一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法
【專利摘要】本發明提供了一種叢枝菌根真菌（AMF）在提高龍葵生長和吸收土壤中重金屬的能力中的應用和一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法。本發明以鎘（Cd）超累積植物龍葵為實驗植物，以AMF為接種劑，將Cd超累積植物龍葵和具有提高植物生長的AMF結合在一起，AMF能夠提高龍葵生長和吸收土壤Cd的能力，從而提高龍葵對Cd污染土壤的修復效率。與傳統的化學與農業措施相比，本發明強化措施具有治理效果好、無二次污染、運行成本低等特點，具有很好的理論和應用推廣價值。
【專利說明】一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于土壤污染修復【技術領域】。更具體地，涉及一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法。
【背景技術】
[0002]鎘是一種移動性、積累性很強的高毒性重金屬，對植物體沒有明確的生理功能，也是危害人體健康的常見污染物之一。當土壤等環境受到鎘污染后，鎘可在生物體內富集，通過食物鏈進入人體引起慢性中毒。鎘被人體吸收后，在體內形成鎘硫蛋白，選擇性地蓄積在肝、腎中。其中，腎臟可吸收進入體內近1/3的鎘，是鎘中毒的“靶器官”。其它臟器如脾、胰、甲狀腺和毛發等也有一定量的蓄積。由于鎘損傷腎小管，患病者出現糖尿、蛋白尿和氨基酸尿。特別是使骨骼的代謝受阻，造成骨質疏松、萎縮、變形等一系列癥狀。
[0003]目前，我國農田土壤鎘污染面積已超過2.0X 105hm2，每年鎘含量超標的農產品達1.46X 109kg。因此，對土壤中鎘含量的檢測和修復治理研究已十分必要，受到了研究者的重視。
[0004]自魏樹和等2005年發現鎘(Cd)能夠在植物龍葵(5b7a/w? nigrum)中超累積后，利用龍葵修復Cd污染土壤的理論和應用研究已成為熱點。為了提高龍葵的修復效率，人們提出了多種強化龍葵吸收土壤Cd的措施。例如，通過添加化學鰲合劑ETDA、EGTA和DPTA等，增加土壤Cd的生物有效性，從而提高龍葵吸收土壤Cd的效率(魏樹和等，2011)。但這些化學試劑的應用可能會有一些潛在的環境危害，主要問題包括螯合劑對植物的毒性效應，加速重金屬溶解導致重金屬從表層向地下水滲透，對深層土壤或地下水源造成污染，毒害土壤中微生物和動物，對土壤生態系統穩定性和功能造成負面影響。
[0005]近年來，重金屬污染土壤的植物一微生物聯合修復作為一種強化植物修復的技術逐漸成為國內外研究的熱點。這種修復方法利用土壤一微生物一植物的共存關系，充分發揮植物與微生物修復技術的各自優勢，互補不足，進而提高土壤中污染物的修復效率。與傳統的化學與農業措施相比，微生物強化措施具有治理效果好、無二次污染、運行成本低等特點。如有研究表明接種細菌能夠促進龍葵的生長和Cd吸收能力(Chen等，2010)。
[0006]另 外，由于在各類與植物共生的微生物中，菌根真菌是唯一能直接聯系土壤與植物根系的一類土壤微生物，在植物礦質營養與逆境生理中起著非常重要的作用，受到了研究者們的重視。研究顯示，土壤中的叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,簡稱AMF)能夠與高等植物營養根系形成叢枝菌根(abuscular mycorrhiza, AM),促進宿主對土壤中礦質元素P、N、K、Cu等的吸收，提高宿主根系對根部侵染病菌的抵抗能力和增強植物對干旱、高溫、高鹽和重金屬的抗性，在植物生長發育中起著重要作用。Marques等(2007)研究表明，接種叢枝菌根真菌后，龍葵體內Zn濃度雖然略有增加，但龍葵的生長和生物量沒有受到影響，因此接種AMF的龍葵的Zn吸收量與未接種比較沒有明顯的提高，即通過植物接種AMF的方式并不一定能夠實現對所有重金屬的強化吸收；同時，強化的步驟、方法和具體條件之間相互制約相互影響，對最終強化效果的影響是復雜且至關重要的。至今還沒有關于AMF能否強化龍葵吸收土壤Cd能力的研究和應用報道。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是克服現有龍葵吸收土壤Cd能力強化技術的不足，提供一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法。
[0008]本發明的目的是提供一種叢枝菌根真菌在提高龍葵生長和吸收土壤中鎘的能力中的應用。
