長鏈非編碼rna rmst的應用方法
【專利摘要】本發明公開了一種長鏈非編碼RNA(long?no-coding?RNA，LncRNA)RMST的應用方法，即用于制備膠質瘤患者的預后制劑，特別是制備出實時熒光定量分析法預測膠質瘤患者預后的試劑盒。通過研究證實LncRNA?RMST在膠質瘤組織中表達上調，高表達LncRNA?RMST的膠質瘤患者比低表達LncRNA?RMST的膠質瘤患者預后差，因此，將Lnc?RNA?RMST的表達用于膠質瘤患者的預后預測，可以為膠質瘤患者的預后提供強有力的分子生物學依據，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【專利說明】長鏈非編碼RNA RMST的應用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及LncRNA RMST在制備膠質瘤患者預后試劑中的應用方法。
【背景技術】
[0002]膠質瘤起源于外胚層，約占神經系統腫瘤的40.49%，是最常見的腫瘤之一，可以在任何年齡的人群中發病，具有很強的增殖能力和血管生成能力，很容易在顱內發生侵襲和轉移。雖然其發病率僅占成人腫瘤的2%，但病死率卻占所有腫瘤相關死亡的10%。盡管一些治療方法包括手術治療、放療及化療有很大進展，但是膠質瘤患者特別是惡性膠質瘤的預后仍然很差。目前，對膠質瘤的預后判定沒有參考標準，也沒有特異性的指標，遠遠不能適應對人膠質瘤進行預后判定的需求。因此，對人膠質瘤進行預后判定，以便選擇最佳治療方案，顯著提高患者生存率，成為神經外科領域亟待解決的重要課題。
[0003]IncRNA是一類轉錄本長度大于200bp的非編碼RNA，具有相對較長的核苷酸鏈，其分子內部具有特定的二級空間結構，能提供與蛋白質結合的多個位點，或與DNA、RNA之間通過堿基互補配對原則發生特異性、動態性相互作用。研究表明，IncRNA可作為人類基因組中一類非常重要的表觀遺傳調控因子，通過表觀遺傳、轉錄調控以及轉錄后調控等多種機制調控DNA甲基化、 組蛋白修飾或染色質重構使基因沉默或激活。近年來，IncRNA作為一類重要的調控分子及其在臨床診斷、化療敏感性和預后評價等方面的應用價值，已經逐漸得到研究者的重視。有研究表明HOTAIR在原發乳腺腫瘤和轉移瘤中的表達都會增加，原發腫瘤中HOTAIR的表達水平可以用來有效預測癌轉移和死亡。IncRNA PCA3在前列腺癌中高度過表達，這種IncRNA是在尿液中發現的，相當便于臨床檢測。IncRNA-LALRl通過激活fct/i3-catenin信號，加速了細胞周期進程，促進了肝細胞增殖。采用藥物靶干預IncRNA-LALRl誘導肝臟再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治療。由此可見，IncRNA作為診斷、預后和治療的分子標志物具有巨大潛力。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種LncRNA RMST的應用方法，即LncRNA RMST(rhabdomyosarcoma2associated transcript)定位于染色體 12q23.1, GeneBank 登錄號:NR-024037能作為膠質瘤預后的判斷標準，用于制備膠質瘤患者的預后制劑，更進一步能夠提供一種性價比高，易于推廣應用的膠質瘤預后預測試劑盒。
[0005]長鏈非編碼RNA RMST的應用方法，所述的長鏈非編碼RNA RMST用于制備膠質瘤患者的預后制劑，該長鏈非編碼RNA RMST的序列見SEQ NO:1。用于制備膠質瘤患者的預后制劑具體包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
[0006]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物:
[0007]LncRNA RMST 正向引物:5' -AACTCCGTGTCCCTTGTG-3'，
[0008]LncRNA RMST 反向引物:5' -GGCAGTGGGTGACTGATC-3'。[0009]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒，
[0010]該試劑盒包括:(I)從膠質瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA RMST逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及LncRNA RMST所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNA RMST實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；
[0011]LncRNA RMST實時熒光定量PCR特異性引物:
[0012]正向引物5' -AACTCCGTGTCCCTTGTG-3'，
[0013]反向引物5' -GGCAGTGGGTGACTGATC-3'，
[0014]U6snRNA內參特異性PCR引物:
[0015]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0016]反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0017]在前期研究工作中， 申請人:通過DIANA-LncBase軟件分析與miR-101競爭性結合MRE序列的LncRNA時，發現了 LncRNA RMST。 申請人:在膠質瘤組織中提取RNA，逆轉錄后進行實時熒光定量PCR分析 LncRNA RMST的表達，發現:LncRNA RMST在膠質瘤中表達上調，與正常人腦組織中的表達差異顯著。且LncRNA RMST表達水平不同的膠質瘤患者中預后存在明顯差異，經Kaplan-Meier生存分析發現LncRNA RMST高表達的膠質瘤患者生存率明顯低于低表達的患者；多因素Cox比例風險模型的預后分析發現LncRNA RMST的相對危險度>1，表明LncRNA RMST高表達的患者預后較低表達的患者預后差，所以LncRNA RMST的高表達是膠質瘤患者預后風險預測的獨立危險因素。據此， 申請人:提出利用LncRNA RMST制備用于膠質瘤患者預后的制劑。
[0018]將LncRNA RMST用于膠質瘤患者預后的檢測方法:(I)收集待測個體術后切除的膠質瘤組織，抽提總RNA ； (2)以總RNA為模板將RMST逆轉錄為cDNA ； (3)用RMST特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增，獲得相對表達量2Δ Δετ，當2Δ Δετ>1.87時提示RMST為高表達。
