一種由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的方法?，F(xiàn)有的6-氨基青霉烷酸的制備方法存在環(huán)境污染大，能耗消耗高，產(chǎn)品收率低等技術(shù)不足，為了克服上述技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的方法，該方法避免了乙酸丁酯和正丁醇等有機(jī)溶劑的使用，提高了產(chǎn)品的收率，同時降低了制備過程中能量消耗，是一種綠色節(jié)能的6-氨基青霉烷酸生產(chǎn)方法，非常適合在工業(yè)上推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]6-氨基青霉燒酸(6-aminopenicillanic acid, 6-APA)為白色片狀結(jié)晶，是合成各種半合成青霉素的重要中間體，用途很廣。以此為原料進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，接上不同結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈，可以制造出對青霉素耐藥菌敏感、抗菌譜更廣的新的半合成青霉素，如氨芐青霉素，羥氨芐青霉素，苯氧甲基青霉素，以及其它的具有更寬抗菌譜的各種半合成青霉素。目前國內(nèi)6-APA的年產(chǎn)量超過30000噸。
[0003]目前工業(yè)上去除青霉素側(cè)鏈裂解成6-APA，主要有微生物酶催化裂解法和化學(xué)裂解法。隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，采用固定化酶或固定化細(xì)胞生產(chǎn)6-APA，不僅工藝大為簡化，經(jīng)濟(jì)效益明顯，且可得到純度較高的6-APA。近年來酶法逐漸成為工業(yè)上生產(chǎn)6-APA的主流。 [0004]化學(xué)裂解法:用于工業(yè)生產(chǎn)的化學(xué)裂解的工藝路線是:在極低的溫度下，先將青霉素的羧基轉(zhuǎn)變成硅酯保護(hù)起來，再使側(cè)鏈上的酰胺活化，通過形成青霉素取代亞胺醚衍生物，然后在極溫和的條件下，選擇性地水解斷鏈成6-APA。
[0005]生物酶催化法:在自然界中細(xì)菌、放線菌、酵母和高等真菌都可以產(chǎn)生青霉素酰化酶。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，在酶的菌株改良、發(fā)酵自動化、酶的大規(guī)?；?、酶的固定化、反應(yīng)器設(shè)計、后續(xù)工藝等各個領(lǐng)域同時取得進(jìn)展，青霉素酰化酶用于6APA的制備已經(jīng)非常成熟。固定化酶可以重復(fù)使用，容易從反應(yīng)液中分離，可以有效防止對產(chǎn)物的蛋白污染和微生物污染等。在反應(yīng)器內(nèi)加入一定量的固定化酶，把一定濃度的青霉素溶液與固定化酶在攪拌的作用下，使酶和青霉素充分接觸。在酶的催化下，青霉素不斷的裂解成6-APA和苯乙酸，溶液的PH值下降，補(bǔ)加一定濃度的氨水使pH值維持在8.0，當(dāng)pH值不在下降并維持10分鐘，到達(dá)反應(yīng)終點。上述的裂解液中加入一定的甲醇，用鹽酸調(diào)PH值至4.2，使6-APA結(jié)晶析出，然后過濾、干燥得到成品。
[0006]直通工藝流程:現(xiàn)有的工藝是把青霉素鉀鹽成品溶解成水溶液，然后裂解。而青霉素鉀鹽是從水溶液中提取結(jié)晶出來的。為進(jìn)一步縮短工藝流程，降低成本和能耗，不再使青霉素結(jié)晶出來。在青霉素發(fā)酵液的前處理工藝中作適當(dāng)?shù)墓に嚫倪M(jìn)，得到一定濃度和純凈度的RB液(青霉素提取過程中的水溶液)進(jìn)行裂解。并對裂解液萃取，然后結(jié)晶得到6-APA。這樣大大簡化了工藝流程。