[0009]本發明另一目的是一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法。
[0010]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
本發明提供了一種叢枝菌根真菌(AMF)在提高龍葵生長和吸收土壤中重金屬的能力中的應用。
[0011]優選地,所述叢枝菌根真菌為地表球囊霉rersi/br-- BGC⑶01C)。所述
重金屬為鎘。
[0012]本發明還提供了一種利用上述叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法，步驟如下:
51.制備叢枝菌根真菌菌劑； 52.龍葵種子發芽，得龍葵幼苗；
53.按照質量比為3~5%的接種量將叢枝菌根真菌菌劑與土壤混合均勻，移栽龍葵幼
苗；
54.將S3處理過的龍葵幼苗移栽到鎘污染土壤中。
[0013]其中，步驟SI所述制備叢枝菌根真菌菌劑的具體步驟如下:
511.按照質量比為I~3%的接種量將叢枝菌根真菌接種劑與滅菌的沙土混合均勻，然后將混合基質裝至無菌盆的2/3~4/5 ;
512.播種玉米種子后，再覆蓋一層0.5cm的滅菌沙土培養基，溫室培養；
513.盆栽培養4~5個月后，剪去玉米植株地上部分的全部莖葉，將盆置于室內干燥I~2周，收獲盆中所有培養物；
514.將盆中培養物倒在無菌紙上，用消毒的工具將其剁碎后，轉移入無菌袋中，封袋冷藏。
[0014]優選地，Sll或S12所述的沙土培養基是沙與土的質量比為1:1。
[0015]優選地，S13所述的室內的溫度保持在18~30°C，濕度保持在70~85%。
[0016]優選地，S13所述的所有培養物包括植物根系、菌絲、孢子和培養基。
[0017]優選地，S14是將3層無菌紙覆蓋在70%酒精擦拭消毒的桌面上，將盆中培養物倒在無菌紙上，用火焰消毒的工具將其剁碎后，卷起兩層紙將剁碎了的培養物轉移入無菌袋中，封袋，再在外面套一個相同的塑料袋，冷藏。
[0018]另外，步驟S2所述的龍葵種子需先用10%的NaClO進行表面消毒10~15min后，去離子水洗凈，再放入超純水中浸泡4~6 h ;所述發芽的條件是將浸泡后的種子放入墊有濾紙的無菌培養皿中，置于28°C室溫內培養。
[0019]步驟S3是選取長勢一致的5~7天苗齡的龍葵幼苗，移栽到接種有質量比為3~5%的叢枝菌根真菌菌劑的土壤中，培養70~80天。[0020]本發明以AMF為接種劑，將植物龍葵和具有提高植物生長的AMF結合在一起，提高龍葵生長和對土壤重金屬的吸收能力，從而提高重金屬污染土壤的修復效率，尤其是對土壤Cd的吸收能力。發明人經過大量的探索和重復驗證發現，接種AMF后的龍葵對Cd的吸收能力明顯增強，對Cd的吸收效果特別好。與龍葵本身相比較，AMF-龍葵共生體對Cd吸收量的增幅可達230%，克服了龍葵本身對土壤Cd吸收的限制，同時克服了傳統的化學應用措施可能存在的一些潛在的環境危害，主要問題包括螯合劑對植物的毒性效應，快速重金屬溶解導致重金屬從表層向地下水滲透，毒害土壤中微生物和動物，對土壤生態系統穩定性和功能造成負面影響。
[0021]在AMF-龍葵共生體中，大量延伸到土壤中的根外菌絲擴大了根系的吸收面積，改善龍葵的礦質營養狀況，尤其是P素營養，從而促進龍葵生長，增加生物量尤其是地上部生物量。
[0022]同時，AMF提高了龍葵的還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、抗壞血酸(Ascorbate, AsA)等非酶抗氧化保護物質和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,S0D)、過氧化物酶(Peroxidase，P0D)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化保護酶的抗氧化作用，從而降低了 Cd對龍葵的毒害。
[0023]另外，AMF提高了土壤中有效態Cd濃度，提高龍葵吸收Cd的能力，從而增加了龍葵體內Cd濃度。
[0024]本發明具有以下有益效果:
本發明提供了一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法。以鎘(Cd)超累積植物龍葵為實驗植物，以AMF為接種劑，將Cd超累積植物龍葵和具有提高植物生長和Cd耐性的AMF結合在一起，通過AMF提高龍葵生長和吸收土壤Cd的能力，從而提高龍葵對Cd污染土壤的修復效率。
