一株乳酸乳桿菌及其在發酵產抑菌多肽中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株乳酸乳桿菌及其在發酵產抑菌多肽中的應用，乳酸乳桿菌（Lactobacillus?lactis）LB-Y301，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCCNO：M2014143。所述的乳酸乳桿菌LB-Y301在發酵生產抑菌多肽中的應用。本發明采用了低能N+注入技術，利用篩選平板進行初篩，得到的菌株進行發酵復篩，逐漸提高抑菌多肽的產量，最終獲取產量提高了50%的乳酸乳桿菌LB-Y301，該菌株可以大大提高抑菌的效果，在500L發酵罐中，抑菌多肽較出發菌提高了54%,極大地提高了其應用及市場價值。
【專利說明】一株乳酸乳桿菌及其在發酵產抑菌多肽中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物發酵【技術領域】，具體涉及一株乳酸乳桿菌及其在發酵產抑菌多肽中的應用。
【背景技術】
[0002]由于各種微生物的性質及代謝方式不同，而分為有益微生物與有害微生物，有害的微生物對有機物質發生氧化作用，造成食品變質、發霉、器具腐爛、中毒現象，這一過程，是病原微生物和腐敗菌活化生長的結果；而微生物活菌劑是有益的有效的微生物群，能合成抗氧化物質，能抑制和殺死病原微生物和腐敗菌。就人體來說它可以消除氧自由基(游離基)，杜絕病源，延緩細胞衰老，激活T細胞，分解亞硝基化合物及其他有機致癌物質，抑制病菌、病毒及癌細胞生長，調節人體血脂水平。活性益生菌片就人體來說，它具有類似SOD酵素的作用，可以消除氧自由基(游離基)，杜絕病源，延緩細胞衰老，激活T細胞，分解亞硝基化合物及其他有機致癌物質，通過益菌抑菌的原理來抑制病菌、病毒及癌細胞生長，調節人體血脂水平，減少血管壁脂肪沉積，從而恢復自然自愈力，增強和提高免疫功能，使人體各種疾病奇跡般地好轉或康復。同時“活性益生菌”中微生物的分泌物如氨基酸、活性抗菌小肽、有機酸、寡聚多糖類、各種維生素、抗生物質和抗病毒物質，各種生化酶和氧(活性氧還原成分子氧)等，既可直接調正各器官功能，又可增加營養，從而改善體內微生態平衡。“活性益生菌”不僅是 各種疾病生存的克星，也是各種污染的克星。試想，如果家家戶戶都能用“活性益生菌”自我保健，不僅人人健康，無數微生物也將會通過家里的下水道進入江河湖泊，那將是一場多么壯觀的“清洗地球”的景象！快給我們的腸道多一些活性益生菌吧！快給我們的地球增加一些健康吧！
有益菌群五大科目:
1、光合菌群:光合菌群(好氧性和厭氧性)屬于獨立營養微生物，它能利用土壤接受的太陽熱能或以紫外線為能源，將土壤中的硫化氫和碳氫化合物中的氫分離出來，變有害物質為無害物質，并以植物根部的分泌物、有機物、有害氣體(硫化氫等)及二氧化碳、氮等為基質，合成糖類、氨基酸、維生素類、氮素化合物和生理活性物質等，是肥沃土壤和促進動植物生長的主力部隊。光合菌的代謝物質或者被植物直接吸收，或者成為其它微生物繁殖的養分，光合細菌如果能夠增殖，其它的有益微生物也會增殖。
[0003]2、乳酸菌群:乳酸菌(厭氧型)，它以攝取光合細菌酵母菌產生的糖類等物質為基礎，產生乳酸。乳酸具有很強的殺菌能力，能有效抑制有害微生物的活動，以及有機物的急劇腐敗分解。乳酸菌能夠使常態下不易分解的木質素和纖維素等變得容易分解，并且消除未分解有機物產生的種種弊端，在有機物發酵分解上發揮突擊隊的重要作用，它將未腐熟的有機物質轉化成對動植物有效的養分。乳酸菌還能有效抑制連作障礙產生的致病菌增殖。
