一種調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用，涉及一種調(diào)控抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供一種調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用，通過對(duì)該miRNA及其靶基因的研究，在楊樹抗病育種中具有重要的生物學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。其前體序列如SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA可提高小黑楊對(duì)銹病的抗性，用于抗病育種。通過基因工程手段對(duì)該miRNA的研究可為深入研究調(diào)控楊樹抗銹病侵染機(jī)理和提高小黑楊對(duì)銹病的抗性奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】-種調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNAs(miRNAs)是具有調(diào)控基因表達(dá)作用的內(nèi)源非編碼小RNA(smallRNAs)， 它們主要是通過結(jié)合祀基因 mRNA或祀基因 mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region, 3'-UTR)來降解該基因 mRNA或者阻礙其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平控制基因表達(dá)。最早發(fā)現(xiàn) 的miRNA是在線蟲中觀察到的與靶基因轉(zhuǎn)錄物的3'-UTR互補(bǔ)的長(zhǎng)18-22nt的RNA分子，包 括lin-4和let-7基因，線蟲的發(fā)育由這些RNA基因所調(diào)控。隨后miRNA被發(fā)現(xiàn)在包括從線 蟲到果蠅以及人的多種組織中存在,對(duì)植物miRNA的報(bào)導(dǎo)始于2002年。隨著現(xiàn)代生物技術(shù) 和分子生物學(xué)的發(fā)展，植物miRNA的發(fā)現(xiàn)數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)。目前，miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase中 已登記了 1160多條植物miRNA序列及相關(guān)信息。植物miRNA的發(fā)現(xiàn)及其在植物生長(zhǎng)發(fā)育和 脅迫應(yīng)答中的作用是植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物miRNAs主 要依靠與靶基因之間完全或近乎完全的互補(bǔ)配對(duì)切割靶基因或翻譯抑制實(shí)現(xiàn)其調(diào)控功能， 在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、生物及非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
[0003] 楊樹是重要的用材林樹種，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。由落葉松-楊柵銹 菌（Melampsoralarici-populina)引起的楊銹病是楊樹的主要病害之一。近年來，其為害 日趨嚴(yán)重。利用基因工程技術(shù)培育抗銹病楊樹品種是重要的防病手段。利用基因工程改 良楊樹抗病性依賴于對(duì)楊樹抗病相關(guān)基因及其調(diào)控元件的認(rèn)識(shí)。植物抗病反應(yīng)是多種生 理過程相互調(diào)控的綜合反應(yīng)。目前有關(guān)楊樹抗銹菌侵染的分子研究主要集中在一些直接 參與楊樹抗真菌侵染抗性效應(yīng)的功能基因和蛋白質(zhì)中，而忽略了導(dǎo)致諸多基因差異表達(dá)的 幕后操縱者，即這些防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是研究中的盲點(diǎn)。近年來發(fā)現(xiàn)植物 microRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答中具有重要的調(diào)控作用。如果逆向探尋上游的調(diào)節(jié)分 子，找到處于楊樹抗銹菌分子網(wǎng)絡(luò)中的"始作俑者"-microRNA，并對(duì)楊樹抗銹菌基因與其對(duì) 應(yīng)的microRNA調(diào)控過程進(jìn)行深入研究，或可揭示銹菌侵染過程中楊樹基因表達(dá)調(diào)控的完 整過程并為楊樹抗銹菌研究應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐開辟新的道路。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明提供一種調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所 /_J、1 〇
[0006] 上述調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA前體序列如SEQ ID NO :2所示。
[0007] 上述調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA可調(diào)控小黑楊對(duì)銹病的抗性，用于 抗病育種。