[0019]利用本發明的檢測制劑可以檢測LncRNA RMST在膠質瘤患者中的表達水平，為膠質瘤患者預后預測提供了強有力的分子生物學基礎，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為實時熒光定量PCR分析LncRNA RMST在膠質瘤組織與正常腦組織中的表達
差異;
[0021]圖2為LncRNA RMST與37例膠質瘤患者預后的關系。
【具體實施方式】
[0022]以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0023]在前期研究工作中， 申請人:通過DIANA-LncBase軟件分析與miR-101競爭性結合MRE序列的LncRNA時，發現了 LncRNA RMST。 申請人:在膠質瘤組織中提取RNA，逆轉錄后進行實時熒光定量PCR分析LncRNA RMST的表達，發現:LncRNA RMST在膠質瘤組織中表達上調，與正常人腦組織中的表達差異顯著(P = 0.0282)(圖1)。且LncRNA RMST表達水平不同的膠質瘤患者中預后存在明顯差異，經Kaplan-Meier生存分析發現LncRNA RMST高表達的膠質瘤患者生存率明顯低于低表達的患者(P = 0.0035)(圖2)，多因素Cox比例風險模型的預后分析發現LncRNA RMST的相對危險度>1 (RR = 1.177)，表明LncRNA RMST高表達的患者預后較低表達的患者預后差，LncRNA RMST的高表達是膠質瘤患者預后風險預測的獨立危險因素。
[0024]實施例1制備LncRNA RMST用于膠質瘤患者預后的試劑盒(50次反應)
[0025]1.RNA 穩定溶液 50ml
[0026]2.異丙醇 100mL
[0027]3.三氯甲烷 100mL
[0028]4.Trizol 50ml
[0029]5.無酶水 IOml
[0030]6.1 μ M隨機逆轉錄引物50ul
[0031]7.5 X逆轉錄緩沖液200ml
[0032]8.1OmM三磷酸堿基脫氧核苷酸IOOul
[0033]9.40U/ μ I RNA 酶抑制劑 500ul
[0034]10.200U/ μ I MMLV 逆轉錄酶 50ul
[0035]11.Premix Ex Taq 50ul
[0036]12.10 μ M Lnc RNA RMST 特異性引物 30ul
[0037]正向引物5' -AACTCCGTGTCCCTTGTG-3'
[0038]反向引物5' -GGCAGTGGGTGACTGATC-3'
[0039]13.10 μ M U6SnRNA 特異性引物 3Oul
[0040]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'
[0041]反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0042]實施例2膠質瘤組織中Lnc RNA RMST的檢測
[0043]1、膠質瘤組織的保存:收集待測膠質瘤組織存放于盛有RNA穩定溶液的凍存管中，放至-80 0C冰箱備用。
[0044]2、組織中RNA的抽提:取適量標本于經180°C烘烤6_8h后的研缽中加入液氮研磨標本，研磨至粉末狀后于研缽中加入1ml Trizol研缽標本,研磨成液體狀后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預冷的異丙醇0.5ml/mlTrizol混勻,_20°C冰箱靜置20min，4°C 12000g離心10min ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l_2ml混勻，40C 7500g離心5min，盡量棄上清，室溫干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度計測RNA的濃度及質量，0D260/280比值在1.8-2.0之間，_80°C保存。
[0045]3、LncRNA RMST逆轉錄:使用Thermo公司的逆轉錄試劑盒。20 μ L逆轉錄反應的 體系如下:
[0046]
【權利要求】
1.長鏈非編碼RNARMST的應用方法，其特征在于，所述的長鏈非編碼RNA RMST用于制備膠質瘤患者的預后制劑，該長鏈非編碼RNA RMST的序列見SEQ NO:1。
2.根據權利要求1所述的長鏈非編碼RNARMST的應用方法，其特征在于，所述的用于制備膠質瘤患者的預后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
3.根據權利要求2所述的長鏈非編碼RNARMST的應用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物: LncRNA RMST 正向引物:5' -AACTCCGTGTCCCTTGTG-3'， LncRNA RMST 反向引物:5' -GGCAGTGGGTGACTGATC-3'。
4.根據權利要求3所述的長鏈非編碼RNARMST的應用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒， 該試劑盒包括:(I)從膠質瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA RMST逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及LncRNARMST所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNA RMST實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水； LncRNA RMST實時熒光定量PCR特異性引物: 正向引物 5' -AACTCCGTGTCCCTTGTG-3'，
反向引物 5' -GGCAGTGGGTGACTGATC-3'， U6snRNA內參特異性PCR引物: 正向引物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966338SQ201410225047
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月26日 優先權日:2014年5月26日
【發明者】武明花, 劉長紅, 余志斌, 徐剛, 李桂源 申請人:中南大學