[0004]3、酵母菌群:酵母菌(好氧型)利用氨基酸、糖類及其它有機物質，通過發酵，產生出促進細胞分裂的活性化物質。酵母菌在“百豐生態菌”集團軍中對于促進其它的有效微生物增殖所需要的基質(食物)的生產提供重要的營養保障。此外，酵母菌生產的單細胞蛋白是動物不可缺少的有效養分。
[0005]4、革蘭氏陽性放線菌群(好氣性)。它從光合細菌中獲取氨基酸、氮素等作為基質，產生出各種抗生物質、維生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前獲取有害霉菌和細菌增殖所需要的基質，從而抑制它們的增殖，并創造出其它有益微生物增殖的生存環境。放線菌和光合細菌混合后的凈菌作用比放線菌單兵作戰的殺傷力要大得多。
[0006]它對難分解的物質，如木質素、纖維素、甲殼素等具有降解作用，并容易被動植物吸收，增強動植物對各種病害的抵抗力和免疫力。放線菌也會促進固氮菌和VA菌根菌增殖。
[0007]5、發酵系的絲狀菌群(嫌氣性)。以發酵酒精時使用的曲霉菌屬為主體，它能和其他微生物共存，尤其對土壤中酯的生成有良好效果。因為酒精生成力強，能防止蛆和其他害蟲的發生，并可以消除惡臭。
[0008]由上可見，各類微生物都各自發揮著重要作用，核心作用是光合細菌和乳酸菌為主導，其合成能力支撐著其他微生物的活動，同時也利用其他微生物產生的物質，形成共生共榮的關系，保證狀態穩定，功能齊全，發揮出集團軍作戰的強大能量。菌群的主要功能是造就良性生態。只要施用恰當，它就會與所到之處的良性力量迅速結合，產生抗氧化物質，清除氧化物質，消除腐敗，抑制病原菌，形成適于動植物生長的良好環境，同時，它還產生大量易為動植物吸收的有益物質，如氨基酸、有機酸、多醣類、各種維生素、各種生化酶、促生長因子、抗生素和抗病毒物質等，提高動植物的免疫功能，促進健康生長，從而在減輕勞動、降低成本、提高產量、改善品質，提前上市，使人們吃(用)上無污染的高質量產品的前提下，提高全社會的生產水平和生活質量，保護地球環境和人類美好的家園
益生菌是無法通過發酵工藝將好氧及厭氧微生物混合培養，各微生物在其生長過程中產生有用物質及其分泌物，形成相互生長的基質和原料，通過相互共生、增殖關系形成一個結構穩定、功能廣泛的具有多種多樣微生物群落的生物菌群，協同發揮作用。
[0009]微生物界有一個有趣的現象，即優勢主導現象。不論是有益菌也好，有害菌也好，真正起主導作用的菌只是極小部分，絕大部分屬中間觀望型，誰占優勢，它就跟誰走。施用了活菌的地方，有益菌很快占居優勢地位，“領導”菌群向發酵、再生方向行動。其結果是:土壤中有益微生物活動增強，菌系豐富，肥力增加，作物生長發育更健壯；糞便臭味消除，污水變清；動物、家畜健康生長；生態環境變得更加生機勃勃——
乳酸乳桿菌活性益生菌在農業上的機理作用:
乳酸乳桿菌屬于乳酸桿菌(，Lacticacid bacteria)是一群桿狀或球狀的革蘭氏陽性細菌，其DNA中G+C含量低于55%，可發酵碳水化合物(主要指葡萄糖)并產生大量乳酸，在自然界分布廣泛，是動物和人腸道等處重要的生理性菌群之一。該類群細菌絕大多數對動物和人無毒、無害，負擔著動物體內重要的生理功能。在乳酸菌中，乳酸桿菌是最大的一個屬，其定義為桿形乳酸桿菌。乳桿菌屬與動物關系最密切，它是動物腸道和陰道中占優勢的菌群之一。乳桿菌分布廣 泛，動物和人類從口腔到直腸始終都有該菌存在。