[0007]以上三種工藝，是隨著生物技術(shù)的發(fā)展和青霉素提取工藝的不斷改進(jìn)等技術(shù)進(jìn)步的結(jié)果。其中，化學(xué)法反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，需要使用多種昂貴的化學(xué)試劑，并要求在-40°C極低的溫度下反應(yīng)。另一方面產(chǎn)生環(huán)保難處理的高濃度的有機(jī)廢水。因此化學(xué)法基本淘汰。生物法使用固定酶裂解，固定酶能反復(fù)使用上千次，收率也比化學(xué)法高3%~5%，因此在很大程度水提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本，并減輕了環(huán)保壓力。直通工藝法是在改進(jìn)青霉素提取工藝的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步簡化流程，省去青霉素鉀鹽結(jié)晶工段，減少了蒸汽的用量，降低了溶媒消耗；另一方面也減少了高濃度的有機(jī)廢水的排放量，在很大程度上減輕了環(huán)保壓力。
[0008]上述直通工藝由RB起始的6-APA制備方法仍存在較多缺點:在生產(chǎn)過程中大量使用乙酸丁酯、正丁醇等有機(jī)溶劑，對環(huán)境造成危害，過程步驟長，涉及到上述溶劑的精餾回收過程，消耗大量的蒸汽、冷卻水等能源。如中國專利申請CN101735243A公開了一種直通式6-氨基青霉烷酸制備方法，它包括以下步驟:a、將青霉素發(fā)酵液過濾、酸化、丁醇提取濃縮、脫色得青霉素丁酯提取液；b、青霉素丁酯提取液經(jīng)堿性溶液反萃，得青霉素鹽水溶液；C、在真空減壓狀態(tài)下，將青霉素鹽水溶液連續(xù)灌入脫酯塔，丁酯從青霉素水溶液中轉(zhuǎn)入氣相，脫酯后的青霉素水溶液從塔底排出減壓系統(tǒng)、進(jìn)入帶有冷卻裝置的儲罐，冷卻后備用；d、將冷卻后的脫酯青霉素鹽水溶液注入青霉素酰化酶反應(yīng)罐中進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化后，加入6-APA晶種，養(yǎng)晶，結(jié)晶、干燥。該制備方法中步驟繁瑣，制備過程中對條件要求苛刻，能耗需求大，且制備過程中使用了大量的有機(jī)溶劑，造成了較大的環(huán)保壓力。中國專利申請CN102925526A公開了一種6-氨基青霉烷酸的制備方法，它包括以下步驟:a、青霉素發(fā)酵液經(jīng)過超濾膜分離和納濾膜濃縮得濃縮濾液；b、將濃縮濾液置于反應(yīng)罐中，加入固定化青霉素?；?.5-5MU/m3濃縮濾液，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得6-氨基青霉烷酸轉(zhuǎn)化液；c、所述轉(zhuǎn)化液經(jīng)活性炭脫色和過濾后得6-氨基青霉烷酸濾液；d、向c步工序所述的濾液中加入晶種，養(yǎng)晶，加入結(jié)晶劑，結(jié)晶、過濾、洗滌、干燥。該制備方法相對于專利申請CN101735243A —定程度上減少了有機(jī)溶劑的使用，但該方法為了防止青霉素發(fā)酵液在常溫下降解，其超濾和納濾工序使用-1o°c冷媒控制溫度，但即便如此，也有相當(dāng)部分的青霉素發(fā)生降解。因此，該制備方法的技術(shù)缺點為膜過濾通量較低，能耗較大，產(chǎn)品的收率低且制備成本較高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種工藝簡單、安全節(jié)能、產(chǎn)品收率高的6-氨基青霉烷酸直通工藝制備方法。本發(fā)明所述的一種新的由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的新方法，避免了乙酸丁酯和正丁醇等有機(jī)溶劑的使用以及由此有機(jī)溶劑造成的環(huán)境污染，提高了產(chǎn)品的收率，同時節(jié)約了有機(jī)溶劑精餾回收時消耗的能源，是一種綠色節(jié)能的6-氨基青霉烷酸生產(chǎn)方法。
[0010]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實施:
[0011]一種由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的方法，其包括如下步驟:
[0012]a、向青霉素發(fā)酵液中加入青霉素?；高M(jìn)行裂解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到包含6-氨基青霉烷酸、苯乙酸和青霉素菌絲的混合液；
[0013]b、將混合液依次經(jīng)過微濾、超濾分離除去青霉素菌絲和大分子物質(zhì)，將溶液經(jīng)過納濾濃縮得到6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液；
