一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物，所述方法主要包括：從待測乳制品中提取總DNA；以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增；所述特異性引物為SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2；對擴增結果進行分析判斷。本發明的方法還可包括制作熒光定量PCR標準曲線，并將擴增結果和標準曲線比對計算出待測樣品中大腸菌群細菌的活菌數。本發明的引物具有較高的特異性和靈敏性，本發明的方法可以快速、準確的完成乳制品中大腸菌群的定量測定。
【專利說明】—種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物，具體是一種熒光定量PCR檢測方法及該方法中所用的特異性引物，屬于細菌檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]大腸菌群(Coliform bacteria)是一群在37°C 24小時能發酵乳糖產酸產氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，主要包括腸桿菌科的四個屬即大腸埃希氏菌屬(Escherichia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、產氣克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和陰溝腸桿菌屬(EnteiObacter)。大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌。大腸菌群廣泛存在于人和溫血動物的腸道，并隨糞便分布于自然界。大腸菌群既是糞便污染的指示菌，又是腸道致病菌污染食品的指示菌，是世界上大多數國家和組織評價食品衛生質量的重要安全性指標之一，在食品微生物指標體系中占有舉足輕重的地位。
[0003]我國的食品衛生微生物標準體系主要由菌落總數、大腸菌群和致病菌三大類構成。大腸菌群的傳統檢測和計數方法有多管發酵法(MTF)和濾膜法(MF)。MTF是食品大腸菌群檢測公認的傳統方法，其原理是依據大腸菌群能夠發酵乳糖，產酸產氣的特點，將樣品進行系列倍比稀釋，接種到含有乳糖的培養基中，進行初發酵試驗，觀察產氣情況，產氣者進行復發酵試驗。MTF優點是不需昂貴的儀器設備，經過基本微生物學培訓的技術員即可操作；缺點是耗時費力，樣品需要作系列稀釋，加上復發酵試驗大約需要96h。MF已在許多國家作為水質微生物檢測的標準方法，核心是使用0.45 μ m的過濾膜過濾水樣，將細菌截流在膜上，然后把膜放在選擇性培養基中培養，計數膜上生長出的典型細菌集落。MF主要用于測定水中大腸菌群，雖然較MTF快，總需約48~72h，但僅適用于雜質較少的水體。
[0004]乳制品富含蛋白質、脂肪等營養物質，在生產、運輸、加工和貯藏過程中，如果操作不當，極易受到大腸菌群的污染。統計顯示，在影響中國食品安全的諸因素中，微生物污染高居首位。世界各國普遍將大腸菌群作為食品的細菌學常規檢驗指標之一，并且都對此衛生標準有明確規定，其檢測結果的準確性直接關系到產品的品質和食品企業的經濟效益，更關系到所有消費者的健康。乳 制品企業大腸菌群的通用檢測方法是國標方法，經過系列稀釋、初發酵試驗、復發酵驗證等步驟，得出檢驗結果至少需要3-5天時間，對于貨架期較短的食品非常不便。因此，提高大腸菌群檢測的精確度和縮短檢測時間是控制和保障食品安全的重要手段。
[0005]自1985年聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術問世以來，這一技術逐漸推廣應用于生命科學的各個領域。因其具備快速、特異、靈敏、操作簡便的特性，目前已被廣泛應用于各種致病微生物的檢測領域。但是常規PCR只能對終產物進行分析，無法對起始模板準確定量，必須在擴增反應結束后借助電泳方法分析，費時費事，無法對擴增反應實時檢測，因此常規PCR難以用于微生物的定量分析。實時熒光定量PCR技術是一種新型的核酸擴增技術，是DNA定量技術的一次飛躍，其主要是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。實時熒光定量PCR技術具有檢測精度、靈敏度高，檢測重復性好和線性范圍廣，操作簡單、安全、自動化程度高，檢測速度快、效率高等明顯的優越性，是目前世界上公認的用于醫學臨床及生物學研究的最先進的核酸分子檢測手段，已被世界各國研究機構承認并推崇。
[0006]然而，對于乳制品而言，通常成分復雜，其中可能含有多種抑制PCR反應的成分，且乳制品中大腸菌群限量指標較低，如何設計具有較高特異性和靈敏性的引物成為分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的一個關鍵。
【發明內容】
[0007]本發明的一個目的在于提供一種利用分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的方法，以縮短乳制品中大腸菌群的檢測時間，提高檢測準確性，且可以定量地檢測乳制品中大腸菌群。