乳酸桿菌己知的生理功能主要表現為:阻止病原菌對腸道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，維持腸道的微生態平衡，預防和抑制腫瘤的發生，增強機體免疫力，促進消化，合成氨基酸和維生素，降低膽固醇，抑制內毒素的生產，延緩衰老和抗輻射等。大量事實證明，只要腸道中乳酸桿菌的數量減少或丟失，出現菌群失調，就可能導致某種疾病的發生；只要腸道中乳酸桿菌的數量增加，區系得到平衡，就可以促進機體健康和治療某種疾病。可見，增加機體腸道中乳酸桿菌的數量是預防和治療某些疾病的一種重要措施。乳酸菌作為魚類益生菌，在腸道內具有較好的定植能力，而且在水產動物中，這種定植無明顯的宿主特異性。Ringoe應用從大西洋鮭分離的廣布肉桿菌，研究在大菱鲆幼魚腸道內的定植時，證明了這一點。Joborn等用肉桿菌來研究其在虹鱒腸道內的定植和對魚類病原菌的抑制作用，結果表明肉桿菌可以在虹鱒腸道內大量增殖并定植下來，但定植效果不佳，停喂肉桿菌3d后廣布肉桿菌的數量明顯下降。Rengpipat等用Bacillus 11養殖斑節對奸也得到類似的結果,抑制了水中弧菌數量的增長。由于抗生素、激素類藥物在水產上的不合理使用，導致農藥殘留問題對人類健康造成了巨大威脅。水產養殖領域，人們越來越提倡生態養殖技術。美國在FDA(1989)規定的40多種飼用微生物中有近30種是乳酸菌。我國農業部在1994年批準使用的微生物品種有蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、乳鏈球菌等，其中大部分為乳酸菌。乳酸菌耐酸，在PH為3.0-4.5時仍可生長，能適應胃腸內的酸性條件，飼喂后能在水產動物體內迅速定植，因此無疑是一種理想的微生物制劑。乳酸菌在水產中的應用大致可分為以下幾個方面:
3.1抑制病原菌，抗病害
乳酸菌能有效調整水產動物腸道的菌群平衡，通過營養競爭、附著位點競爭或分泌抗生素、細菌素等毒素殺死或抑制病原微生物，增強抗感染能力，調節機體腸粘膜的免疫活性，提高動物在遭受病害侵襲時的存活率。近年來，一些乳酸菌開始應用于水產養殖業，實踐證明應用乳酸菌防治水生動物疾病是可行的。
[0010]陳營等從健康牙鲆腸道中分離得到多種乳酸菌，且體外實驗表明對弧菌均有抑制作用。周海平為探明乳酸 桿菌(Lactobacillus, spp)對水產養殖病害的生物防治功能，采用試管稀釋法和平板抑菌圈檢測法，探討了乳酸桿菌代謝產物對沙蠶弧菌(Vibrionereis)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、漂浮弧菌(Vibrio natriegen)的抑制能力，結果表明:乳酸桿菌對病原弧菌具有良好的抑制作用。
[0011]Jiravanichpaisal等報道了乳酸桿菌作為有益菌可以用來防止由發光細菌感染造成的斑節對蝦的白點病。楊鶯鶯等研究乳酸桿菌LI對致病弧菌的抑制作用，證明乳酸桿菌及代謝物質對鯊魚弧菌和溶藻弧菌具有協同抑制作用。楊勇等證明乳酸菌代謝產物對鰻弧菌的生長具有非常顯著的抑制作用，該代謝產物對鰻弧菌的抑制效率在90%以上。姜英輝等研究了乳酸鏈球菌L3-18的培養及其對海洋弧菌的抑制作用。竇曉明就乳酸菌胞外產物對副溶血弧菌抑制作用的研究表明，3株乳酸菌(命名為A-l，A-2，A-3)胞外產物對副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)有較強的抑制作用。
[0012]3.2促進生長，提高免疫力