[0014]C、將6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液進(jìn)行脫色處理后，使用樹脂將濃縮混合溶液中的苯乙酸吸附分離，得到6-氨基青霉烷酸的水溶液；
[0015]d、調(diào)節(jié)6-氨基青霉烷酸的水溶液的pH值至6-氨基青霉烷酸的等電點即可得到6-氨基青霉烷酸結(jié)晶，過濾洗滌干燥后即可得到本發(fā)明所述的6-氨基青霉烷酸。其中所述的6-氨基青霉烷酸的等電點為4.3。[0016]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述裂解反應(yīng)的溫度為26_38°C，反應(yīng)過程中發(fā)酵液的PH為7.0-8.5。裂解反應(yīng)所需要的青霉素?；赣昧扛鶕?jù)其活性添加，反應(yīng)過程中使用氨水調(diào)節(jié)pH，當(dāng)停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時,反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)時間一般在1-3小時，轉(zhuǎn)化率應(yīng)高達(dá)95-98%。
[0017]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述微濾、超濾和納濾中所使用的過濾膜為有機(jī)膜、陶瓷膜或金屬膜，其中超濾膜的精度根據(jù)發(fā)酵液的質(zhì)量和膜的通量進(jìn)行選擇，優(yōu)選為截留分子量為3000-50000道爾頓的膜組。所述的納濾膜的截流分子量為100~260道爾頓。上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述的6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液中6-氨基青霉烷酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5% -15%。
[0018]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述脫色處理中脫色劑為活性炭、三氧化二鋁或其組合。上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述樹脂為超高交聯(lián)樹脂或者大孔吸附樹脂。其中，所述的超高交聯(lián)樹脂型號為AH、NDa-150中的一種，所述大孔吸附樹脂的型號為Amberlite XAD-4。
[0019]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，所述步驟d包括如下步驟:控制6-氨基青霉烷酸的水溶液控制在10~25°C，使用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至6-氨基青霉烷酸的等電點，得到6-氨基青霉烷酸的結(jié)晶，過濾、洗滌、干燥。
[0020]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，還可以包括苯乙酸脫吸附步驟，其中所述的苯乙酸脫吸附包括如下步驟:使用添加乙醇或丙酮的氫氧化鈉溶液洗滌吸附有苯乙酸的樹脂使苯乙酸脫吸附。這樣樹脂得到再生，同時得到的苯乙酸鈉經(jīng)過進(jìn)一步精制可以作為原料應(yīng)用于青 霉素發(fā)酵生產(chǎn)中。
[0021]本發(fā)明所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法中，整個過程沒有使用乙酸丁酯和正丁醇等有機(jī)溶劑，從而避免了這些有機(jī)溶劑揮發(fā)造成的環(huán)境污染，同時避免了回收有機(jī)溶劑消耗的蒸汽、冷卻水等能源動力。青霉素發(fā)酵液在常溫下易降解，專利申請201210481273.3在超濾和納濾工序，會利用_10°C冷媒控制溫度，這就造成膜過濾通量較低,能耗大,收率低,成本高。而本發(fā)明通過酶解,將青霉素裂解為相對穩(wěn)定的6-APA和PAA，就可以做到在常溫工況下完成膜過濾，提高了膜通量，提高了產(chǎn)品的收率，降低能耗和成本。
[0022]本發(fā)明所述制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)優(yōu)勢:
[0023]1.現(xiàn)有的直通工藝生產(chǎn)6-APA制備方法的后期使用大量使用乙酸丁酯、正丁醇等有機(jī)溶劑，不僅工藝繁瑣復(fù)雜，而且具有很大的環(huán)保壓力，本發(fā)明通過膜過濾技術(shù)除去菌絲體和大分子雜質(zhì)后，使用等電點結(jié)晶方法獲得目標(biāo)產(chǎn)品，其步驟簡單，不產(chǎn)生環(huán)境污染產(chǎn)物。且采用本方法獲得的目標(biāo)產(chǎn)品的純度不低于98.5%收率為89%以上，高于現(xiàn)有的直通工藝生產(chǎn)的6-APA的純度或收率。
[0024]2.專利申請201210481273.3在超濾和納濾工序中利用_10°C冷媒控制溫度，然后使用青霉素?；噶呀?，這樣不僅造成生產(chǎn)過程能耗消耗大，收率低，成本提高，而且由于青霉素的不穩(wěn)定性，致使在膜過濾時發(fā)酵液中產(chǎn)生大量雜質(zhì)，進(jìn)而降低了 6-APA的純度和收率。本發(fā)明在過濾之前即完成青霉素的裂解反應(yīng)，使得膜過濾的通量顯著提升，產(chǎn)品的純度和收率明顯提高，且本發(fā)明過濾過程完全在常溫下進(jìn)行，節(jié)能環(huán)保。
[0025]3.本發(fā)明在分離苯乙酸和6-APA的混合液中采用特定選擇性的專屬樹脂吸附苯乙酸，避免了溶劑萃取過程。樹脂吸附苯乙酸的截留率在80%以上，同時吸附部分雜質(zhì)。吸附有苯乙酸的樹脂經(jīng)過簡單處理后即可完成苯乙酸回收和樹脂再生，苯乙酸可重新用于青霉素的生產(chǎn)中，再生后的樹脂可以重復(fù)使用，因而降低了本發(fā)明制備方法的運(yùn)行成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1本發(fā)明所述6-氨基青霉烷酸的制備工藝圖。
【具體實施方式】
[0027]圖1為本發(fā)明所述6-氨基青霉烷酸的制備工藝圖。如圖所示，其制備工藝包括如下步驟:
[0028]a、向青霉素發(fā)酵液中加入青霉素?；高M(jìn)行裂解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到包含6-氨基青霉烷酸、苯乙酸和青霉素菌絲的混合液；
[0029]b、將混合液依次經(jīng)過微濾、超濾分離除去青霉素菌絲和大分子物質(zhì)，將溶液經(jīng)過納濾濃縮得到6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液；
[0030]C、將6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液進(jìn)行脫色處理后，使用樹脂將濃縮混合溶液中的苯乙酸吸附分離，得到6-氨基青霉烷酸的水溶液；
[0031]d、調(diào)節(jié)6-氨基青霉烷酸的水溶液的pH值至6-氨基青霉烷酸的等電點即可得到6-氨基青霉烷酸結(jié)晶，過濾洗滌干燥后即可得到本發(fā)明所述的6-氨基青霉烷酸。
[0032]為了進(jìn)一步描述 本發(fā)明，以下通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但所述實施例并不以任何方式限制本發(fā)明。
[0033]實施例1本發(fā)明所述6-氨基青霉烷酸的制備方法
[0034]將濃度為100000u/mL的青霉素發(fā)酵液1000mL放置在溫度控制在28~30°C的攪拌反應(yīng)器中，攪拌。待發(fā)酵液的溫度達(dá)到28~30°C時，加入青霉素?；M(jìn)行裂解，并在裂解過程中不斷滴加濃度為10%的氨水，將反應(yīng)器中pH值維持在7.0左右，當(dāng)停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時，反應(yīng)結(jié)束。
[0035]將裂解反應(yīng)后的混合液依次經(jīng)過10微米的過濾器、I微米的過濾器除去固體的青霉素菌絲。然后再將混合溶液依次經(jīng)過截留分子量為30000-50000道爾頓的超濾器和截留分子量為3000-5000道爾頓的超濾器，除去大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
[0036]將除雜后的混合溶液經(jīng)過截留分子量為100~260道爾頓的納濾器，使混合溶液得到濃縮，濃縮至6-APA的質(zhì)量濃度為5%。
