Dhfr在檢測膀胱癌中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明DHFR在檢測膀胱癌中的應用，屬于分子生物學基因檢測【技術領域】。包括下述步驟：(1)從樣本的膀胱組織和外周血中分別提取DNA，得到DNA模板；(2)以引物對P為引物，分別以從樣本的膀胱組織和外周血提取的DNA為模板，分別進行實時定量PCR擴增；(3)根據ΔΔCt來計算每個樣本的log2比值，并將其與全基因組測序數據得到的拷貝數改變情況進行比較，當拷貝數變化超過2.5或小于1.5時或者當用GISTIC算法得到G分數>0.08或者G分數<0.08時，為膀胱癌樣本。本發明具有指出了DHFR序列擴增可以作為檢測膀胱癌的標記物；DHFR基因可以作為膀胱癌的基因靶向治療試劑盒的優點。
【專利說明】DHFR在檢測膀胱癌中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學基因檢測【技術領域】，具體涉及DHFR在檢測膀胱癌中的應用。
【背景技術】
[0002] 在全世界各個國家和地區，膀胱癌是一種最常見泌尿生殖系統惡性腫瘤。據估計，僅在2008年單年度就有386300例新發病例和150200例死亡病例。過去的研究表明:膀胱癌是一個具有較高異質性的疾病，它有兩個不同亞型(淺表型和侵入型)，其臨床表現多變和遺傳背景復雜。最近，我們開展的一項研究結果表明:在膀胱移行細胞癌中，有八個染色質重塑基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCORl,ARIDlA 和 CHD6)存在頻發突變。然而，目前我們對膀胱癌的體細胞突變情況仍缺乏系統的認識，我們對膀胱癌發生過程中的關鍵“驅動基因”也知之甚少。
[0003]為了確定這些突變基因與膀胱癌發生的相關性，我們采用過去研究中所描述的統計學方法分析了每個基因的體細胞突變率是否顯著高于整個基因組的背景突變率。通過該分析，我們一共發現了 37個顯著突變基因，其中包括7個已知膀胱癌的基因(TP53，HRAS, FGFR3，PIK3CA，RBl，KRAS和TSCI)以及我們過去所發現的八個染色質重塑基因(UTX, ARID1A, MLL-MLL3, CREBBP-EP300, NCORl 和 CHD6)。此外，我們還分析了染色質重塑相關基因和基因家族的突變情況，并在膀胱癌中觀察到多個其他染色質重塑基因的頻發突變，包括組蛋白脫甲基酶基因UTX/UTY(30% )，核染色質重塑基因ARID1A/4A(17% )，組蛋白賴氨酸甲基轉移酶基因MLL/MLL3/MLL5(16% )，組蛋白乙酰轉移酶基因EP300/400(15% )，SffI/SNF復合體相關基因SMARCA4/C1 (7% )和組蛋白脫甲基酶基因JARID 1A/B^% )。總的來說，在99例病例中，至少有57例(58%)患者的染色質重塑基因存在體細胞突變，這進一步表明調節染色質構象的表觀遺傳學改變和翻譯后修飾可能是膀胱癌發生過程中的一種主要的驅動機制。
[0004]我們采用了全基因組測序技術分析了 99例腫瘤的拷貝數變異情況，發現染色體臂或整個染色體水平的異常主要集中在以下染色體(臂):5p，8q，13p和20p_q擴增和8p, 9p-q, lip, 14p, 15p, 17p和21p丟失。與先前的研究結果一致,就總體擴增或缺失的特征而言，不同膀胱癌亞型的擴增或缺失特征沒有明顯差異。通過拷貝數變異分析，我們發現許多公認的致癌基因異常可能與膀胱癌的發生相關。我們采用GSITIC算法來識別在多個樣本中重復出現的小片段拷貝數變異。我們一共找到84個局部擴增區域，其中包括幾個過去已經發現與膀胱癌有關的基因，如:TR10，MDM2, MYC, E2F3, CCNDl和ERBB2。其他擴增區域所包含的基因在膀胱癌中尚屬首次報道，包括CCNE1，CEBPA，E2F1和MUCl。我們還發現了 80個重復發生的局部缺失區域，包括RBl和CREBBP (它們在膀胱癌中常發生截斷突變)。最常見的局部缺失區域(可在50%腫瘤中檢測到)為9p21，其中包含CDKN2A/B基因。有趣的是，我們在14例腫瘤中(14%)發現位于染色體5q(常發生缺失的區域)的DHFR基因發生擴增，并且觀察到DHFR mRNA水平上升和基因組擴增之間存在中等強度的相關性(R2 =0.60，P = 0.018)。DHFR(編碼二氫葉酸還原酶的基因)的突變的突變可以作為膀胱癌突變的檢測標志，協同其他檢測方式對膀胱癌的檢測具有重要意義。同時DHFR編碼的二氫葉酸還原酶在細胞生長和增殖過程嘌呤和胸苷酸合成中是必不可少的關鍵酶，也是許多根治性膀胱切除術前化療抗癌藥的靶點。DHFR擴增可以作為一個生物標志物，用來評估MTX治療膀胱癌的效果。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于公開了 DHFR在檢測膀胱癌中的應用。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0007]1、DHFR在檢測膀胱癌中的應用，包括下述步驟:
[0008](I)、從樣本的膀胱組織和外周血中分別提取DNA，得到DNA模板；
[0009](2)、以5對引物對為引物，分別以從樣本的膀胱組織和外周血提取的DNA為模板，分別進行實時定量PCR擴增，其中引物對為:
[0010]
CCND IF5，-C'TGCGAGGAACAGAAGTGCG-3，,
CCNDlR5'-GG ATGGAGTTGTCGGTGTAG ATG-S5 ；
CDKN2A/2BF5 '-G AAGTCTTGGTCCTGATGTCCCC-3 *?