乳酸菌能分泌乳酸，產生多種消化酶，可幫助魚類消化吸收，促進生長。Byurl等從鲆魚分離并篩選出一菌株Lactobacillus sp.DS-12，它表現出強的抗菌活性，能抑制多種魚體病原菌(如鰻弧菌、嗜水氣單胞菌等)的生長，在2次各為期I個月的飼喂實驗中，他們發現飼喂含有DS-12菌株的試驗組，魚的平均體重的增加均比對照組的快，揭示了乳酸菌同時擁有既抑菌又促生長的雙重機能。Gildberg等用含有大西洋鱈魚內臟提取出來的乳酸菌的飼料喂鱈魚苗，3個月后將魚苗放養在帶有強致病弧菌的環境中，能夠提高抗病率。Gatesoupe利用乳酸菌飼養的輪蟲作為大菱鲆仔魚的鮮活餌料，證明乳酸菌可以提高仔魚對病原弧菌的抵抗力。Nikoskelainent等研究表明，給虹鱒投喂含有乳酸桿菌的館料,可以提高它們的免疫力。桂遠明等報道乳酸菌等微生物制劑對鯉具有促生長和提高抗病力作用。
3.3凈化養殖水體
向養殖水體投放有益菌(光合細菌、乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等)及有益酶(蛋白分解酶、纖維素酶、植酸酶等)的復合制劑，不僅促進餌料生物大量繁殖、生長，而且可分解魚類殘餌、糞便及水中有機質，改良水體環境，抑制水體中有害菌的繁殖生長，調節藻相平衡，控制有害菌藻。使用以乳酸菌為主的微生態制劑，可以有效降低水中的亞硝酸鹽含量；而芽孢桿菌對于水體中氨態氮和有機物的分解作用比較明顯，可降低水體中氨態氮、亞硝酸鹽的含量，避免了傳統肥料高耗氧、破壞和污染水質、高發病率的缺點。所以乳酸菌可與芽孢桿菌、光合細菌、反硝化菌等有益菌混合使用，作為養殖水體的水質調控劑，改善水中生態環境，凈化水質，促進魚蝦類健康生長。
經現場與室內實驗乳酸桿菌對養殖水體，飼料的降解作用進行了深入研究，結果表明，各實驗組中的N02--N、N03—N、P043-P從實驗第I天到第4天一直處于下降趨勢，而NH4+-N呈上升趨勢，對COD無降解能力，溫度、菌濃度、底物濃度對N02--N、N03—N、P043-P、NH4+-N降解率的影響是極其顯著的。結果表明，芽孢桿菌結合乳酸桿菌使用，可以明顯降低養殖水體氨氮等有害物質的含量。
[0013]目前市場上暢銷的EM菌是由多種有益微生物組成的活菌制劑，在水產養殖上既可用作水質凈化、改良劑，保持水質穩定，又可作為餌料拌合劑，增強養殖品種的免疫力，促進養殖品種的健康生長，從而提高產量和效益。乳酸菌作為EM菌的主導菌應用于水質凈化的效果良好。經實驗在養殖池中使用EM菌，實驗池溶氧量比對照池提高11.2%，NH4+-N和N02—N含量分別降低了 54%、55%，餌料系數降低8.2%。江蘇贛榆羅陽用戶用解毒益水露(水產EM)與水溶性腐植酸降低蝦池PH效果明顯，且不反彈。
4應用前景
從目前的研究報道來看，乳酸菌對動物免疫有多方面的調節作用，能顯著提高機體的免疫功能，尤其是在對病原菌的定植拮抗方面，這使對乳酸菌等益生菌研究成為當今生物技術的熱門課題之一。
[0014]作為最有前途的抗生素替代品，乳酸菌正以其獨特的優勢影響著醫藥、食品、畜牧等多種產業的發展。乳酸菌在水產養殖中的應用前景是誘人的，完全有可能取代目前所用的抗生素、化學促生素，成為21世紀人們所接受的綠色微生物制劑。但是關于乳酸菌的研究在陸生動物中開展的較多，而在水產動物中的研究卻剛剛起步，特別是乳酸菌對水產養殖環境的影響以及抗菌機理的基礎研究還很少。所以要真正把乳酸菌這種潛能變成現實尚有一段距離，仍需要大量的研究投人。由于單一使用某一微生物都存在一些缺點，現在許多學者和生產廠家在試圖利用不同菌株的不同特性，將多種微生物培育后復合為復合微生態制劑，以期發揮它們的綜合作用。隨著對其作用機制研究的不斷深入，以及人們對綠色環保意識的不斷增強，乳酸菌的應用前景會更加廣闊。