[0037]利用活性炭、三氧化二鋁等將濃縮液脫色，得到脫色后的混合液。
[0038]利用特定選擇吸附性的超高交聯(lián)樹脂AH將脫色后的混合液中的苯乙酸吸附，經(jīng)固液分離，分別得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的樹脂。
[0039]將6-APA的水溶液轉(zhuǎn)移至結(jié)晶器中，結(jié)晶器內(nèi)溫度控制在10~12°C，向結(jié)晶器內(nèi)加氨水，逐漸調(diào)節(jié)結(jié)晶器內(nèi)溶液PH值至6-APA的等電點(PI = 4.3)，得到6-APA的結(jié)晶，過濾、洗滌、干燥后得到本發(fā)明產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所述產(chǎn)品中6-APA的純度為98.5%，收率為
89.7%。
[0040]吸附有苯乙酸的樹脂，經(jīng)過添加乙醇或丙酮的氫氧化鈉溶液洗滌，使吸附的苯乙酸脫附，樹脂得到再生，使樹脂得以重復(fù)使用，同時得到苯乙酸鈉，經(jīng)過進(jìn)一步精制可以作為原料應(yīng)用于青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中。
[0041]實施例2本發(fā)明所述6-氨基青霉烷酸的制備方法
[0042]將濃度為100000u/mL的青霉素發(fā)酵液1000mL放置在溫度控制在30~32°C的攪拌反應(yīng)器中，攪拌。待發(fā)酵液的溫度達(dá)到30~32°C時，加入青霉素酰化，進(jìn)行裂解，并在裂解過程中不斷滴加濃度為5%的氨水，將反應(yīng)器中pH值維持在7.4左右，當(dāng)停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時，反應(yīng)結(jié)束。
[0043]將裂解反應(yīng)后的混合液依次經(jīng)過10微米的過濾器、I微米的過濾器除去固體的青霉素菌絲。然后再將混合溶液依次經(jīng)過截留分子量為30000-50000道爾頓的超濾器和截留分子量為3000-5000道爾頓的超濾器，除去大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
[0044]將除雜后的混合溶液經(jīng)過截留分子量為100~260道爾頓的納濾器，使混合溶液得到濃縮，濃縮至6-APA的質(zhì)量濃度為15%。
[0045]利用活性炭、三氧化二鋁等將濃縮液脫色，得到脫色后的混合液。
[0046]利用特定選擇吸附性的超高交聯(lián)樹脂NDa-150將脫色后的混合液中的苯乙酸吸附，經(jīng)固液分離，分別得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的樹脂。
[0047]將6-APA的水溶液轉(zhuǎn)移至結(jié)晶器中，結(jié)晶器內(nèi)溫度控制在15~18°C，向結(jié)晶器內(nèi)加氨水，逐漸 調(diào)節(jié)結(jié)晶器內(nèi)溶液PH值至6-APA的等電點(PI = 4.3)，得到6-APA的結(jié)晶，過濾、洗滌、干燥后得到本發(fā)明產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所述產(chǎn)品中6-APA的純度為99.1%，收率為
90.4%。
[0048]吸附有苯乙酸的樹脂，經(jīng)過添加乙醇或丙酮的氫氧化鈉溶液洗滌，使吸附的苯乙酸脫附，樹脂得到再生，使樹脂得以重復(fù)使用，同時得到苯乙酸鈉，經(jīng)過進(jìn)一步精制可以作為原料應(yīng)用于青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中。
[0049]實施例3本發(fā)明所述6-氨基青霉烷酸的制備方法
[0050]將濃度為100000u/mL的青霉素發(fā)酵液1000mL放置在溫度控制在34~36°C的攪拌反應(yīng)器中，攪拌。待發(fā)酵液的溫度達(dá)到34~36°C時，加入青霉素?；?，進(jìn)行裂解，并在裂解過程中不斷滴加濃度為8%的氨水，將反應(yīng)器中pH值維持在8.0左右，當(dāng)停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時，反應(yīng)結(jié)束。
