一種培養葡糖醋桿菌的方法
【專利摘要】本發明涉及微生物培養【技術領域】，公開了一種培養葡糖醋桿菌的方法。本發明所述方法將保存在固體培養基上的葡糖醋桿菌用液體培養基依次進行菌種活化、種子液制備，然后種子液轉接到新鮮的液體培養基中進行產纖維素培養，同時在培養容器內設置篩網。本發明針對葡糖醋桿菌在培養時易出現負變異菌株的問題，通過安裝篩網這種簡便的方式，讓菌體產生纖維素時，可附著于篩網上，既避免了負變異菌株的出現，同時又提高了纖維素產量，能夠廣泛應用于葡糖醋桿菌的培養中。
【專利說明】一種培養葡糖醋桿菌的方法
【技術領域】
[0001]本 發明涉及微生物培養【技術領域】，具體涉及一種培養葡糖醋桿菌的方法。
【背景技術】
[0002]葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter),原是醋桿菌屬下(Acetobacter)的葡糖醋桿菌亞屬，該亞屬于1997年被Yamada等人在16S rRNA序列分析和泛醌類型研究基礎上，提升為葡糖醋桿菌屬。該屬下目前有16個種，其中7個種能產生纖維素，分別 為 Ga.europaeus, Ga.1ntermedius, Ga.hansenii, Ga.xylinus, Ga.swingsii, Ga.rhaeticus, Ga.nataicola, Ga.kombuchae。在以前的文獻及現在的一些文獻中所提及的木醋桿菌(Acetobacter xyIinum)就等同于 Ga.xylinus (或 G.xylinus)。
[0003]葡糖醋桿菌產生的纖維素又稱為細菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)，因其純度、結晶度、持水力、楊氏模量高及生物相容性好等獨特性能，廣泛應用于食品、醫藥、造紙、音響等領域。
[0004]常用的培養葡糖醋桿菌有3種方式:淺盤靜置培養、振蕩培養、氣升式培養。
[0005]淺盤靜置方式培養時，在收獲BC前不宜觸動，否則氣/液界面很難成膜，這使發酵過程中的氧氣濃度、PH維持及營養成分的補充都無法實現，從而降低了生產效率。但當裝液量大時，易出現負變異菌株，導致BC產量降低。
[0006]振蕩培養時，發酵過程中的氧氣濃度、pH維持及營養成分都便于控制，因此，得以廣泛研究，但振蕩培養時的最大的缺點是在剪切力的作用下，葡糖醋桿菌易出現不產BC的負變異菌株，從而降低了 BC的產量。
[0007]氣升式培養時，發酵過程中的氧氣濃度、pH維持及營養成分的補充便于控制，但其缺點是在氣體沖擊下，菌體運動加劇，易出現負變異菌株，導致BC產量下降。
[0008]可以看出，現有的常規培養方法都會出現負變異菌株，導致BC產量的降低。因此，需要提供一種簡便的培養方法來解決此問題，提高生產效率。
【發明內容】
[0009]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種培養葡糖醋桿菌的方法，使得所述方法能夠顯著提高細菌纖維素的產量；
[0010]本發明的另一個目的在于提供一種培養葡糖醋桿菌的方法，使得所述方法能夠完全避免負變異菌株的產生。
[0011]為實現以上發明目的，本發明提供如下技術方案:
[0012]一種培養葡糖醋桿菌的方法，將保存在固體培養基上的葡糖醋桿菌用液體培養基依次進行菌種活化、種子液制備，然后種子液轉接到新鮮的液體培養基中進行產纖維素培養，同時在培養容器內設置篩網。
[0013]針對現有的常規培養方式易產生負變異菌株，導致細菌纖維素產量不高的缺陷，本發明采用在培養容器中設置篩網的簡便方式，避免負變異菌株的產生，提高細菌纖維素的產量。
[0014]本發明所述方法中菌種活化、種子液制備以及所采用的培養基可按照本領域常規方法進行相關操作。作為優選，本發明菌種活化、種子液制備具體為:
[0015]固體培養基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na2HPO4^0.115g檸檬酸，2g瓊脂，12rC，15min滅菌，適用于菌種保存；
[0016]液體培養基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na2HP04、0.115g檸檬酸，121 °C, 15min滅菌,適用于靜置培養；
[0017]液體培養基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na2HP04、0.115g檸檬酸，Ig乙醇，121 °C, 15min滅菌,適用于氣升式培養和振蕩培養；
[0018]液體培養基(IOOmL):自然發酵椰子水20_99mL、4g白砂糖、0.3g(NH4)2S04、0.1gKH2P04、0.05g MgSO4, pH4.5，105°C,15min消毒，適用于振蕩培養結合氣升式培養；
[0019]挑取固體培養基上的葡糖醋桿菌于50mL液體培養基中進行菌種活化，30°C靜置培養4d ;菌種活化液按5% (v/v)的接種量轉接于IOOmL液體培養基，30°C靜置培養4d，制備種子液。
[0020]作為優選，所述培養為靜置培養、振蕩培養、氣升式培養或振蕩培養結合氣升式培養。進一步優選地，所述靜置培養培養溫度為30°C，所述振蕩培養培養溫度為30°C，轉速120rpm，所述氣升式培養培養溫度為30°C，通氣率為2.5L/min，所述振蕩培養結合氣升式培養的培養溫度為30°C，轉 速120rpm，通氣率為2.5L/min。
[0021]作為優選，所述種子液接種量為5%,即每IOOmL中接種5mL種子液。
[0022]作為優選，所述設置篩網的方式具體為:
[0023]設置2個或2個以上第一篩網，所述各第一篩網相互平行且沿豎直方向依次排布，各第一篩網之間相距3-8cm，各第一篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網距容器底面為3-8cm，示意圖見圖1 ;
[0024]或，
[0025]設置2個或2個以上第二篩網，所述各第二篩網沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，各第二篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，第二篩網至少高于液面
0.5cm,第二篩網距容器底面為Ocm,不意圖見圖2 ；
[0026]或，
[0027]設置2個或2個以上第三篩網，所述各第三篩網沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，在所述各第三篩網橫截面上設置有2個或2個以上的第四篩網，所述各第四篩網相互平行且沿豎直方向依次排布，各第四篩網之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網距容器底面為3-8cm ;各第三篩網和第四篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，所述第三篩網至少高于液面0.5cm，第三篩網距容器底面為Ocm,示意圖見圖3。
[0028]本發明所舉示意圖只是為了便于理解篩網設置方式，并不對其形狀、數量、高度等起限定作用，其中篩網數量可根據容器的體積合理設置，本發明示意圖均以2個為例。
[0029]更優選地，所述設置篩網的方式具體為:
[0030]設置2個第一篩網，所述2個第一篩網相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第一篩網的中心位于同一豎直軸線上，各第一篩網之間相距3-8cm，各第一篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網距容器底面為3-8cm，示意圖見圖1 ;
[0031]或，
[0032]設置2個第二篩網，所述2個第二篩網沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，所述2個第二篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，第二篩網至少高于液面
0.5cm,第二篩網距容器底面為Ocm,不意圖見圖2 ；
[0033]或，
[0034]設置2個第三篩網，所述2個第三篩網沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，在所述2個第三篩網橫截面上設置有2個第四篩網，所述2個第四篩網相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第四篩網的中心位于同一豎直軸線上，各第四篩網之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網距容器底面為3-8cm ;各第三篩網和第四篩網側邊緣距容器內側壁距離≤1cm，所述第三篩網至少高于液面0.5cm，第三篩網距容器底面為0cm，示意圖見圖3。
[0035]作為優選，本發明所述篩網為不銹鋼篩網、塑料篩網、棉布篩網、陶瓷篩網或硅膠篩網。
[0036]作為優選，本發明所述篩網網格大小≤18目。
[0037]作為優選，本發明所述篩網網格形狀為方形或圓形。
[0038]作為優選，本發明所述篩網為圓形或矩形。
[0039]在本發明所述方法和未安裝篩網的常規培養方法的對比試驗中，保證其他所有培養條件一致，僅存在設置篩網和未設置篩網的區別，結果顯示，本發明所述方法在培養過程中，負變異率為0，而對照的方法負變異率在28-60%，細菌纖維素產量也得到顯著提高。
[0040]由以上技術方案可知，本發明針對葡糖醋桿菌在培養時易出現負變異菌株的問題，通過安裝篩網這種簡便的方式，讓菌體產生纖維素時，可附著于篩網上，既避免了負變異菌株的出現，同時又提高了纖維素產量，能夠廣泛應用于葡糖醋桿菌的培養中。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1所示為本發明篩網設置方式示意圖；其中h即表示頂層第一篩網距液面的距離，也表示各第一篩網之間的距離，d表示各第一篩網側邊緣距容器內側壁的距離；
[0042]圖2所示為本發明篩網設置方式示意圖；其中，h表示第二篩網高于液面的高度，d表示各第二篩網側邊緣距容器內側壁的距離；
[0043]圖3所示為本發明篩網設置方式示意圖；其中，h表示第三篩網高于液面的高度，d表示各第三篩網和第四篩網側邊緣距容器內側壁的距離；
[0044]圖4所示為負變異菌株和正常菌株的對比圖，其中箭頭所指為負變異菌株。【具體實施方式】
[0045]本發明公開了一種培養葡糖醋桿菌的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都 被視為包括在本發明。本發明所述方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0046]以下就本發明所提供的一種培養葡糖醋桿菌的方法做進一步說明。
[0047]實施例1:靜置培養
[0048]液體液體培養基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27gNa2HP04、
0.115g 朽1 樣酸，121 °C，15min 滅菌。
[0049]菌種活化:挑取固體培養基上的葡糖醋桿菌于50mL種子培養液中，30°C靜置培養4d。
[0050]種子液制備:菌種活化液按5% (v/v)的接種量轉接于IOOmL液體培養液，30°C靜置培養4d。