[0025]本發明所述修復方法利用土壤-微生物-植物的共存關系，充分發揮植物與微生物修復技術各自優勢，彌補不足，進而提高土壤中污染物的修復效率。在AMF-龍葵共生體中，大量延伸到土壤中的根外菌絲擴大了根系的吸收面積，改善龍葵的礦質營養狀況，尤其是P素營養，從而促進龍葵生長，增加生物量尤其是地上部生物量。同時，AMF提高了龍葵的還原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、抗壞血酸(Ascorbate, AsA)等非酶抗氧化保護物質和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, S0D)、過氧化物酶(Peroxidase, POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化保護酶的抗氧化作用，從而降低了 Cd對龍葵的毒害。另外，AMF提高了土壤中有效態Cd濃度，提高龍葵吸收Cd的能力，從而增加了龍葵體內Cd濃度。
[0026]與傳統的化學與農業措施相比，本發明強化龍葵吸收土壤中鎘的措施具有治理效果好、無二次污染、運行成本低等特點，具有很好的理論和應用推廣價值。
【具體實施方式】
[0027]以下結合具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試劑、方法和設備。
[0028]除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
[0029]叢枝菌根真菌(AMF):地表球囊霉(67 OfiMAs versi forme BGC⑶01C)由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供。
[0030]接種時，AMF菌劑與土壤配比為質量比。
[0031]實施例1制備叢枝菌根真菌菌劑
叢枝菌根真菌versi forme由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供。利用玉米(為<3 may作為宿主植物進行盆栽擴繁后，將含有宿主植物根段、真菌菌絲、菌根真菌孢子和盆栽土壤的混合物作為接種菌劑。
[0032]具體制備過程如下:
S1.按照質量比為3%的接種量將叢枝菌根真菌接種劑與滅菌的沙土混合均勻，然后將混合基質裝至無菌盆的2/3 ；
所述沙土的沙:土 =1:1 ;所述叢枝菌根真菌接種劑由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供。
[0033]S2.播種玉米種子10?15粒/盆，再覆蓋一層0.5cm的滅菌沙土培養基，溫室培養;
53.盆栽培養4?5個月后，剪去玉米植株地上部分的全部莖葉，將盆置于室內干燥I?2周，收獲盆中所有培養物(包括植物根系、菌絲、孢子和培養基)；
所述的室內的溫度保持在18?30°C，濕度保持在70?85% ；
54.將盆中培養物倒在無菌紙上，用消毒的工具將其剁碎后即得到叢枝菌根真菌(AMF)菌劑,轉移入無菌袋中,封袋冷藏。
[0034]S4.將3層無菌紙覆蓋在70%酒精擦拭消毒的桌面上，將盆中培養物倒在無菌紙上，用火焰消毒的短柄斧將其剁碎后，用兩張紙卷起剁碎了的培養物，紙筒的一端插入預先準備的能封口的干凈塑料袋中，當所有的培養物都轉移入袋中后，輕輕取出紙，封上袋，再在外面套一個相同的塑料袋，然后放置在4°C冰箱中保藏。
[0035]操作過程中的任何時候都不要讓手接觸到一點盆栽培養物，保證制備過程不受任何雜菌的污染。
[0036]實施例2叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的研究
1、實驗材料
(I)供試植物龍葵
供試植物龍葵播種前用10%的NaClO對種子進行表面消毒IOmin,去離子水洗凈，將洗凈的龍葵種子放入超純水中浸泡4?6h，等種子充分膨脹后放入墊有濾紙的無菌培養皿中，置于28°C室溫內，待種子發芽后，選取長勢一致的幼苗備用。
[0037](2 )供試土壤，采自華南師范大學生物園，將土壤經自然風干后磨碎，過1_篩后，連續高溫高壓蒸汽滅菌2h( 121°C )，分別加入不同濃度的CdCl2,使Cd濃度達到25mg/kg和50mg/kgo為了讓土壤中CM分布均勻且穩定,加去離子水浸潤一周后風干兩周,循環兩次。
[0038]2、實驗設計
(I)試驗盆為容量800g 土的塑料花盆(上口直徑115mm、下口直徑95mm、高150mm)。
[0039]三個土壤重金屬Cd濃度分別為:0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg。
[0040](2)試驗分為接種實驗組和不接種對照組兩種處理。
