對綠盲蝽進行rna干擾的注射方法及其在基因篩選上的應用的制作方法

對綠盲蝽進行rna干擾的注射方法及其在基因篩選上的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及對綠盲蝽進行RNA干擾的注射方法及其在基因篩選上的應用，屬于生物【技術領域】。一種對綠盲蝽進行RNA干擾的注射方法，其特征在于：注入dsRNA的注射位置為后胸與腹部節間膜的最外側。首次建立了用于綠盲蝽基因功能研究的RNAi平臺；創造性采用注射法對綠盲蝽進行RNAi時的最佳注射位置和特定dsRNA濃度下的最佳注射體積進行確定，檢測并記錄注射后綠盲蝽表現型的改變。該方法為篩選新的抗蟲基因提供新的技術手段和平臺，為發展抗綠盲蝽轉基因作物提供新的基因資源進而依此達到發展經濟有效，環境友好的新的方法來控制綠盲蝽的危害。
【專利說明】對綠盲蝽進行RNA干擾的注射方法及其在基因篩選上的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及對綠盲蝽進行RNAi的注射方法以及利用該方法在篩選綠盲蝽生長發育關鍵基因上的應用。
【背景技術】
[0002]隨著Bt棉花的大面積種植，棉鈴蟲的為害得到了有效地控制，然而綠盲蝽逐漸成為為害我國農業生產，尤其是棉田的重要害蟲，發生面積占種植面積的90%左右，嚴重威脅棉花生產，導致棉花產量損失10%~20%。此外，綠盲蝽在為害棉花的同時，還影響棗、桃、櫻桃、蘋果和葡萄等農作物的生產。目前，對綠盲蝽的防治措施主要依靠化學防治。然而，長期大量使用農藥進行害蟲防治不僅會殺傷天敵、降低田間作物的自然調節能力、對自然環境造成污染、破壞生態平衡，而且長此以往，會增加綠盲蝽對化學農藥產生抗性的風險。因此，開發一條經濟有效、環境友好的綠色防治途徑來控制綠盲蝽的危害成為當前迫在眉睫的重要任務之一。
[0003]RNA干擾(RNAi)技術是當今研究基因功能以及健康有效防治害蟲的一個重要手段和研究熱點。利用注射的方法進行RNAi實驗用以篩選昆蟲生長發育關鍵基因，在此基礎上發展有效的抗蟲轉基因作物，可以為害蟲防治提供一條新的可行途徑。RNAi是由雙鏈RNA引發的基因沉默現象，其作用機制是通過誘發對同源mRNA的高效特異性降解來干擾目標基因的表達。當與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA導入細胞時，其被降解成21-23bp長度的小分子 RNA 即 siRNA,RNA 誘導沉默復合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結合siRNA并將其解旋成單鏈，引導單鏈SiRNA根據堿基互補配對原則特異性地結合同源mRNA (靶標)，使mRNA發生斷裂而導致基因表達沉默。
[0004]RNAi是基因功能研究的一個革命性的發現，它極大的擴展了基因研究的思路和方法。從發現至今，RNAi技術在人類醫學，基因工程以及農業等各個領域得以應用，并取得了很多突破。在醫學方面，此技術已被用于臨床疾病治療，如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側索硬化癥、類風濕性關節炎、肥胖癥等。在農業害蟲防治領域，2007年Baum等人在鞘翅目昆蟲西方玉米根蟲(WCR)中利用RNAi技術沉默290個基因后，發現其中125個基因有明顯致死效果。至今為止，RNAi技術主要在雙翅目、膜翅目、同翅目、鞘翅目、等翅目、鱗翅目和直翅目7個目中的15種昆蟲中得到成功應用。由于RNAi現象在昆蟲綱中是存在的，某些基因RNAi沉默后能夠導致昆蟲的死亡，所以如果能夠利用轉基因植物表達出特異的dsRNA，讓昆蟲在取食過程中攝入，對某些農業害蟲的生長發育進行控制，從而能夠將這種RNAi介導的轉基因植物發展成一種害蟲控制的新策略，為有效控制和防治農業害蟲提供一條可行的途徑和良好的前景。
