一種同步檢測四種蘋果病毒的方法
【專利摘要】本發明涉及一種同步檢測四種蘋果病毒的方法。以帶有葉芽蘋果一年生枝條頂端0～5cm皮層組織或組培苗葉片組織為試材，采用TRIzol法提取組織總RNA，以總RNA為模板，六堿基隨機引物進行cDNA合成，以四種病毒特異性引物及內源基因引物進行多重PCR反應。根據瓊脂糖凝膠電泳中擴增條帶大小判斷組織攜帶病毒情況。判斷標準為：未擴增出內源基因特異性片段即代表實驗失敗；擴增出內源基因特異性片段即代表蘋果組織總RNA提取質量符合要求；擴增出內源基因特異性片段及任意病毒特異性片段即代表組織中帶有該病毒；擴增出內源基因特異性片段，未擴增出任何病毒特異性片段即代表組織中不帶有任何病毒。
【專利說明】—種同步檢測四種蘋果病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種同步檢測四種蘋果病毒的方法。
【背景技術】
[0002]蘋果病毒病在世界各地廣泛分布，我國各蘋果產區普遍存在，樹體受到病毒危害后，病毒在寄主細胞內寄生并增殖，破壞干擾樹體的正常生理機能，嚴重影響果樹的生長，降低產量、品質、果品的貯藏性和耐運力，也影響蘋果根系對土壤營養物質的吸收和利用。
[0003]蘋果病毒病主要通過嫁接途徑傳染，在長期的無性繁殖過程中，病毒在植物體內積累和傳播，用帶毒樹的任何部位做繁殖材料，其后代均帶毒，造成病毒病害日益嚴重。在當今技術水平下，蘋果病毒病尚無有效的防治藥劑，采用脫毒方法，繁殖無病毒苗木，加強植物檢疫是防治病毒病的有效途徑之一。我國對蘋果病毒病的研究起步較晚，自1978年從國外引進病毒指示植物才開始對蘋果病毒病進行系統研究，目前已初步明確了我國蘋果主產區病毒病的種類、分布，并在病毒檢測方面取得一定的進展，獲得了一些品種的無病毒苗木，但真正應用到生產實踐中的脫毒源種微乎其微。脫除病毒是果樹無毒化的基礎，準確、靈敏、快速的病毒檢測技術既是果樹無毒化栽培的關鍵環節也是基本保障。
[0004]蘋果病毒大多為潛隱性病毒，在常規品種不表現明顯癥狀，其具有在樹體中含量低、分布不均、分布受外界因素影響大、組織富含多糖、多酚的特點，目前，準確、快速、靈敏的蘋果病毒檢測技術還有待進一步完善。多重RT-PCR可同時檢測侵染同一植株的多種病毒，大大縮短檢測時間，同時減少檢測費用。蘋果病毒復合侵染現象普遍，因此，多重RT-PCR技術在蘋果病毒檢測中具有廣泛的應用前景。
[0005]多重RT-PCR在國內外已有應用于果樹病毒檢測的報道，但同時檢測四種蘋果病毒的方法鮮有報道，加上病毒具有基因組變異快的特點，本發明針對我國四種主要蘋果病毒多重RT-PCR方法的開發將為更好的繁育無毒苗木和病毒檢疫奠定基礎，為今后蘋果病毒病的有效防治提供理論依據，從而促進我國蘋果產業的發展。
【發明內容】
[0006]本發明建立了一套能夠同時檢測蘋果四種病毒的多重RT-PCR技術體系。
[0007]本發明所采用的技術方案是:通過提取蘋果組織總RNA，采用四種病毒及一種蘋果內源基因的特異性引物，通過多重RT-PCR方法擴增各病毒及蘋果內源基因特異性序列，蘋果內源基因可以起到排除假陰性對照的作用，最后通過凝膠電泳觀察擴增產物大小，判定組織中所帶病毒種類。
[0008]本發明的具體內容，即同時檢測四種蘋果病毒的具體方法如下:
(I)蘋果組織總RNA的提取田間樣本采取帶有葉芽一年生枝條頂端(T5cm皮層組織、組培苗采取葉片組織，采用Trizol法提取組織總RNA，定容于30 μ L除RNase水中，-80°C保存備用。
[0009] (2)病毒特異性基因序列的擴增以步驟(1)獲得的總RNA為模板，進行多重RT-PCR得到擴增產物。引物為:第I對引物:ASPV-F:5’_T GGAACCTCATGCTGC A-3’ ；ASPV-R:5’-T TGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATA A~3f。第 2 對引物:ASGV-F:5’-GAGGATTTAGGTCCCTCT C_3’ ；ASGV-R:5’ -GTATAAAGGCAGGCATGTCAAC C_3’。第 3 對引物:ApMV_F:5，-CAACCGAGAGGTTGGC A~3f ；ApMV-R j’-TTCTAGCAGGTCTTCATCGA-3’。第 4 對引物:ACLSV-F:5’ -G AGAGTTTCAGTTTGCTAGAC A_3’ ；ACLSV-R:5’-G CAAATTCAGTCTGTAAAA G_3’。第 5 對蘋果內源基因引物:EFl-a-V:5’ -A CCAACCTTGACTGGTACAAG G~3f -,EF卜 a -認:5’ -TGGTGCATCTCAACAGAC T_3，。
[0010](3)瓊脂糖凝膠電泳檢測取8yL PCR擴增產物，用含0.Syg.mr1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在I X TAE緩沖液中進行電泳分析，120V電泳40分鐘，根據電泳條帶大小判斷病
毒種類。
[0011]3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于四種蘋果病毒特異性片段大小為:蘋果莖痕病毒stem pitting virus, ASPV) 360 bp、蘋果莖溝病毒stemgrooving virus, ASGV) 821 bp、蘋果花葉病毒(々7/?7<9 mosaic virus, ApMV) 161 bp、蘋果裡綠葉斑病毒(々少7(9 chlorotic leafspot virus, ACLSV) 566 bp,蘋果內源基因 EF1_ α特異性片段大小為236 bp。