[0051]靜置培養生產:種子液按5% (v/v)的接種量轉接于800mL液體培養液，30°C，4d，以不安裝篩網作對照，每個實驗重復3次。
[0052]此處采用的篩網結構如圖1所示，具體設置方式如下描述: [0053]設置2個第一篩網，所述2個第一篩網相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第一篩網的中心位于同一豎直軸線上，各第一篩網之間相距3-8cm(3次重復試驗分別為3Cm、5Cm、8Cm)， 各第一篩網側邊緣距容器內側壁距離< lcm(3次重復試驗分別為1cm、
0.5cm、0.2cm),位于頂層的第一篩網距液面距離為3_8cm(3次重復試驗分別為3cm、5cm、8cm),位于底層的第一篩網距容器底面為3-8cm(3次重復試驗分別為3cm、5cm、8cm)。
[0054]分析方法:
[0055]纖維素產量分析:篩網上的纖維素用鑷子剝取，沒有篩網中的纖維素通過16層紗布過濾后獲取，置于80°C，0.lmol/L NaOH溶液中，維持2h，冷卻后用0.lmol/L HCl中和、自來水充分洗滌，在80°C下干燥至恒重，稱重。
[0056]負變異株率:將種子液取lmL，加入9mL無菌0.85%生理鹽水，稀釋至一定濃度，取
0.1mL稀釋液涂布于固體平板上，置于30°C靜置培養6d，計數，負變異率=負變異株菌落數/總菌落數(以百分率表示)。負變異株呈現個體變大、粘稠狀(見圖4箭頭所指菌株)，與野生型菌株的菌落形態明顯不同。
[0057]結果如表1所示。
[0058]表1篩網對葡糖醋桿菌靜置培養中負變異率的控制及BC產量的影響
[0059]
【權利要求】
1.一種培養葡糖醋桿菌的方法，其特征在于，將保存在固體培養基上的葡糖醋桿菌用液體培養基依次進行菌種活化、種子液制備，然后種子液轉接到新鮮的液體培養基中進行產纖維素培養，同時在培養容器內設置篩網。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述產纖維素培養為靜置培養、振蕩培養、氣升式培養或振蕩結合氣升式培養。
3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述設置篩網的方式具體為: 設置2個或2個以上第一篩網，所述各第一篩網相互平行且沿豎直方向依次排布，各第一篩網之間相距3-8cm，各第一篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網距容器底面為3-8cm ； 或， 設置2個或2個以上第二篩網，所述各第二篩網沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，各第二篩網側 邊緣距容器內側壁距離< 1cm，第二篩網至少高于液面0.5cm，第二篩網距容器底面為Ocm ； 或， 設置2個或2個以上第三篩網，所述各第三篩網沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，在所述各第三篩網橫截面上設置有2個或2個以上的第四篩網，所述各第四篩網相互平行且沿豎直方向依次排布，各第四篩網之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網距容器底面為3-8cm ;各第三篩網和第四篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，所述第三篩網至少高于液面0.5cm，第三篩網距容器底面為0cm。
4.根據權利要求3所述方法，其特征在于，所述設置篩網的方式具體為: 設置2個第一篩網，所述2個第一篩網相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第一篩網的中心位于同一豎直軸線上，各第一篩網之間相距3-8cm，各第一篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網距容器底面為3_8cm ； 或， 設置2個第二篩網，所述2個第二篩網沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，所述2個第二篩網側邊緣距容器內側壁距離< 1cm，第二篩網至少高于液面0.5cm,第二篩網距容器底面為Ocm ； 或， 設置2個第三篩網，所述2個第三篩網沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，在所述2個第三篩網橫截面上設置有2個第四篩網，所述2個第四篩網相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第四篩網的中心位于同一豎直軸線上，各第四篩網之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網距容器底面為3-8cm ;各第三篩網和第四篩網側邊緣距容器內側壁距離≤1cm，所述第三篩網至少高于液面0.5cm,第三篩網距容器底面為0cm。
5.根據權利要求1-4任意一項所述方法，其特征在于，所述篩網為不銹鋼篩網、塑料篩網、棉布篩網、陶瓷篩網或硅膠篩網。
6.根據權利要求1-4任意一項所述方法，其特征在于，所述篩網網格大小>18目。
7.根據權利要求1-4任意一項所述方法，其特征在于，所述篩網網格形狀為方形或圓形。
8.根據權利要求1-4任意一項所述方法，其特征在于，所述篩網為圓形或矩形。
【文檔編號】C12R1/01GK103966140SQ201410208851
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月16日 優先權日:2014年5月16日
【發明者】王志國, 王錫彬 申請人:海南大學