[0005]然而，由于利用RNAi技術培育轉基因植物，周期長，成本高，不能實現從大量基因中篩選功能基因，所以在成功發展轉基因植物之前能夠尋找既經濟又簡單快捷的方法篩選鑒定大量基因從而找到候選基因顯得尤為重要。[0006]同時，有關半翅目昆蟲RNAi實驗的報道中，尚未有任何關于綠盲蝽抗蟲基因及綠盲蝽RNAi的實驗報告。因此，從綠盲蝽的大量基因中篩選鑒定對其生長發育起關鍵作用并在RNAi后能夠影響其生長并導致死亡的基因，可以為接下來利用RNAi發展轉基因植物，用以防治當前棉花重要害蟲綠盲蝽提供重要的依據和基礎，從而降低殺蟲藥劑使用量以及綠盲蝽抗藥性的產生，避免新的生態問題產生，具有重要的經濟、生態和社會效益。
[0007]雖然目前已經有關于，但是在技術方案之前，向綠盲蝽導入dsRNA能否引發RNAi效果并產生致死表型不得而知。

【發明內容】

[0008]本發明提供一種對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射方法，對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射參數(包括注射位置、注射體積，注射dsRNA總量)進行確定，并挑選了綠盲蝽持家基因β -actin驗證綠盲蝽導入dsRNA能否引發RNAi效果并產生致死表型，結果表明導入β-actin基因dsRNA可以導致綠盲蝽生長發育受到嚴重不利的影響，甚至死亡的結論。該方法為篩選新的抗蟲基因提供新的技術手段和平臺，為發展抗綠盲蝽轉基因作物提供新的基因資源進而依此達到發展經濟有效，環境友好的新的方法來控制綠盲蝽的危害。
[0009]對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射方法，其特征在于:注射位置為后胸與腹部節間膜的最外側。
[0010]所述用于注射的dsRNA濃度為10 μ g/ μ 1，注射體積為41.4nl。
[0011]所述綠盲蝽為3L若 蟲。
[0012]一種建立綠盲蝽生長發育關鍵基因的篩選方法，包括如下步驟:(I)取綠盲蝽總RNA,通過RT-PCR得到cDNA ； (2)選定目標基因一段特異性片段，設計帶有T7序列的特異性引物；(3)通過PCR技術擴增目的基因片段:以第一步得到的cDNA為模板，第二步設計的特異引物擴增，得到帶有T7序列和目的基因片段的PCR產物；(4)構建含有選定目的基因片段的載體:將目的基因片段用T4DNA連接酶插入載體PGM-T中，轉入宿主大腸桿菌中，富集培養，提取含有目的基因片段的質粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的質粒為模板，第二步設計的特異性引物擴增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR產物；(6)利用T7RNA聚合酶將上一步得到的PCR產物合成為目的基因片段dsRNA ; (7)將dsRNA按上述注射方法導入綠盲蝽的體內，持續飼養記錄若蟲經RNAi后的表現型；(8)統計死亡率，確認該目的基因與生長發育的關系。
[0013]所述特異性片段為400_500bp。
[0014]所述目的基因為綠盲蝽β -actin基因，其序列如SEQ ID NOl所示。
[0015]所述綠盲蝽β -actin基因的特異性片段序列如SED ID N04所示。
[0016]所述步驟(7)的同時，將GFP基因的dsRNA作為對照組注射入綠盲蝽體內，所述GFP基因序列如SEQ ID N02所示。
[0017]所述GFP基因的特異性片段序列如SEQ ID N03所示。
[0018]所述持續飼養時間為5-10天。
[0019]本發明用注射法對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射參數(包括注射位置、注射體積，注射dsRNA總量)進行確定，并挑選了綠盲蝽持家基因β -actin驗證綠盲蝽導入dsRNA能否引發RNAi效果并產生致死表型，結果表明導入β-actin基因dsRNA可以導致綠盲蝽生長發育受到嚴重不利的影響，甚至死亡的結論。
