接種到活的真核細胞中，對病毒進行細胞培養、病毒繁殖，選擇的最佳細胞株，并根據該細胞株是否存在細胞病變效應(CPE)或者是否有早期抗原，進行病毒種類的鑒定，但是，費時費力；(4)近年來發展的聚合酶鏈反應(PCR)，可實現快速檢測病原體的目的，但是，此法只可對單一病原進行檢測，且非特異性結合以及假陰性、假陽性問題較明顯。
[0004]2001年美國Luminex公司開發了一種液態芯片(liquid chip),創新性地將細胞大小的微球作為探針的載體，為生物分子相互作用提供一種能夠充分反應的液相環境，同時將激光檢測、高速數字信號處理器應用到該技術中，這種基于微球的芯片技術能夠對單孔內多達100種不同的反應同時進行檢測，與固相芯片或片膜芯片相比，具有多重、快速、靈敏度高(可達0.01pg)、重復性好(CV〈5%)以及檢測動態范圍寬(可達0.2-32000pg/ml)等優點，實現了多指標同步分析的功能。該技術已用于腫瘤標志物、過敏原篩查、自身免疫病、細胞因子等方面的研究，并已為美國FDA批準用于臨床進行自身免疫病、人類白細胞抗原分型的診斷。但是，該技術尚未在臨床檢測病毒、細菌等方面進行應用。
【發明內容】
[0005]本發明旨在提供一種可用于檢測I種或多種病原體的檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群及其應用方法和試劑盒，且，此應用方法可同時進行多種病原體的檢測，且，靈敏度高、特異性好。
[0006]一種用于檢測急性呼吸 道傳染性疾病的引物群，由14組引物中的任意I組或者2組以上的引物組成，所述的14組引物的核苷酸序列分別為:
①人巨細胞病毒(簡稱=HCMV)
HCMV-F:biotin (生物素)- AAGTTTGTGCCCCAACGGTA、
HCMV-R:biotin - GCGTGCTTTTTAGCCTCTGC ；
②腺病毒(簡稱:AD)
AD-F:biotin - CGCAGTGGTCTTACATGCACA、AD-R:biotin - ACGCCGCGGATGTCAAAGT ；
③副流感病毒I型(簡稱:PIV1)
PIVl-F:biotin -CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG、
PIVl-R:biotin - CCGGTAATTTCTCATACCTATG ；
④副流感病毒2型(簡稱:PIV2)
PIV2-F:biotin - ATGGAATCAATCGCAAAAGC、
PIV2-R:biotin - GATGATAGATCCCGCTTCCA ；
⑤副流感病毒3型(簡稱:PIV3)
PIV3-F:biotin - CTCGAGGTTGTCAGGATATAG、
PIV3-R:biotin - CTTTGGGAGTTGAACACAGTT ；
⑥呼吸道合胞病毒(簡稱:RSV)
RSV -F:biotin - CAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC、
RSV -R:bioti n - TTCTGCTGTCAAGTCTAGTACACTGTAGT ；
⑦金黃色葡萄球菌(簡稱:SA)
SA-F:biotin -ATGGAAGTTCGTGACTTATTAAGC、
SA-R:biotin - AACAGTTGTTTTAGATGTGTCATGT ；
⑧肺炎鏈球菌(簡稱:SP)
SP-F:biotin - GTGATATTTCTGTAACAGCTACC、
SP-R:biotin - GAGAATTCCCTGTCTTTTCAAA ；
⑨肺炎支原體(簡稱:MP)
MP-F:biotin - TGCCATCTACCCGCGCTTA、
MP-R:biotin - GTGATCTGCCCGGTTTGGTC ；
⑩肺炎衣原體(簡稱:CP)
CP-F:biotin - AGTTGAGCATATTCGTGAGG、
CP-R:biotin - TTTATTTCCGTGTCGTCCAG ；
(11)肺炎克雷伯菌(簡稱:KP)
KP-F:biotin - CTGGATCTGACCCTGCAGTA、
KP-R:biotin - CCGTCGCCGTTCTGTTTC ；
(12)鮑曼不動桿菌(簡稱:AB)
AB-F:biotin - TCGTGCTTCGACCGAGTAT、
AB-R:biotin - AACCAACACGCTTCACTTCC ；
(13)銅綠假單胞菌(簡稱:PA)
PA-F:biotin - GGCGTGGGTGTGGAAGTC、
PA-R:biotin - GTGGCGATCTTGAACTTCTT ；
(M)嗜麥芽窄食單胞菌(簡稱:SM) '
SM-F:biotin - CAGCCTGCGAAAAGTA、
SM-R:biotin - TTAAGCTTGCCACGAACAG。
[0007]上述的 HCMV-F、AD-F, PIVl-F, PIV2-F、PIV3-F、RSV - F、SA-F, SP-F, MP-F, CP-F,KP-F、AB-F、PA-F、SM-F中的“_F”均指相應病原體的上游引物，而HCMV-R、AD- R、PIV1_ R、PIV2- R、PIV3- R、RSV - R、SA- R、SP- R、MP_ R、CP- R、KP_ R、AB_ R、PA_ R、SM- R 中的“_R”指的是相應病原體的下游引物。本發明對病原體的保守序列的選擇非常關鍵，本 申請人:經過了無數次的試驗，選擇了病原體的最佳保守序列，并對各個保守序列的引物進行篩選，獲得了適用于液體芯片法檢測急性呼吸道疾病的病原體特異性引物。