[0051]將裂解反應(yīng)后的混合液依次經(jīng)過10微米的過濾器、I微米的過濾器除去固體的青霉素菌絲。然后再將混合溶液依次經(jīng)過截留分子量為30000-50000道爾頓的超濾器和截留分子量為3000-5000道爾頓的超濾器，除去大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
[0052]將除雜后的混合溶液經(jīng)過截留分子量為100~260道爾頓的納濾器，使混合溶液得到濃縮，濃縮至6-APA的質(zhì)量濃度為10%。
[0053]利用活性炭、三氧化二鋁等將濃縮液脫色，得到脫色后的混合液。
[0054]利用特定選擇吸附性的大孔吸附樹脂Amberlite XAD-4將脫色后的混合液中的苯乙酸吸附，經(jīng)固液分離，分別得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的樹脂。
[0055]將6-APA的水溶液轉(zhuǎn)移至結(jié)晶器中，結(jié)晶器內(nèi)溫度控制在20~23°C，向結(jié)晶器內(nèi)加氨水，逐漸調(diào)節(jié)結(jié)晶器內(nèi)溶液PH值至6-APA的等電點(PI = 4.3)，得到6-APA的結(jié)晶，過濾、洗滌、干燥后得到本發(fā)明產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所述產(chǎn)品中6-APA的純度為98.7%，收率為
91.5%。
[0056]吸附有苯乙酸的樹脂，經(jīng)過添加乙醇或丙酮的氫氧化鈉溶液洗滌，使吸附的苯乙酸脫附，樹脂得到再生，使樹脂得以重復(fù)使用，同時得到苯乙酸鈉，經(jīng)過進(jìn)一步精制可以作為原料應(yīng)用于青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中。
[0057]實施例4本發(fā)明所述6-氨基青霉烷酸的制備方法
[0058]將濃度為100000u/mL的青霉素發(fā)酵液1000mL放置在溫度控制在35~38°C的攪拌反應(yīng)器中，攪拌。待發(fā)酵液的溫度達(dá)到35~38°C時，加入青霉素酰化，進(jìn)行裂解，并在裂解過程中不斷滴加濃度為6%的氨水，將反應(yīng)器中pH值維持在8.5左右，當(dāng)停止加入氨水后20min內(nèi)反應(yīng)器中pH值保持不變時，反應(yīng)結(jié)束。
[0059]將裂解反應(yīng)后的混合液依次經(jīng)過10微米的過濾器、I微米的過濾器除去固體的青霉素菌絲。然后再將混合溶液依次經(jīng)過截留分子量為30000-50000道爾頓的超濾器和截留分子量為3000-5000道爾頓的超濾器，除去大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
[0060]將除雜后的混合溶液經(jīng)過截留分子量為100~260道爾頓的納濾器，使混合溶液得到濃縮，濃縮至6-APA的質(zhì)量濃度為12%。
[0061]利用活性炭、三氧化二鋁等將濃縮液脫色，得到脫色后的混合液。
[0062]利用特定選擇吸附性的超高交聯(lián)樹脂AH等將脫色后的混合液中的苯乙酸吸附，經(jīng)固液分離，分別得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的樹脂。
[0063]將6-APA的水溶液轉(zhuǎn)移至結(jié)晶器中，結(jié)晶器內(nèi)溫度控制在18~20°C，向結(jié)晶器內(nèi)加氨水，逐漸調(diào)節(jié)結(jié)晶器內(nèi)溶液PH值至6-APA的等電點(PI = 4.3)，得到6-APA的結(jié)晶，過濾、洗滌、干燥后得到本發(fā)明產(chǎn)品。經(jīng)檢測，所述產(chǎn)品中6-APA的純度為98.9%，收率為89.3%。
[0064]吸附有苯乙酸的樹脂，經(jīng)過添加乙醇或丙酮的氫氧化鈉溶液洗滌，使吸附的苯乙酸脫附，樹脂得到再生，使樹脂得以重復(fù)使用，同時得到苯乙酸鈉，經(jīng)過進(jìn)一步精制可以作為原料應(yīng)用于青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中。