[0008]本發明的另一目的在于提供一種用于分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的特異性引物。
[0009]本發明的另一目的在于提供了一種用于分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，其中包含本發明所述的引物。
[0010]為達上述目的，一方面，本發明提供了一種利用分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的方法，該方法主要包括:
[0011]從待測乳制品樣 品中提取總DNA ；
[0012]以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增；所述特異性引物為SEQID N0.1 與 SEQ ID N0.2 ；
[0013]對上述擴增結果進行分析判斷。
[0014]如前所述，通常，乳制品中成分復雜，可能含有多種抑制PCR反應的成分，且乳制品中大腸菌群限量指標較低，設計大腸菌群特異性引物是本發明的分子生物學檢測技術的
關鍵之一。
[0015]根據本發明的具體實施方案，本案發明人研究了乳制品大腸菌群的污染狀況，對乳制品中大腸菌群進行鑒定和分類，將從大量常見乳制品大腸菌群陽性樣品中分離到的菌株進行菌落形態、革蘭氏染色、生理生化及16S rRNA基因序列分析分類鑒定，最終設計了本發明的大腸菌群特異性引物。所設計的大腸菌群特異性引物為:
[0016]E.coli F:5，-CACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3，(SEQ ID N0.1)；
[0017]E.coli R:5’-GAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0018]本發明所設計的引物對SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2，具有較高的特異性。在本發明的一具體實施例中，利用本發明所設計的引物對，以大腸菌群四個菌屬標準株基因組DNA為模板，同時以腸炎沙門氏菌和痢疾志賀氏菌基因組DNA為陰性對照，另以活性菌乳制品中常見的益生菌動物雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌基因組DNA為陰性對照，進行PCR擴增。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結果表明，本發明所設計的引物對只能擴增出大腸菌群四個菌屬標準株，不能擴增出對比菌株，表明該引物特異性非常好。
[0019]根據本發明的具體實施方案，由于通常乳制品成分復雜，其中可能含有多種抑制PCR反應的成分，乳制品中大腸菌群限量指標較低，為有效提取乳制品中大腸菌群DNA，本發明進一步對相關提取方法進行了優化。根據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟:
[0020]將待測乳制品樣品進行増菌培養；
[0021]増菌培養后的樣品離心，收集沉淀，加入TE緩沖液重懸，液氮凍融；加入SDS和蛋白酶K，37°C搖床4h以上；
[0022]加入CTAB提取緩沖液消化；
[0023]用酚仿法抽提；
[0024]加入異丙醇沉淀富集DNA。
[0025]根據本發明的更具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，樣品經增菌培養后，才能有效提取到樣品中可能存在的大腸菌群DNA模板并進行熒光定量PCR擴增，適宜的培養時間是提高檢測準確性、有效判別樣品是否符合相關衛生標準的關鍵。本案發明人對多種常見的需檢測大腸菌群的乳制品包括奶粉、液態中性乳及乳飲料、酸奶、酸乳飲料、含乳蛋白的冷凍飲品等進行了摸索性實驗，最終確定了以下適宜的增菌培養條件:
[0026]對于液態的待測乳制品樣品(例如，液態中性乳及乳飲料、酸性乳及乳飲料、含乳蛋白的冷凍飲品料液)，可按照30~50mL待測乳制品樣品:250~350mL營養肉湯的比例進行混合，于37 ± I °C生化培養箱中増菌培養4~6h ;
[0027]固態的乳制品樣品(例如，奶粉)，可按照30~50g待測乳制品樣品:250~350mL營養肉湯的比例進行混合，于37±1°C生化培養箱中増菌培養4~6h。
[0028]上述增菌培養條件對于目前常見乳制品中大腸菌群的存在范圍是適用的，特別是，按照上述條件增菌培養后并按照本發明的方法進行定量檢測時，檢測結果具有較高的檢測準確性。
[0029]例如，在本發明的一具體實施方案中，待測乳制品為含乳蛋白的冷凍飲品，在該方案中，增菌培養時可按照30mL含乳蛋白的冷凍飲品料液:300mL營養肉湯的比例進行混合，于37°C生化培養箱中増菌培養5h ;之后按照本發明的方法提取DNA進行PCR擴增檢測。如果待測樣品中大腸菌群數量超過相關衛生標準的最高限量指標(GB2759.1-2003中大腸菌群限量指標為450MPN/100mL)，則經過上述增菌培養后可有效提取到DNA模板并經后續PCR擴增被檢測出來。即，在該實施方案中，如果按照該方法增菌培養并提取DNA經PCR擴增檢測后，當低于熒光定量PCR檢測限時，則含乳蛋白的冷凍飲品中大腸菌群數< 450MPN/100mL，符合相關衛生標準。