[0008] 本發(fā)明構(gòu)建落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina)侵染前后的小 黑楊（Populus simoniiXP.nigra)小RNA文庫，采用Illumina測(cè)序技術(shù)測(cè)序，獲得一條 新miRNA，命名為Pn-5p-310376_3，該miRNA在銹菌接種后表達(dá)上調(diào)（log2 = 12.64)。通 過構(gòu)建降解組，發(fā)現(xiàn)其祀基因?yàn)?NB-ARC(nucleotide binding inAPAF-1，plant disease resistance gene products andCED-4)抗性蛋白基因（Potri.014G002000. 1)，剪切位點(diǎn)為 752nt〇
[0009] 在銹菌侵染后表達(dá)量上調(diào)，表明該miRNA在小黑楊抗銹菌侵染過程中起作用。鑒 于該miRNA調(diào)控的靶基因?yàn)镹B-ARC抗性蛋白基因（NB-ARC抗性蛋白基因編碼含有核苷酸 結(jié)合位點(diǎn)的植物抗病蛋白），更進(jìn)一步說明該miRNA在楊樹抗病過程中起到關(guān)鍵作用。通過 對(duì)該miRNA及其靶基因的研究，在楊樹抗病育種中具有重要的生物學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià) 值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010] 圖1為調(diào)控小黑楊抗鎊囷侵染基因表達(dá)的miRNA如體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)圖；圖2為 實(shí)施例1中小黑楊葉片總RNA的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下的實(shí)施例便于更好的理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料及設(shè)備，如無特殊說明， 均通過市場(chǎng)購買直接獲得。
[0012] 本發(fā)明提供的調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA來源于小黑楊，命名為 Pn-5p-310376_3,其長(zhǎng)度為21nt，其前體序列和折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，如圖1所示， 屬于miRNA前體典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0013] 實(shí)施例1 :調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA的獲得，miRNA靶基因的鑒定 及miRNA功能驗(yàn)證。
[0014] (一）小黑楊RNA抽提及質(zhì)量鑒定：
[0015] 將落葉松-楊柵銹菌接種于小黑楊葉片，分別取接種落葉松-楊柵銹菌2hpi、 6hpi、12hpi、24hpi、3dpi、5dpi和7dpi共七組小黑楊葉片，分割成小塊，每組取100mg植 物組織置于經(jīng)DEPC處理的1. 5ml離心管中，并迅速置于液氮中冷凍備用。參照miRNeasy Kit (購買自QIAGEN公司）操作手冊(cè)提取各組小黑楊葉片總RNA，并將每組的RNA等比混 合。按照同樣的方法提取沒有接種落葉松-楊柵銹菌的小黑楊葉片總RNA。1%瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示，圖2中Rust+表示接種銹菌后的小黑楊葉片總RNA， Rust-表示未接種銹菌的小黑楊葉片總RNA，電泳條帶清晰，無拖尾模糊現(xiàn)象，28S條帶亮度 大于18S，其比值接近2:1。分別取1 μ 1RNA樣品用Eppendorf分光光度計(jì)測(cè)定0D280、0D260 和0D230值，0D260/280比值分別在1. 8-2. 0,0D260/230比值分別> 1. 8。說明所提取RNA 質(zhì)量較好。
[0016] 所述的落葉松-楊柵鎊菌（Melampsora larici-populina)于 2003 年 在《Quantitative inoculations of poplars with Melampsora larici-populina. European Journal of Plant Patho 1 ogy》（Μ. H. Pe i，C. Rui z，J. Harr i s，T. Hunter.，2003, 109:269-276.)中公開，由文章的作者 E H. Pei 惠贈(zèng)。
[0017] (二）小RNA文庫構(gòu)建及高通量測(cè)序：
[0018] 使用 Illumina Truseq Small RNA Preparation kit 試劑盒（購買自 Illumina 公 司，貨號(hào)為RS-200-0012)并參照其說明書分別構(gòu)建接種銹菌前后楊樹的小RNA文庫，構(gòu)建 好的文庫用Illumina GAIIX測(cè)序儀進(jìn)行高通量深度測(cè)序。
[0019] (三）降解組測(cè)序：