[0008]與上述引物群配合使用的探針群，此探針群中的探針與引物群中的引物按照序號一一對應配合，探針群的核苷酸序列為:
【權利要求】
1.一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群，由14組引物中的任意I組或者2組以上的引物組成，所述的14組引物的核苷酸序列分別為:
2.與權利要求1所述的一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群配合使用的探針群，其特征在于:所述的探針群的探針與權利要求1中的引物按照序號一一配合使用，探針的核苷酸序列為:
3.一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物、探針的應用方法，其應用步驟為: (O以權利要求1所述的引物群中的引物作為擴增引物、待測樣品的DNA作為DNA模板，進行PCR擴增，獲得擴增產物； (2)以權利要求2所述的探針群中的每一種探針分別與不同顏色標記的微球進行偶聯，形成探針-微球偶聯體，不同探針所對應的探針-微球偶連體的顏色各不相同，將所有的探針-微球偶連體混合，制成探針-微球偶聯體混合液； (3)將擴增產物、探針-微球偶聯體混合液、Tris-Cl緩沖液(簡稱:TE)、藻紅蛋白(簡稱:SA-PE)混合，進行雜交，獲得雜交產物，采用液態懸浮芯片系統檢測雜交產物的熒光值； (4)結果判定:產生某種病原菌相應顏色的微球， 熒光值≥200時，為陽性； 熒光值< 150為陰性； 熒光值在150~200之間時，樣品需重復試驗，若熒光值> 150的樣品判定為陽性，若熒光值< 150的樣品判定為為陰性。
4.根據權利要求3所述的一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群的應用方法，其特征在于:步驟(1)采用多組PCR擴增體系，每組PCR擴增體系中含有f 6組引物。
5.根據權利要求4所述的一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群的應用方法，其特征在于，步驟(1):將權利要求1所述的引物群中的金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、肺炎支原體、肺炎衣原體所對應的引物作為擴增引物、以待測樣品的DNA作為DNA模板，進行PCR擴增體系A，收集擴增產物A，同時，將權利要求1所述的引物群中的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒2型、巨細胞病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒3型所對應的引物作為擴增引物、以待測樣品的DNA作為DNA模板，進行PCR擴增體系B，收集擴增產物B ;步驟(3)為將擴增產物A、擴增產物B、探針-微球偶聯體混合液、Tris-Cl緩沖液(簡稱:TE)、藻紅蛋白(簡稱:SA-PE)混合，進行雜交，獲得雜交產物，采用液態懸浮芯片系統檢測雜交產物的熒光值；其他步驟不變。
6.根據權利要求5所述的一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群的應用方法，其特征在于:步驟(1)采用PCR擴增體系A、B、C三組PCR擴增體系，PCR擴增體系A優選為:
7.根據權利要求3所述的一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群、探針群的應用方法，其特征在于:本發明的步驟(3)中的雜交過程中，雜交體系為: 試劑體積終濃度 擴增產物AI μ I/ 擴增產物BI μ I/ 擴增產物CI μ I/ 探針-微球偶聯體混合液1.4 μ I 1.25 X 107beads/ml 四甲基氯化銨20.6μ1 1.5X
SA-PE0.3 μ Ilmg/mL
TE74.7 μ I1.0Χ ； 雜交體系的反應條件為:將擴增產物、探針-微球偶聯體混合液、Tris-Cl緩沖液混合；95°C變性5min ;雜交，雜交溫度為46°C~50°C，雜交時間為30_60min ;然后，加入藻紅蛋白，46 °C反應15min，獲得雜交產物。
8.一種用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的試劑盒，所述的試劑盒包括試劑組份1~4，其中，試劑組份I為權利要求1所述的用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群；試劑組份2為根據權利要求3所述的用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群和探針群的應用方法所制得的探針-微球偶聯體混合液；試劑組份3為權利要求6所述的用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群和探針群的應用方法中的dNTP、Bestar Taq Buffer、Bestar Taq DNAPolymerase和雙蒸水；試劑組份4為權利要求7所述的用于檢測急性呼吸道傳染性疾病的引物群和探針群的應用 方法中的四甲基氯化銨、報告混合液藻紅蛋白和去核酸水。
【文檔編號】C12Q1/70GK103993104SQ201410226772
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】陳愉生, 沈曉娜, 伍嚴安, 王毅 申請人:福建省立醫院, 福建省疾病預防控制中心, 上海透景生命科技有限公司