在飼料行業的制粒工藝中，一般溫度都會很高，80度到100多度不等。而乳酸桿菌不耐高溫，通常情況下，40攝氏度的時候就開始死亡，43度時基本上全部死去，該問題迄今為止尚未得到有效解決，被稱之為世界性難題。希望在未來的幾十年中能得到有效的結果。
【發明內容】
[0015]為了解決目前益生菌高效抑菌作用，提高抑菌多肽的產生且抑制有害菌的生長，本發明提供了一株乳酸乳桿菌LB-Y301及其在發酵產抑菌多肽中的應用，通過誘變提高了乳酸乳桿菌LB-Y301發酵產物中抑菌多肽的產量，產量提高了 50%。
[0016]為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為:一種乳酸乳桿菌hciidLB-YSOl，已于2014年4月23日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，地址:中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO:M 2014143。 [0017]本發明所述的乳酸乳桿菌LB-Y301的篩選方法:原始出發菌株LB-1Ol經過低能氮離子束注入后，平板篩選得到的菌株，搖瓶發酵復篩得到產物多肽濃度高的乳酸乳桿菌，為下一輪誘變菌株。重復上述步驟，直至獲取目標菌株乳酸乳桿菌LB-Y301，具體步驟如下:
(a)單孢子懸浮液的制備:將出發菌株LB-1Ol制成孢子懸浮液，濃度為IX IO6個/ml ；
(b)低能氮離子注入:取100μ L孢子懸浮液，均勻涂布到無菌空平板上，以無菌風吹干，在20Kev能量下，40 X 1014ions/cm2劑量下進行氮離子誘變，離子注入完畢后，在無菌環境下用Iml蒸餾水進行洗脫，洗脫后的菌液在30°C溫浴lh，然后涂布到平板上，30°C倒置培養l-2d。
[0018](c)發酵復篩:將步驟(b)篩選出的菌株接入斜面培養基，在30°C下培養l-2d，然后斜面轉入種子培養基中，在30°C下培養8-10h。取種子液接入發酵培養基中，接種量10%(v/v), 250ml搖瓶裝30ml培養基，發酵溫度30°C，發酵48h，測定發酵液中抑菌多肽的含量，篩選出多肽含量最高的乳酸乳桿菌作為下一輪誘變篩選的出發菌株，重復上述步驟直至篩選到目標菌株LB-Y301。
[0019]上述篩選方法中:步驟(b)中篩選平板為:葡萄糖0.5%、胰蛋白胨1%、牛肉膏
0.3%，瓊脂1.5%、酵母膏0.3%、硫酸鎂0.05%,碳酸鈣0.3%，其余為水ρΗ6.0
步驟(c)種子培養基為:碳源8%、氮源1.5-2%，無機鹽0.15-0.2%，緩沖劑3_4%，其余為水，ρΗ=6.0，發酵培養基成分為:碳源12%、氮源1.1%，無機鹽0.15%，緩沖劑4_7 %，其余為水，ρΗ=6，其中碳源為葡萄糖或糖蜜中的一種或混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨中的一種或混合物，無機鹽為磷酸二氫鉀，緩沖劑碳酸鈣。(以上均為質量百分比)
本發明乳酸乳桿菌LB-Y301的形態學及生理化學特性:
菌落顏色:乳白透明色 需氧方式:兼性厭氧 菌落大小:2-3mm 生長溫度:30°C 最適pH:6.0 菌落形態:圓形 革蘭氏染色:呈陽性