[0041]按3%的接種量(質量比)將實施例1制備的AMF菌劑與土壤均勻混合后裝盆，對照組混入等量的滅菌(121 °C，2h )的AMF菌劑。[0042]每盆移栽6株生長狀況良好并且生長狀況一致的龍葵幼苗，每個處理重復三次。將盆栽隨機擺放在溫室中進行培養，光照14h，溫度為22°C~28°C，每兩天澆一次無菌水。一周后將每盆龍葵篩減至3株。培養十周后收獲植物。
[0043]3、叢枝菌根真菌浸染率的測定 測定方法如下:
51.用蒸餾水將龍葵根洗凈，剪成約ICm長的小段，放入15%的KOH溶液中，90°C恒溫水浴30min，用蒸餾水輕輕漂洗根樣；
52.用10%的H2O2漂白30min，用蒸餾水沖洗；
53.再將根浸入1%的HCl溶液中靜置3min，用蒸餾水洗去HCl溶液后，加入0.05%的Trypanblue (TB)染液，90°C水浴下染色 30min ；
54.染色后，用酸性甘油(乳酸:甘油=1:1)洗去根的浮色，隨機挑取50條根段于顯微鏡下觀察侵染情況。
[0044]參照Trouvelot等(1986)的方法計算AMF侵染強度。結果如表1所示。
[0045]4、龍葵生物量的測定
將植物收獲后，用去離子水沖洗干凈，分開植物地上和地下部分，置于80°C烘箱中72h至恒重,稱干重。
[0046]測定結果如表1所示。
[0047]5、植物體磷含量的測定
將龍葵植株根、莖、葉各部分用清水洗干凈，然后放入烘箱內75°C烘干48h，直至恒重。分別稱取烘干的根、莖、葉各部分，用硫酸-過氧化氫進行消化，冷卻稀釋后，采用鑰銻抗分光光度法測定其磷(P)含量。
[0048]測定結果如表1所示。
[0049]6、土壤酸性磷酸酶含量的測定
參照沈桂琴的方法(沈桂琴.土壤中磷酸酶活性的測定方法.中國農科院土肥所)。
[0050]測定結果如表1所示。
[0051]表1 AMF對龍葵生物量、P含量及土壤磷酸酶的影響
【權利要求】
1.一種叢枝菌根真菌在提高龍葵生長和吸收土壤中重金屬的能力中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述叢枝菌根真菌為地表球囊霉versiforme BGC GDO 1C)。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述重金屬為鎘。
4.一種利用叢枝菌根真菌強化龍葵吸收土壤中鎘的方法，其特征在于，步驟如下: 51.制備叢枝菌根真菌菌劑； 52.龍葵種子發芽，得龍葵幼苗； 53.按照質量比為3?5%的接種量將叢枝菌根真菌菌劑與土壤混合均勻，移栽龍葵幼苗； 54.將S3處理過的龍葵幼苗移栽到鎘污染土壤中。
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，步驟SI所述制備叢枝菌根真菌菌劑的具體步驟如下: 511.按照質量比為I?3%的接種量將叢枝菌根真菌接種劑與滅菌的沙土混合均勻，然后將混合基質裝至無菌盆的2/3?4/5 ; 512.播種玉米種子后，再覆蓋一層0.5cm的滅菌沙土培養基，溫室培養； 513.盆栽培養4?5個月后，剪去玉米植株地上部分的全部莖葉，將盆置于室內干燥I?2周，收獲盆中所有培養物； 514.將盆中培養物倒在無菌紙上，用消毒的工具將其剁碎后，轉移入無菌袋中，封袋冷藏。
6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，步驟S2所述的龍葵種子需先用10%的NaClO進行表面消毒10?15min后，去離子水洗凈，再放入超純水中浸泡4?6 h ;所述發芽的條件是將浸泡后的種子放入墊有濾紙的無菌培養皿中，置于28°C室溫內培養。
7.根據權利要求4所述方法，其特征在于，步驟S3是選取長勢一致的5?7天苗齡的龍葵幼苗，移栽到接種有質量比為3?5%的叢枝菌根真菌菌劑的土壤中，培養70?80天。
8.根據權利要求5所述方法，其特征在于，Sll或S12所述的沙土培養基是沙與土的質量比為1:1。
9.根據權利要求5所述方法，其特征在于，S13所述的室內的溫度保持在18?30°C，濕度保持在70?85%，S13所述的所有培養物包括植物根系、菌絲、孢子和培養基。
10.根據權利要求5所述方法，其特征在于，S14是將3層無菌紙覆蓋在70%酒精擦拭消毒的桌面上，將盆中培養物倒在無菌紙上，用火焰消毒的工具將其剁碎后，卷起兩層紙將剁碎了的培養物轉移入無菌袋中，封袋，再在外面套一個相同的塑料袋，冷藏。
【文檔編號】C12R1/645GK103990647SQ201410197384
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】靖元孝, 劉檜, 譚石云, 袁鳴, 江秋云 申請人:華南師范大學