[0012]本發明專利的有益效果是，通過設計可明顯區分四種蘋果病毒的特異性引物及能夠排除假陰性樣本的內源基因引物，進行檢測體系及程序的優化，建立了一套同步檢測四種蘋果病毒的檢測技術，避免了普通PCR檢測的多次重復工作，檢測穩定性好，特異性強，可應用于田間蘋果樣本及組培苗帶毒情況的快速檢測，從而指導蘋果病毒病害防控措施的制定，減少病害造成的損失。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是帶毒樣本經多重RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳效果圖片。
【具體實施方式】
[0014]以帶有葉芽蘋果一年生枝條頂端0-5 cm皮層組織或組培苗葉片組織為試材，取50mg組織，在液氮中迅速研磨，加0.5 mL提取試劑(400 μ L RNA提取試劑+100 μ LP -巰基乙醇)進行提取，最后加入30 UL DEPC水充分溶解RNA。然后以六堿基隨機引物為引物，以M-MLV為反轉錄酶進行cDNA合成，以合成的cDNA為模板，配制以下PCR反應體系:cDNA 4.0μ L, ASGV-F 0.6 μ L, ASGV-R 0.6 μ L, ASPV-F 0.2 μ L，ASPV-R 0.2 μ L，ACLSV-F 0.6μ L, ACLSV-R 0.6 μ L, ApMV-F 0.5 μ L, ApMV-R 0.5 μ L, EFl- α -F 0.05 μ L, EFl- α -R
0.05 μ L,2XES Taq 12.5 μ L，用dd2H20水補足25 μ L。按照以下程序進行PCR:預變性 94°C2 min ;35 個循環 :94°C 變性 I min，55°C 退火 I min，72°C 延伸 I min ;72°C 終延伸 7min。取8 UL PCR擴增產物，用含0.5 μ g.ml—1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在I XTAE緩沖液中進行電泳分析，120V電泳40分鐘，根據電泳條帶大小判斷病毒種類。四種蘋果病毒特異性片段大小分別為:ASPV 360 bp、ASGV 821 bp、ApMV 161 bp、ACLSV 566 bp,BFl-α236 bp ο
【權利要求】
1.一種同步檢測四種蘋果病毒的方法，其特征在于通過提取蘋果組織總RNA，采用四種病毒及一種蘋果內源基因的特異性引物，通過多重RT-PCR方法擴增各病毒及蘋果內源基因特異性序列，凝膠電泳觀察擴增產物大小，判定組織中所帶病毒種類。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)蘋果組織總RNA的提取田間樣本采取帶有葉芽一年生枝條頂端(T5cm皮層組織，組培苗采取葉片組織，采用Trizol法提取組織總RNA，定容于30 μ L除RNase水中，-80°C保存備用。 (2)病毒特異性基因序列的擴增以步驟(1)獲得的總RNA為模板，進行多重RT-PCR得到擴增產物。引物為--第I對引物:ASPV-F:5’-TGGAACCTCATGCTGC A_3’；ASPV-R:5’-T TGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATA Α_3’。第 2 對引物:ASGV-F:5’-GAGGATTTAGGTCCCTCT C_3，;ASGV_R:5’ -G T A T A AAGGCAGGCATGTCAAC C_3’。第 3 對引物:ApMV_F:5，-C A A C C G A G AGGTTGGC A-3，; ApMV-R:5，-T TCTAGCAGGT CTTCATCG A_3，。第 4對引物:ACLSV-F:5，-G AGAGTTTCAGTTTGCTAGAC A_3，;ACLSV-R:5，_GCAAATTCAGTCTGTAAAA G_3’。第 5 對蘋果內源基因引物-F:5’_ACCAACCTTGACTGGTACAAG G~3f -,EF卜 a -義:5’ -T G G T G C A T C TCAACAGAC T-3，。 (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測取8μ LPCR擴增產物，用含0.5 μ g.πι1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在I X TAE緩沖液中進行電泳分析，120V電泳40分鐘，根據電泳條帶大小判斷病毒種類。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于四種蘋果病毒特異性片段大小為:蘋果莖痘病毒stem pitting virus, ASPV) 360 bp、蘋果莖溝病毒stem groovingvirus, ASGV) 821 bp、蘋果花葉病毒mosaic virus, ApMY) 161 bp、蘋果裡綠葉斑病毒(AppIe chlorotic leafspot virus, ACLSV) 566 bp,蘋果內源基因 EFl- α 特異性片段大小為236 bp ο
【文檔編號】C12Q1/68GK103966362SQ201410196186
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】王亞南, 曹克強, 趙緒生 申請人:河北農業大學