上述乳酸乳桿菌LB-Y301在發酵生產抑菌多肽中的應用，包括如下步驟:1)平板培養:將乳酸乳桿菌LB-Y301接于平板基本培養基上培養，培養溫度為30°C，培養時間l-2d ；
2)斜面培養:將步驟I)中平板培養的乳酸乳桿菌LB-Y301轉接到斜面基本培養基上，培養時間24-36h，培養溫度30°C ；
3)種液培養:將步驟2)中斜面培養的乳酸乳桿菌LB-Y301接到種子培養基中培養，培養時間12-16h，培養溫度30°C，搖床轉速為150r/min ；
4)發酵培養:將步驟3)中的種液轉接到發酵培養基中，接種量為10%(v/v)，培養時間為48h，培養溫度為30°C，搖床轉速為150r/min。
[0020]其中:步驟I)和2)中的基本培養基包含如下質量百分數的組分:碳源0.5%、氮源
1.6-2%、瓊脂1.5%，其余為水，pH6.0 ;其中所述的碳源為葡萄糖或糖蜜中的一種或兩種，所述氮源為蛋白胨、牛肉膏或酵母膏。
[0021]步驟3)種子培養基包含如下質量百分數的組分:碳源8%、氮源1.5-2%，無機鹽
0.15-0.2%，緩沖劑3-4%，pH=6.0，其余為水，其中碳源為葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一種或幾種混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨或者磷酸氫二銨中的一種或幾種；無機鹽為磷酸二氫鉀；緩沖劑為碳酸鈣。
[0022]步驟4)發酵培養基包含如下質量百分數的組分:碳源12-14%、氮源1_1.2%、無機鹽0.15-0.2%、緩沖劑7%， 其余為水，pH=6.0，其中碳源為葡萄糖、糖蜜中的一種或幾種混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨中的一種或幾種，緩沖劑為碳酸鈣，無機鹽為磷酸二氫鉀。
[0023]有益效果:本發明采用了低能N+注入技術，以LB-101為出發菌，平板進行初篩，得到的菌株進行發酵復篩，逐漸提高益生菌發酵產物中抑菌多肽的含量，發酵液中抑菌多肽含量超過15g/L，較出發菌產量提高了 50%的生產菌株，從而提高了益菌抑菌的效果。
【具體實施方式】
[0024]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0025]實施例1乳酸乳桿菌LB-Y301的篩選方法
出發菌株乳酸乳桿菌LB-101是從南京工業大學江浦校區的土壤中篩選得到的。
[0026]以LB-101為出發菌篩選乳酸乳桿菌LB-Y301，具體步驟如下:
a)單孢子懸浮液的制備:將乳酸乳桿菌制成孢子懸浮液，濃度為I X IO6個/ml。
[0027]b)低能氮離子注入:取IOOul孢子懸浮液，均勻涂布到無菌平板上，以無菌風吹干，在20Kev能量下，40 X 1014ions/cm2劑量下進行氮離子誘變，離子注入完畢后，在無菌環境下用Iml無菌水溶液洗脫，洗脫后的菌液在30°C溫浴lh，然后涂布到篩選平板上，進行篩選，30°C倒置培養l-2d，選取溶鈣圈大的，菌落飽滿的。
[0028]c)發酵復篩:將步驟(b)篩選出的乳酸乳桿菌接入斜面培養基中，在30°C下培養ld，然后斜面轉入種液中，在30°C下培養10h。取種子液接入發酵培養基中，接種量10%(v/v), 250ml搖瓶裝30ml培養基，轉速為150r/min，發酵溫度30°C，發酵48h，測定發酵液抑菌多肽的含量，篩選出抑菌多肽含量最高的乳酸乳桿菌菌作為下一輪誘變篩選的出發菌株，重復上述步驟，篩選到目標菌株LB-Y301。[0029]其中培養基配方為:
步驟b)中的篩選平板培養基為:葡萄糖0.5%、胰蛋白胨1%、牛肉膏0.3%，瓊脂1.5%、酵母膏0.3%、酒硫酸鎂0.05%,碳酸鈣0.3%，其余為水ρΗ6.0。
[0030]步驟c)中的種子液培養基:葡萄糖8%、酵母膏1%、硫酸銨1%、磷酸二氫鉀
0.15%，碳酸鈣4%，pH為6，其中葡萄糖需要分消.步驟c)中的發酵培養基:葡萄糖12%、酵母膏0.1%、硫酸銨1%、磷酸氫二鉀0.15%硫酸鎂0.01%碳酸鈣4%，pH6.0，其中葡萄糖需要分消。
[0031 ] 發酵結果抑菌多肽含量檢測如表1 表1
【權利要求】
1.一株乳酸乳桿菌LB-Y301,已保藏于中國典型培養物保藏中心 CCTCC，保藏編號 CCTCC NO:M 2014143。
2.權利要求1所述的乳酸乳桿菌LB-Y301在發酵生產抑菌多肽中的應用。
3.根據權利要求2所述的乳酸乳桿菌LB-Y301在發酵生產抑菌多肽中的應用，其特征在于包括如下步驟: `1)平板培養:將乳酸乳桿菌LB-Y301接于平板基本培養基上培養，培養溫度為30°C，培養時間l-2d ； `2)斜面培養:將步驟I)中平板培養的乳酸乳桿菌LB-Y301轉接到斜面基本培養基上，培養時間24-36h，培養溫度30°C ； `3)種液培養:將步驟2)中斜面培養的乳酸乳桿菌LB-Y301接到種子培養基中培養，培養時間12-16h，培養溫度30°C，搖床轉速為150r/min ； `4)發酵培養:將步驟3)中的種液轉接到發酵培養基中，接種量為10%(v/v)，培養時間為48h，培養溫度為30°C，搖床轉速為150r/min。
4.根據權利要求3所述的乳酸乳桿菌LB-Y301在發酵生產抑菌多肽中的應用，其特征在于:步驟I)和2)中的基本培養基包含如下質量百分數的組分:碳源0.5%、氮源1.6-2%、瓊脂1.5%，其余為水，pH6.0 ;其中所述的碳源為葡萄糖或糖蜜中的一種或兩種，所述氮源為蛋白胨、牛肉膏或酵 母膏。
5.根據權利要求3所述的乳酸乳桿菌LB-Y301在發酵生產抑菌多肽中的應用，其特征在于:步驟3)種子培養基包含如下質量百分數的組分:碳源8%、氮源1.5-2%，無機鹽0.15-0.2%，緩沖劑3-4%，其余為水，pH=6.0，其中碳源為葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一種或幾種混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨或者磷酸氫二銨中的一種或幾種；無機鹽為磷酸二氫鉀；緩沖劑為碳酸鈣。
6.根據權利要求3所述的乳酸乳桿菌LB-Y301在發酵生產抑菌多肽中的應用，其特征在于:步驟4)發酵培養基包含如下質量百分數的組分:碳源12-14%、氮源1-1.2%、無機鹽`0.15-0.2%、緩沖劑7%，其余為水，pH=6.0，其中碳源為葡萄糖、糖蜜中的一種或幾種混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨中的一種或幾種，緩沖劑為碳酸鈣，無機鹽為磷酸二氫鉀。
【文檔編號】C12N1/20GK103966145SQ201410220315
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月23日 優先權日:2014年5月23日
【發明者】虞龍, 陳曉雙, 李玉燕, 吳奎 申請人:虞龍