[0030]對于不同種類的乳制品樣品，相關衛生標準中大腸菌群限量指標不同，如僅需簡單的定性或半定量檢測，可先用大腸菌群數為衛生標準中大腸菌群限量指標的標準品進行增菌培養并提取DNA經PCR擴增檢測，確定能夠達到熒光定量PCR檢測限的最短培養時間。
[0031]根 據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，増菌培養后的樣品離心、重懸、加入SDS和蛋白酶K破裂細胞降解蛋白質的過程可以參照所屬領域的常規操作進行。本發明中優選的具體操作可以為:取増菌培養的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀；加入500 μ L TE緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次；加入80μ L10% SDS 和 1(^1^011^/11^蛋白酶1(，371:搖床411 以上。
[0032]根據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，加入CTAB提取緩沖液消化的過程也可參照所屬領域的常規操作進行。本發明中優選的具體操作可以為:加入 100μ L5M NaCl 溶液及 80μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min。
[0033]根據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，用酚仿法抽提的過程也可參照所屬領域的常規操作進行。本發明中優選的具體操作可以為:用等體積酹:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，12000g,4°C離心10min,取上清；之后再用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清。
[0034]根據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，酚仿法抽提后的樣品加入異丙醇沉淀富集DNA。該操作也可參照本領域的常規操作進行。本發明中優選的具體操作可以為:采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，50yL TE溶解備用。
[0035]根據本發明的更具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟:
[0036]按照30~50mL待測乳制品液態樣品:250~350mL營養肉湯的比例，或者30~50g待測乳制品固態樣品:250~350mL營養肉湯的比例進行混合，于37土1°C生化培養箱中増菌培養4~6h ;更優選地，是按照30mL待測乳制品液態樣品:300mL營養肉湯的比例，或者30g待測乳制品固態樣品:300mL營養肉湯的比例進行混合，于37°C生化培養箱中増菌培養5h ；
[0037]取増菌培養5h的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀；
[0038]加入500 μ L TE 緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次；
[0039]加入80yL10% SDS 和 10 μ L20mg/mL 蛋白酶 K，37°C搖床 4h 以上；
[0040]加入100 μ L5M NaCl 溶液及 80 μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min ；
[0041]用等體積酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，12000g, 4?離心10min,取上清；
[0042]用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清；
[0043]采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，50 μ L TE溶解備用。
[0044]本發明的上述方法特別適合于從乳制品中提取大腸桿菌DNA，采用ND-1000微量紫外/可見分光光度計測定提取的基因組DNA的濃度，結果260nm/280nm的比值在1.8~
2.0之間，表明提取的基因組DNA質量非常好。
[0045]根據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，是需要定量測定乳制品樣品中的大腸菌群。在該實施方案中，所述PCR為熒光定量PCR，優選的擴增反應條件如下:
[0046]反應體系:10μ mol/L 上下游引物各 0.4 μ L, DNA 模板 2 μ L, Passive ReferenceDye:0.4 μ L, 2 X TransStart Green qPCR SuperMix: 10 μ L, ddH20 補足至 20 μ L ;
[0047]擴增程序:95°C預變性20s ;40個循環，95°C變性5s，62°C退火30s，72°C延伸40s。
[0048]本發明的方法，可適用于檢測液態乳制品(例如中性液態乳、中性乳飲料、酸性乳及乳飲料等)、奶粉、冷飲、酸奶等乳制品。
[0049]根據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的方法中，所述PCR為熒光定量PCR，該方法還包括制作熒光定量PCR標準曲線、并將擴增結果與標準曲線進行比對計算出待測樣品中大腸菌群細菌的活菌數的過程。
[0050]另一方面，本發明還提供了一種用于實現本發明所述檢測乳制品中大腸菌群的方法的引物，該引物如SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2所示。
[0051]另一方面，本發明還提供了一種檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，該試劑盒包含本發明所述的引物(SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2)。
[0052]根據本發明的具體實施方案，本發明的檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒還包括Passive Reference Dye 以及 TransStart Green qPCR SuperMix0
[0053]綜上所述，本發明從待測乳制品樣品中提取了總DNA，設計了大腸菌群特異性引物，提供一種乳制品中大腸菌群的熒光定量PCR檢測方法，該方法可以快速、準確定量檢測樣品的大腸菌群，大大縮短了樣品大腸菌群的檢測時間，提高了乳制品中大腸菌群檢測靈敏度和準確度，對企業生產及品控微生物安全具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0054]圖1為PCR(SEQ ID N0.1 ；SEQ ID N0.2)產物電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌,泳道3為產氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌,泳道5為腸炎沙門氏菌，泳道6為痢疾志賀氏菌，泳道7為動物雙歧桿菌，泳道8為鼠李糖乳桿菌，泳道M為DNAMarker2000o
[0055]圖2為PCR(SEQ ID N0.3 ；SEQ ID N0.4)產物電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌,泳道3為產氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌,泳道5為腸炎沙門氏菌，泳道6為痢疾志賀氏菌，泳道7為動物雙歧桿菌，泳道8為鼠李糖乳桿菌，泳道M為DNAMarker2000o
[0056]圖3為PCR(SEQ ID N0.5 ；SEQ ID N0.6)產物電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌,泳道3為產氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌,泳道5為腸炎沙門氏菌，泳道6為痢疾志賀氏菌，泳道7為動物雙歧桿菌，泳道8為鼠李糖乳桿菌，泳道M為DNAMarker2000o
[0057]圖4為引物(SEQ ID N0.1 ；SEQ ID N0.2)靈敏性驗證，PCR產物電泳圖，泳道I模板DNA濃度為105pg/ μ L，泳道2模板DNA濃度為104pg/ μ L，泳道3模板DNA濃度為103pg/μ L，泳道4模板DNA濃度為102pg/ μ L，泳道5模板DNA濃度為IOpg/ μ L，泳道6模板DNA濃度為Ipg/ μ L，泳道7模板DNA濃度為0.1pg/ μ L，泳道8為無菌水(陰性對照)，泳道M為 DNA Marker2000o
[0058]圖5為大腸菌群基因組DNA電泳圖，泳道I為大腸埃希氏菌，泳道2為檸檬酸桿菌，泳道3為產氣克雷伯氏菌，泳道4為陰溝腸桿菌，泳道M為DNA Marker。
[0059]圖6為FQ-PCR標準曲線，R值為0.998，精確度較高，可以作為待測樣品中大腸菌群細菌數量測定的參考依據。
[0060]圖7為樣品FQ-PCR擴增曲線，灰度較深標記為標準品，灰度較淺標記為樣品，從左到右依次為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6。
【具體實施方式】
[0061] 為了更清楚地理解本發明，現參照下列實施例及附圖進一步描述本發明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發明。
[0062]實施例中未注明具體條件的實驗方法為所屬領域熟知的常規方法和常規條件，或按照制造商所建議的條件。