CDKN2A/2BR5, -CGGCTCTTCTGCAC AACTC AACT-3,；
DIIFEF5，-AGGGACCAGGTTGGATTAGGd,
DIIFRR5 ’-AGGGCAAGGAAGTCTTCACAGC-3';
ERBB2F5，-CTGCTGG AC ATTG ACG AG AC A-3，，
ERBB2K5 ’-TTGATGGGCACCTGGG AG-3 ’ ；
[0011](3)、根據Λ ACt來計算每個樣本的log2比值，并將其與全基因組測序數據得到的拷貝數改變情況進行比較，當拷貝數變化超過2.5或小于1.5時或者當用GISTIC算法得到G分數>0.08或者G分數〈0.08時，為膀胱癌樣本。
[0012]上述技術方案所述的DHFR在檢測膀胱癌中的應用，其中，所述實時定量PCR擴增的反應條件為:
[0013]第一步預變性:95°C 10秒，重復I次；
[0014]第二步PCR反應:95°C 5秒和60°C 30秒，重復40次。
[0015]上述技術方案所述的DHFR在檢測膀胱癌中的應用，其中，所述實時定量PCR擴增體系中含有:12.5μ I 2 X Premix Ex TaqU μ I DHFR 上游引物(10 μ Μ)、I μ I DHFR 下游引物(10 μ Μ)、2 μ I DNA模板和8.5 μ I d Η20(滅菌蒸懼水)。
[0016]本發明具有以下有益效果:
[0017]1、DHFR序列擴增可以作為檢測膀胱癌的標記物；
[0018]2、DHFR基因可以作為膀胱癌的基因靶向治療試劑盒；
[0019]3、DHFR基因有可能用于評估MTX治療膀胱癌的效果。【專利附圖】
【附圖說明】:
[0020] 1、圖1為RT-PCR反應結果。
[0021 ] 2、圖2為RT-PCR反應程序。
【具體實施方式】
:
[0022]為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發明DHFR在檢測膀胱癌中的應用作進一步的說明。
[0023]本發明實施例中未作特殊說明的操作方法均按照儀器中的說明書進行操作。
[0024]實施例1:DHFR在檢測膀胱癌中的應用:
[0025]一、樣本來源與及選擇標準:
[0026]通過泌尿生殖系統癌癥基因組聯盟(UCGC)的中國成員機構，從新檢測的患者中獲取腫瘤樣本和與其匹配的外周血或正常對照組(相鄰的形態正常的膀胱組織)。按照倫理審查委員會規定的制度，每個病人在招聘研究之前均簽署了知情同意書。患者的詳細的臨床資料見表1。
[0027]表1 99例膀胱癌患者信息
[0028]
【權利要求】
1.DHFR在檢測膀胱癌中的應用，包括下述步驟: (1)、從樣本的膀胱組織和外周血中分別提取DNA，得到DNA模板； (2)、以5對引物對為引物，分別以從樣本的膀胱組織和外周血提取的DNA為模板，分別進行實時定量PCR擴增，其中引物對為:
CCNDIF5，-CTGCGAGGAACAGAAGTGCG-3，,CCNDIK5 ’-GG ATGG AGTTGTCGGTGTAG ATG-3 ’ ；CDKN2A/2BF5 ,-GAAGTCTTGGTCCTG ATGTCCCC-35?CDKN2A/2BR5’-CGGCTCTTCTGCACAACTCAACT-3，.?DHFRF5 ’-AGGGACCAGGTTGGATTAGGC-3 ’,DHFRR5 !-AGGGCAAGGAAGTCTTCACAGC-3,:ERBB2F5，-CTGCTGGACATTGACGAGACA-3，?
ERBB2R5 ^TTGATGGGC ACCTGGGAG-3 ’ ； (3)、根據ΛΛ Ct來計算每個樣本的log2比值，并將其與全基因組測序數據得到的拷貝數改變情況進行比較，當拷貝數變化超過2.5或小于1.5時或者當用GISTIC算法得到G分數>0.08或者G分數〈0.08 時，為膀胱癌樣本。
2.根據權利要求1所述的DHFR在檢測膀胱癌中的應用，其特征在于，所述實時定量PCR擴增的反應條件為: 第一步預變性:95°C 10秒，重復I次； 第二步PCR反應:95°C 5秒和60°C 30秒，重復40次。
3.根據權利要求1所述的DHFR在檢測膀胱癌中的應用，其特征在于，所述實時定量PCR 擴增體系中含有:12.5μ 12XPremix Ex TaqU μ I DHFR 上游引物(10 μ Μ)、I μ IDHFR下游引物(10 μ Μ)、2 μ I DNA模板和8.5 μ I d Η20(滅菌蒸餾水)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164482SQ201410212369
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】吳松, 黃毅, 楊坤, 蔣濤濤, 謝暢, 毛有勝, 蔡志明 申請人:吳松, 蔡志明