[0065]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種由青霉素發(fā)酵液直接制備6-氨基青霉烷酸的方法，其包括如下步驟: a、向青霉素發(fā)酵液中加入青霉素?；高M(jìn)行裂解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到包含6-氨基青霉烷酸、苯乙酸和青霉素菌絲的混合液； b、將混合液依次經(jīng)過微濾、超濾分離除去青霉素菌絲和大分子物質(zhì)，將溶液經(jīng)過納濾濃縮得到6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液； C、將6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液進(jìn)行脫色處理后，使用樹脂將濃縮混合溶液中的苯乙酸吸附分離，得到6-氨基青霉烷酸的水溶液； d、調(diào)節(jié)6-氨基青霉烷酸的水溶液的pH值至6-氨基青霉烷酸的等電點即可得到6-氨基青霉烷酸結(jié)晶，過濾洗滌干燥后即可得到本發(fā)明6-氨基青霉烷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，其特征在于，所述裂解反應(yīng)的溫度為26-38°C，反應(yīng)過程中發(fā)酵液的pH為7.0-8.5，裂解反應(yīng)的反應(yīng)時間為l_3h。
3.如權(quán)利要求1所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，其特征在于，所述微濾、超濾和納濾中所使用的過濾膜為有機(jī)膜、陶瓷膜或金屬膜。
4.如權(quán)利要求1或3所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，其特征在于，所述超濾中過濾膜的截留分子量為3000—50000道爾頓。
5.如權(quán)利要求1或3所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，所述的納濾中過濾膜的截流分子量為100~260道爾頓。
6.如權(quán)利要求1所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，其特征在于，所述的6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的濃縮混合溶液中6-氨基青霉烷酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5% -15%。
7.如權(quán)利要求1所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，其特征在于，所述脫色處理中脫色劑為活性炭、三氧化二鋁或其組合，所述的樹脂為超高交聯(lián)樹脂或者大孔吸附樹脂。
8.如權(quán)利要求7所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，所述的超高交聯(lián)樹脂型號為AH、NDa-150中的一種，所述大孔吸附樹脂的型號為Amberlite XAD-4。
9.如權(quán)利要求1所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，其特征在于，所述步驟d包括如下步驟:控制6-氨基青霉烷酸的水溶液控制在10~25°C，使用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至6-APA的等電點，得到6-APA的結(jié)晶，過濾、洗滌、干燥；其中，所述的6-氨基青霉烷酸的等電點為4.3。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的6-氨基青霉烷酸的制備方法，其特征在于，其還包括苯乙酸脫吸附步驟，其中所述的苯乙酸脫吸附包括如下步驟:使用添加乙醇或丙酮的氫氧化鈉溶液洗滌吸附有苯乙酸的樹脂。
【文檔編號】C12P37/06GK104004002SQ201410208804
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】王京, 劉秀忠, 陳釗, 史靜宏, 李惠敏, 馬忠青, 張欣巧, 姚振勇, 劉 東 申請人:河北天俱時生物科技有限公司