[0063]實施例中所用到的各種化學試劑均可商購獲得，例如:
[0064]乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇等化學試劑購自天津市化學試劑三廠；
[0065]蛋白酶K、Tris堿、EDTA(乙二胺四乙酸)購自Sigma公司；
[0066]Tris飽和酚、SDS (十二烷基硫酸鈉)、CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)購自生工生物工程(上海)有限公司；
[0067]TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；
[0068]使用的熒光定量PCR儀為美國ABI公司的ΑΒΙ-St印One熒光定量PCR儀；
[0069]所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；
[0070]大腸埃希氏菌(1.2463)、檸檬酸桿菌(1.1732)、產氣克雷伯氏菌(1.1736)、陰溝腸桿菌(1.181)、腸炎沙門氏菌(1.1859)以及痢疾志賀氏菌(1.1869)等標準菌株均購自中國普通微生物菌種保藏中心，動物雙歧桿菌(bbl2)、鼠李糖乳桿菌(LGG)由伊利集團技術中心保存。
[0071]實施例1
[0072]1、引物的設計、合成、特異性檢測及靈敏性驗證
[0073]本發明所設計的大腸菌群特異性引物為:
[0074]F:5，-CACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3，(SEQ ID N0.1)； [0075]R:5’-GAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0076]為驗證本發明所設計的引物的特異性，與采用Primer Premier5.0軟件設計的以下引物對(這些引物均是在GenBank中查找大腸菌群四個菌屬標準株大腸埃希氏菌(AB548582.1)、檸檬酸桿菌(AB548577.1)、產氣克雷伯氏菌(Y17656.1)和陰溝腸桿菌(EF551364.1)的16S rRNA基因，找出其共同保守序列，利用軟件設計)進行了對比試驗:
[0077]F:5，-GACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATG-3，(SEQ ID N0.3)；
[0078]R:5，-CGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG-3，(SEQ ID N0.4)。
[0079]F:5’-GGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAAC-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0080]R:5，-CGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG-3，(SEQ ID N0.6)。
[0081]引物特異性驗證:
[0082]取大腸埃希氏菌(1.2463)、檸檬酸桿菌(1.1732)、產氣克雷伯氏菌(1.1736)和陰溝腸桿菌(1.181)標準菌株菌液，采用蛋白酶K法提取宏基因組DNA，作為模板。選取與大腸菌群四個菌屬親緣性較近，也是食品污染的主要致病菌，同為腸桿菌科的腸炎沙門氏菌(1.1859)以及痢疾志賀氏菌(1.1869)菌液，采用蛋白酶K法提取宏基因組DNA，以腸炎沙門氏菌(1.1859)及痢疾志賀氏菌(1.1869)基因組DNA為陰性對照，另以活性菌乳制品中常見的動物雙歧桿菌(bbl2)和鼠李糖乳桿菌(LGG)，采用蛋白酶K法提取基因組DNA為陰性對照，采用 3 對引物(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2 ；SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4 ;SEQ IDN0.5, SEQ ID N0.6)進行普通 PCR 擴增。PCR 體系 25 μ L =IOXPCRBuffer:2.5μ L ；2.5mmol/L dNTPs:2.Ομ L ；5 μ mol/L 上游引物:1.0μ L ;5ymol/L 下游引物:1.0μ L ；5U/y L TaqDNA聚合酶:0.3 μ L ；100ng/ μ LDNA模板:1.0 μ L ；ddH20:17.2 μ L。PCR循環程序:95°C預變性 5min ;95°C變性 lmin，58°C退火 45s，72°C延伸 IminlOs，35 個循環;72°C終端延伸 7min,4°C —m。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結果表明:引物(SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2)只能擴增出大腸菌群四個菌屬標準株，不能擴增出對比菌株(見圖1);引物(SEQ IDN0.3,SEQ ID N0.4)只能擴增出大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌及產氣克雷伯氏菌，不能擴增出陰溝腸桿菌(見圖2);引物(SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6)能擴增出大腸菌群四個菌屬標準株，但是也能擴增出腸炎沙門氏菌和動物雙歧桿菌(見圖3);表明引物(SEQ ID N0.USEQID N0.2)不但靈敏度高(擴增目的條帶非常亮)，而且特異性也非常好。