[0020] 提取接種銹菌前后楊樹的mRMA (含有polyA末端），連接含有3' Mmel位點(diǎn)的RNA 接頭，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA (反轉(zhuǎn)錄酶購買自Promegra公司，貨號(hào)A3801)，合成雙鏈 cDNA，Mmel酶切（Mmel酶購買自NEB公司，貨號(hào)R0637S)，連接dsDNA接頭，凝膠電泳純化， PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina GAIIX測(cè)序儀進(jìn)行高通量 深度測(cè)序。
[0021] (四）miRNA生物信息學(xué)分析
[0022] 采用ACGT101-miR v4. 2分析軟件對(duì)小RNA文庫測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，應(yīng)用Blast技 術(shù)分析篩選出miRNA。
[0023] 小RNA文庫測(cè)序結(jié)果表明，接種銹菌的文庫共測(cè)得9, 736, 262條raw序列，未接種 銹菌的文庫共測(cè)得8, 840, 983條raw序列。去除冗余序列后，接種銹菌的文庫共測(cè)得4, 070 條unique序列，未接種銹菌的文庫共測(cè)得3, 820條unique序列。侵染前后的兩個(gè)文庫共 得到 5, 135 條 unique miRNA。
[0024] 采用CleaveLand程序分析降解組數(shù)據(jù)，結(jié)合上一步篩選出的miRNA數(shù)據(jù)，進(jìn)行靶 基因預(yù)測(cè)。應(yīng)用Oligomap短閱讀框校準(zhǔn)器找出與降解組序列相匹配的mRNAs。對(duì)降解組 序列有價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)序列以NRPM(每百萬閱讀）在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比較除去冗余。再次應(yīng)用 Oligomap提取每個(gè)準(zhǔn)確配對(duì)降解組序列的mRNA的配對(duì)位點(diǎn)上游13個(gè)序列和下游13個(gè)序 列，組成一個(gè)26nt的mRNA，應(yīng)用EMBOSS包中的Needle程序得出與提供的小RNA庫中序列 相匹配的所有序列，然后根據(jù)植物miRNA/靶標(biāo)配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)列陣進(jìn)行評(píng)分。
[0025] 對(duì)所降解組進(jìn)行分析表明，總共獲得8, 409, 874raw序列，其中5, 077, 704unique reads可以在楊樹mRNA數(shù)據(jù)庫中找到相應(yīng)序列。進(jìn)一步結(jié)合miRNA數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析， 1，475miRNAs可以找到其對(duì)應(yīng)的靶基因。分別對(duì)這些靶基因進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： miRNA Pn_5p-310376_3 的革巴基因?yàn)?NB-ARC (nucleotide binding in APAF_l，plant disease resistance gene products and CED-4)抗性蛋白基因（Potri. 014G002000. 1)，剪切位點(diǎn)為 752nt〇
[0026] 比較接種前后的小RNA文庫測(cè)序結(jié)果可知，該miRNA Pn-5p-310376_3在銹菌接種 后（reads = 6)比接種前（reads = 0)表達(dá)量顯著上調(diào)（log2 = 12. 64)。
[0001] 序列表 <110>東北林業(yè)大學(xué) <120> -種調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA及其應(yīng)用 <160〉 2 <210> I <211>21 <212〉RNA <2\3> 八、iP〇pulm、itwniiXR nigra) <400> I uuuucaauaa uugcaucaau a 21 <210>2 <211> 164 <212>RNA <2 1 3> 小·楊（/)(7/川/"'V 'S7'"?(7"/+ / A7)_ ) <400> 2 ggttgctttg aaagtttata attgattttt agactttaat atttcaataa ttgcatcaat 60 atalacttgt aatatattla gttttattig acaatgagta tacattaitt gatgltggat 120 taatgaaatt gtgttttaat taattaatga ttaacaaagc atta 164
【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA的前體序列，其特征 在于其序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的調(diào)控小黑楊抗銹菌侵染基因表達(dá)的miRNA的應(yīng)用，其特征在于 該miRNA在小黑楊對(duì)銹病的抗性育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104059910SQ201410208679
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】王峰, 李丹蕾, 王志英, 鄒莉, 陳俏麗 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)