一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，特別公開了一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法。該方法包括以下步驟：（1）船舶壓載艙沉積物樣品采集；（2）用不同孔徑篩絹進行沉積物樣品預處理；（3）飽和蔗糖溶液離心；（4）分離上清液活體細胞并鏡檢。本發明能夠從船舶壓載艙沉積物中快速分離活體細胞，步驟簡單，分離快速，所分離的活體細胞樣品可用于出入境檢驗檢疫工作中外來入侵生物的分子生物學物種鑒定。
【專利說明】一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法
[0001](一)【技術領域】
本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法。
[0002](二)【背景技術】
外來生物入侵對我國生態環境和社會發展構成嚴重威脅，造成了重大的經濟損失，抵御外來生物入侵，保護國境安全，是出入境檢驗檢疫刻不容緩的職責和義務。隨著海上航運業的快速發展，船舶壓載水及沉積物帶來的海洋生物入侵問題日益嚴重，海洋生物入侵會破壞海洋生態系統結構與功能，并造成一定的經濟損失。船舶壓艙水及沉積物攜帶的海洋生物可以存活數月，并隨著壓艙水的排放而進入其他水域，這為不同水域間一些物種的傳播提供了一個便利的媒介。外來物種在新的適宜生存環境中的異常繁殖，會對近岸水域的生態系統帶來災難性破壞，甚至導致本土物種的滅絕。20世紀60年代以來北美五大湖共發現40余個外來物種，而舊金山灣在1970年后出現了 50多種外來生物。為防止船舶通過壓載水及沉積物轉移外來生物和病原體，國際海事組織制定《船舶壓載水及沉積物控制和管理國際公約》及相關導則。
[0003]海洋浮游動物如枝角類、橈足類等，在其生活史階段會產生休眠細胞以度過不良環境條件，因此可以長時間在船舶壓載艙沉積物中存活。如Kelly對從日本到達美國塔克馬和安吉里斯港的木材運輸船中的壓載水沉積物進行了檢測，其中也發現了存活的軟體動物幼體和浮游甲殼綱動物。Bailey對進入大湖區9艘船舶壓載艙沉積物中的休眠細胞萌發進行了實驗，在孵化出的浮游動物種類中發現4種外來入侵生物。
[0004]目前對沉積物中外來生物的鑒定多依賴于實驗室原位萌發實驗，對沉積物中休眠細胞萌發后的浮游動物幼體進行形態學鑒定，從而判定是否為入侵生物。該方法耗費時間長，并且要求檢驗檢疫人員具有豐富的生物學分類經驗，嚴重制約船舶壓載艙沉積物中外來生物檢驗檢疫工作的開展。而從船舶壓載艙沉積物中分離活體細胞并進行分子生物學鑒定，將大大縮短對船舶 壓載艙沉積物中外來入侵生物進行種類鑒定的時間。
[0005]由于浮游動物休眠細胞個體微小(多為直徑幾十微米)，從船舶沉積物壓載艙沉積物中分離活體細胞十分困難，因此急需建立一種從船舶壓載艙沉積物中快速分離活體細胞的方法。
[0006](三)
【發明內容】
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種步驟簡單、檢測快速精確的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法。
[0007]本發明是通過如下技術方案實現的:
一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，包括如下步驟:
(1)采集船舶壓載艙沉積物，放置于培養皿內；
(2)用過濾海水沖洗沉積物至篩絹，用塑料瓶保存沖洗后的液體；
(3)將塑料瓶中的液體沖洗至篩絹，保留篩絹上的殘留物；
(4)用飽和蔗糖溶液沖洗篩絹上的殘留物到離心管；
(5)將離心管置于臺式離心機上離心；(6)吸取離心管的上清液沖洗至篩絹，保留篩絹上殘留物；
(7)用過濾海水漂洗篩絹上的殘留物至培養皿，在顯微鏡下觀察活體細胞。
[0008]本發明的更優技術方案為:
步驟(2)中，篩絹的孔徑為200-250微米；步驟(3)、(4)、(6)和(7)中，篩絹的孔徑為30-50微米。
[0009]步驟(4)中，飽和蔗糖溶液的組成為200-220克蔗糖/100毫升蒸餾水。
[0010]步驟(5)中，離心機轉速為1000-1200rpm，離心時間為3-5分鐘。