[0020]本發明首次建立了用于綠盲蝽基因功能研究的RNAi平臺；同時利用建立的RNAi平臺篩選得到了持家基因、能量代謝相關基因、細胞凋亡相關基因等多個與綠盲蝽生長發育密切相關的基因。本研究為篩選新的抗蟲基因提供了新的技術手段和平臺，為發展抗綠盲蝽轉基因作物提供了新的基因資源。實踐表明，發展轉基因抗蟲作物能有效地控制害蟲危害，RNAi是由雙鏈RNA引發的基因沉默現象，其作用機制是通過阻止同源基因的翻譯或者轉錄而實現基因沉默。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1 3齡綠盲蝽的注射位置
[0022]其中:1:前胸和中胸的節間膜 [0023]I1:后胸與腹部節間膜的最外側
[0024]II1:腹部第2和第3節間膜最外側
[0025]圖2注射dsGFP與注射ds β -actin綠盲蝽7天內生存率。
【具體實施方式】
[0026]下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。下面涉及到的化學試劑均為市
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[0027]1、綠盲蝽總RNA的提取
[0028]綠盲蝽總RNA提取的過程在超凈工作臺內進行(離心除外)，以避免RNA酶(RNase)污染降解RNA。整個提取步驟如下所示:
[0029]1.取3-5頭經過72小時饑餓處理的綠盲蝽，加入經液氮冷卻的玻璃勻漿器中，立即向勻漿器內加入1ml RNA提取試劑(Trizol)，將組織磨碎；將研磨好的組織溶液倒入
1.5ml無RNA酶的離心管中，置于冰上；
[0030]2.40C，12000g離心15min，將上清液體轉移到新的1.5ml無RNA酶離心管中；
[0031]3.將上清在室溫下放置5min后，向離心管中加入200 μ I氯仿，用手劇烈震蕩15s，再室溫靜置2-3min ；
[0032]4.4°C，12000g離心15min，混合物在此時分層，下層為有機相，上層為水相(RNA在水相中);將上層水相轉移到新的1.5ml無RNA酶離心管中，向離心管中加入500 μ I異丙醇，室溫靜置IOmin ；
[0033]5.4°C，12000g離心10min后，棄掉上清(盡量吸凈)，向離心管中加入lml75%的乙醇(用無RNA酶的H2O配置，現用現配)，震蕩離心管以洗滌沉淀；
[0034]6.4°C，7500g離心10min后，棄掉上清(盡量吸凈)，在超凈工作臺中干燥5-10min ；
[0035]7.加入20 μ I無RNA酶的H2O,震蕩離心，使沉淀充分溶解；
[0036]8.60°C溫育IOmin后，取I μ I樣品稀釋至5μ1,其中2.5μ1進行電泳檢測，
2.5μ I用濃度測量儀器(NanoDiOP)檢測濃度；如果凝膠電泳檢測結果合格且樣品OD值如下:
[0037]260/280:1.80 ~2.00[0038]260/230:1.80 ~2.00
[0039]則說明RNA質量良好，存于_80°C備用。
[0040]2、第I鏈cDNA的合成
[0041]整個反轉錄過程盡量保證在超凈工作臺內進行，操作步驟按第一鏈cDNA合成試劑盒進行，具體操作如下:
[0042]1.在新的1.5ml無RNA酶離心管中加入2 μ g RNA (根據濃度測量的結果計算需加入RNA的體積數)，再加入I μ I引物(oligo-dT)，用無RNA酶的H2O補至12 μ I ;
[0043]2.65°C溫育5min,之后馬上置于冰上；
[0044]3.在離心管中分別加入下列試劑，使體系達到20μ 1:4μ I的5Χ反應緩沖液；2 μ I的dNTP混合物(IOmM) ；1μ I的反轉錄酶和I μ I的RNA酶抑制劑；簡單混勻后，離心片刻；
[0045]4.42°C溫育lh，然后再70°C溫育5min ;合成后存于_20°C冰箱,使用前稀釋10倍。
[0046]3、靶標基因的克隆