[0083]引物靈敏性驗證:
[0084]采用蛋白酶K法提取大腸菌群標準菌株的基因組DNA，微量核酸蛋白分析儀測定其濃度，無菌水作10倍梯度稀釋，使基因組DNA濃度分別為IO5Pg/μ LUO4Pg/μ LUO3Pg/μ L、IO2Pg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L，0.lpg/ μ L，分別取不同濃度的基因組 DNA1.0 μ L 為模板，無菌水作為陰性對照，采用引物SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2進行PCR擴增。PCR體系 25 μ L: 10 X PCRBuffer:2.5μ L ；2.5mmol/L dNTPs:2.Ομ L ；5 μ mol/L 上游引物:l.0yL ;5 μ mol/L 下游引物:1.Ομ L ；5U/y L Taq DNA 聚合酶:0.3μ L ; DNA 模板:1.0μ L ;ddH20:17.2 μ L。PCR 循環程序:95°C預變性 5min ;95°C變性 lmin，58°C退火 45s，72°C延伸lminl0s，35個循環；72°C終端延伸7min，4°C —PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結果當模板濃度為IO5Pg/ μ L~102pg/ μ L時,可見清晰的目的條帶，當模板濃度為IOpg/μ L時，可見微弱的目的條帶，當模板濃度降低至lpg/μ L時，無目的條帶出現，表明引物對SEQ ID N0.1與SEQ ID N0.2的靈敏度較高，檢測限為模板DNA濃度IOpg/μ L (見圖4)。
[0085]2、待測樣品 中細菌宏基因組DNA提取
[0086]隨機選取6份待測乳制品樣品(含乳蛋白的冷凍飲品料液)，各取30mL分別接種到300mL營養肉湯中，于37°C生化培養箱中増菌培養5h ；
[0087]取増菌培養5h的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀；
[0088]加入500 μ L TE緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次；
[0089]加入80yL10% SDS 和 1(^1^2011^/1^蛋白酶1(，371:搖床411 以上；
[0090]加入100 μ L5M NaCl 溶液及 80 μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min ；
[0091]用等體積酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，12000g, 4?離心10min,取上清；
[0092]用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清；
[0093]采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，50 μ L TE溶解，得到DNA模板，備用。
[0094]按照上述方法提取得到的DNA模板，經1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見明顯的目的條帶(見圖5)，表明該法可以提取到大腸菌群的基因組DNA，而且收率很高。
[0095]3、采用熒光定量PCR檢測樣品中大腸菌群的數量:
[0096]標準品的制備:
[0097]將過夜活化的大腸菌群菌液，10倍系列稀釋，平板計數法計數并計算菌液濃度。取ImL已測定濃度的菌液，提取細菌的基因組DNA，應用微量紫外分光光度計測定DNA濃度，計算單位濃度的基因組DNA中所包含的大腸菌群細菌的個數，將此單位濃度的基因組DNA進行10倍系列稀釋，并以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應。
[0098]標準曲線的繪制:
[0099]以含有梯度稀釋個數大腸菌群細菌基因組DNA陽性模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數(Ct)為縱坐標擴增得到大腸菌群的定量擴增標準曲線(見圖6)，以此作為待測樣品中大腸菌群數量測定的參照標準。
[0100]待測樣品中大腸菌群的測定:
[0101]取2 μ L提取的待測樣品基因組DNA作為模板進行FQ-PCR擴增，FQ-PCR反應體系:上游引物:0.4μ L ;下游引物:0.4μ L ;DNA 模板:2μ L ；Passive Reference DyeI:0.4μ L ；
2X TransStart Green qPCR SuperMix:10 μ L ；ddH20:Up to20yL。FQ-PCR 擴增程序:95°C 20s ;40個循環，95°C 5s, 62°C 30s, 72°C 40s。將擴增結果和標準曲線比對計算出每毫升樣品中大腸菌群細菌的活菌數(見圖7)。
[0102]待測樣品中大腸菌群的定量結果見表1:
[0103]表1樣品中大腸菌群數量。
[0104]
【權利要求】
1.一種檢測乳制品中大腸菌群的方法，該方法主要包括: 從待測乳制品樣品中提取總DNA ； 以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增；所述特異性引物為SEQ IDN0.1 與 SEQ ID N0.2 ； 對上述擴增結果進行分析判斷。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟: 將待測乳制品樣品進行増菌培養； 増菌培養后的樣品離心，收集沉淀，加入TE緩沖液重懸，液氮凍融；加入SDS和蛋白酶K，37°C搖床4h以上； 加入CTAB提取緩沖液消化； 用酚仿法抽提； 加入異丙醇沉淀富集DNA。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟: 按照30~50mL待測乳制品液態樣品:250~350mL營養肉湯的比例，或者30~50g待測乳制品固態樣品:250 ~350mL營養肉湯的比例進行混合，于37土 1°C生化培養箱中増菌培養4~6h ; 取増菌培養5h的樣品lmL，12000g，4°C離心10min，收集菌體沉淀； 加入500 μ L TE緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次； 加入80yL10% SDS和10 μ L20mg/mL蛋白酶K，37°C搖床4h以上； 加入 100 μ L5M NaCl 溶液及 80 μ L10mol/L CTAB 溶液，65°C水浴 20min ； 用等體積酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提,UQQQgJC離心10min,取上清； 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清； 采用異丙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌，自然干燥，TE溶解備用。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PCR為熒光定量PCR，擴增反應條件如下: 反應體系:10 μ mol/L 上下游引物各 0.4 μ L, DNA 模板 2 μ L, Passive Reference Dye:0.4 μ L, 2 X TransStart Green qPCR SuperMix: 10 μ L, ddH20 補足至 20 μ L ; 擴增程序:95°C預變性20s ；40個循環，95°C變性5s，62°C退火30s，72°C延伸40s。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述乳制品為液態乳制品、奶粉、冷飲。
6.根據權利要求1~5任一項所述的方法，其中，所述乳制品為含乳蛋白的冷凍飲品，其中，增菌培養時按照30mL含乳蛋白的冷凍飲品料液:300mL營養肉湯的比例進行混合，于37°C生化培養箱中増菌培養5h ;之后提取DNA進行熒光定量PCR擴增檢測；當低于熒光定量PCR檢測限時，則含乳蛋白的冷凍飲品中大腸菌群數< 450MPN/100mL，符合相關衛生標準。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PCR為熒光定量PCR，該方法還包括制作熒光定量PCR標準曲線、并將擴增結果與標準曲線進行比對計算出待測樣品中大腸菌群細菌的活菌數的過程。
8.用于實現權利要求1~7任一項所述檢測乳制品中大腸菌群的方法的引物，該引物如 SEQ ID N0.1 與 SEQ ID N0.2 所示。
9.一種檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，該試劑盒包含權利要求8所述的引物。
10.根據權利 要求9所述的試劑盒，該試劑盒還包括PassiveReference Dye以及TransStart Green qPCR SuperMix0
【文檔編號】C12N15/11GK103981266SQ201410210385
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月19日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】安穎, 齊炳理, 陳世賢, 張雅君 申請人:內蒙古伊利實業集團股份有限公司