[0011]步驟(2)和(7)中，過濾海水為0.15微米濾膜過濾后的海水。
[0012]本發明能夠從船舶壓載艙沉積物中快速分離活體細胞，步驟簡單，分離快速，所分離的活體細胞樣品可用于出入境檢驗檢疫工作中外來入侵生物的分子生物學物種鑒定。
[0013](四)【具體實施方式】
下列實施例是進一步對本發明的說明，不應該當作對本發明的限制。
[0014]實施例1:對停靠在煙臺芝罘港的船舶壓載艙沉積物樣品進行活體細胞的快速分離
(1)采集船舶壓載艙沉積物，取5克沉積物放置于培養皿內；
(2)用0.45微米過濾海水沖洗沉積物至200微米孔徑篩絹，用塑料瓶保存沖洗后的液
體；
(3)將塑料瓶中的液體沖洗至50微米孔徑篩絹，保留篩絹上的殘留物；
(4)用飽和蔗糖溶液沖洗50微米孔徑篩絹上的殘留物到離心管；
(5)在臺式離心機上1000rpm條件下離心3分鐘；
(6)吸取離心管的上清液沖洗至50微米孔徑篩絹，保留篩絹上殘留物；
(7)用過濾海水漂洗50微米孔徑篩絹上殘留物至培養皿，在顯微鏡下觀察活體細胞。
[0015]實施例2:對停靠在煙臺龍口港的船舶壓載艙沉積物樣品進行活體細胞的快速分離
(1)采集船舶壓載艙沉積物，取5克沉積物放置于培養皿內；
(2)用0.45微米過濾海水沖洗沉積物至200微米孔徑篩絹，用塑料瓶保存沖洗后的液
體；
(3)將塑料瓶中的液體沖洗至40微米孔徑篩絹，保留篩絹上的殘留物； (4)用飽和蔗糖溶液沖洗40微米孔徑篩絹上的殘留物到離心管；
(5)在臺式離心機上1200rpm條件下離心5分鐘；
(6)吸取離心管的上清液沖洗至40微米孔徑篩絹，保留篩絹上殘留物；
(7)用過濾海水漂洗40微米孔徑篩絹上殘留物至培養皿，在顯微鏡下觀察活體細胞。
[0016]實施例3:對停靠在東營港的船舶壓載艙沉積物樣品進行活體細胞的快速分離
(1)采集船舶壓載艙沉積物，取5克沉積物放置于培養皿內；
(2)用0.45微米過濾海水沖洗沉積物至250微米孔徑篩絹，用塑料瓶保存沖洗后的液
體；
(3)將塑料瓶中的液體沖洗至30微米孔徑篩絹，保留篩絹上的殘留物；
(4)用飽和蔗糖溶液沖洗30微米孔徑篩絹上的殘留物到離心管；
(5)在臺式離心機上1200rpm條件下離心3分；(6)吸取離心管的上清液沖洗至30微米孔徑篩絹，保留篩絹上殘留物；
(7)用過濾海 水漂洗30微米孔徑篩絹上殘留物至培養皿，在顯微鏡下觀察活體細胞。
【權利要求】
1.一種船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征為，包括如下步驟:(1)采集船舶壓載艙沉積物，放置于培養皿內；(2)用過濾海水沖洗沉積物至篩絹，用塑料瓶保存沖洗后的液體；(3)將塑料瓶中的液體沖洗至篩絹，保留篩絹上的殘留物；(4)用飽和蔗糖溶液沖洗篩絹上的殘留物到離心管；(5)將離心管置于臺式離心機上離心；(6)吸取離心管的上清液沖洗至篩絹，保留篩絹上殘留物；(7)用過濾海水漂洗篩絹上的殘留物至培養皿，在顯微鏡下觀察活體細胞。
2.根據權利要求1所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，篩絹的孔徑為200-250微米；步驟(3)、(4)、(6)和(7)中，篩絹的孔徑為30-50微米。
3.根據權利要求1所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于:步驟(4)中，飽和蔗糖溶液的組成為200-220克蔗糖/100毫升蒸餾水。
4.根據權利要求1所述的船舶壓載 艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于:步驟(5)中，離心機轉速為1000-1200rpm，離心時間為3-5分鐘。
5.根據權利要求1所述的船舶壓載艙沉積物中活體細胞的分離方法，其特征在于:步驟(2)和(7)中，過濾海水為0.15微米濾膜過濾后的海水。
【文檔編號】C12N5/07GK104004704SQ201410210576
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月19日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】黃強 申請人:山東恒誠檢測科技有限公司