[0047]本發明選取了持家基因、能量代謝相關基因和細胞凋亡相關基因上的基因片段，通過注射法研究其對昆蟲的影響，GFP基因上的片段作為對照。持家基因又稱管家基因，是指所有細胞中均要表達的一類基因，其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的；而能量代謝相關基因和細胞凋亡相關基因也在綠盲蝽生長發育和生理過程中起著非常重要的作用。本發明選取此類基因上的片段，利用注射法進行RNAi將其沉默，研究觀察沉默該基因后，對綠盲蝽個體發育造成的影響。GFP即綠色熒光蛋白，在昆蟲體內并不存在，故大量研究中將其作為對照基因合成dsRNA。
[0048]1.靶標基因引物的設計:
[0049](I)利用BLAST檢索數據庫，搜索綠盲蝽的相近物種同一靶標基因的蛋白或者cDNA編碼的氨基酸序列，用綠盲蝽成蟲若蟲轉錄組組建的本地BLAST庫進行比對查詢，確定所選基因的序列。
[0050](2)根據祀標基因的片段,用Primer Premier5.0軟件設計帶T7啟動子的引物，弓丨物設計原則如下:
[0051]a.引物設計的區間要在靶標基因的編碼區，中間片段大小在400~500bp左右。[0052]b.中間片段盡量選在靶標基因的特異區域。
[0053]c.引物之間不能形成引物二聚體，交叉二聚體。
[0054]2.根據以上引物設計原則設計引物后，送至華大基因進行引物合成。
[0055]3.相關靶標基因的引物序列見表1-1。
[0056]表1.實驗所用引物
[0057]
【權利要求】
1.對綠盲蝽進行RNAi實驗的注射方法，其特征在于:注入dsRNA的注射位置為后胸與腹部節間膜的最外側。
2.根據權利要求1所述的注射方法,其中用于注射的dsRNA濃度為10μg/μ 1，注射體積為 41.4nl。
3.根據權利要求2所述的注射方法，所述綠盲蝽為3L若蟲。
4.一種建立綠盲蝽生長發育關鍵基因的篩選方法，包括如下步驟:(I)取綠盲蝽總RNA,通過RT-PCR得到cDNA ； (2)選定目標基因一段特異性片段，設計帶有T7序列的特異性引物；(3)通過PCR技術擴增目的基因片段:以第一步得到的cDNA為模板，第二步設計的特異引物擴增，得到帶有T7序列和目的基因片段的PCR產物；(4)構建含有選定目的基因片段的載體:將目的基因片段用T4DNA連接酶插入載體PGM-T中，轉入宿主大腸桿菌中，富集培養，提取含有目的基因片段的質粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的質粒為模板，第二步設計的特異性引物擴增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR產物；(6)利用T7RNA聚合酶將上一步得到的PCR產物合成為目的基因片段dsRNA ； (7)將dsRNA按權利要求1-3任一所述的注射方法導入綠盲蝽的體內，持續飼養記錄若蟲經RNAi后的表現型；(8)統計死亡率，確認該目的基因與生長發育的關系。
5.根據權利要求4所述的篩選方法，所述特異性片段為400-500bp。
6.根據權利要求4所述的篩選方法，所述目的基因為綠盲蝽β-actin基因，其序列如SEQ ID NOl 所示。
7.根據權利要求6 所述的篩選方法，所述綠盲蝽β-actin基因的特異性片段序列如SED ID N04 所示。
8.根據權利要求4所述的篩選方法，所述步驟(7)的同時，將GFP基因的dsRNA作為對照組注射入綠盲蝽體內，所述GFP基因序列如SEQ ID N02所示。
9.根據權利要求8所述的篩選方法，所述GFP基因的特異性片段序列如SEQID N03所/Jn ο
10.根據權利要求4所述的篩選方法，持續飼養時間為5-10天。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993079SQ201410201539
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月13日 優先權日:2014年5月13日
【發明者】王桂榮, 劉方舟, 楊婷, 劉楊 申請人:中國農業科學院植物保護研究所