具有增強子作用的家蠶BmMITE-2轉座子的制作方法
【專利摘要】本發明涉及的是一種來自家蠶的具有顯著增強下游基因表達的微型反向重復轉座子(BmMITE-2)。該增強子由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列組成。本發明是通過生物信息學方法在家蠶基因組中鑒定獲得并通過轉基因，細胞轉染和分子生物學方法驗證其具有增強子的功能，該發明不但有助于獲取高豐度的目的蛋白推動家蠶生物反應器的發展而且有利于家蠶品種的改良。
【專利說明】具有增強子作用的家蠶BmM ITE-2轉座子
【技術領域】
[0001]本發明涉及的生物【技術領域】，主要是家蠶轉基因生物反應器和品種改良領域。
【背景技術】
[0002]轉座子(transposon)或稱轉座兀件(transposableelements, TEs)是可以從基因組中的一個位置通過不同轉座機制轉移到另一個位置的所有移動元件(Finneganl989)。由于轉座子不具有編碼功能基因的能力，所以在很長一段時間內都被人們所忽視并且一度被認為是基因組中的垃圾DNA (junk DNA)。但是隨著人們對轉座子關注的不斷加深，對其功能的不斷探索和對其概貌的逐步認識，漸漸發現最初的認識完全是錯誤的。最近的研究發現轉座子不但可以通過增加自身拷貝數來促進基因組的進化，還可以通過貢獻調控序列和外顯子序列來改變基因的表達、功能和結構。
[0003]目前大量的研究表明轉座子不管是在基因的轉錄水平還是轉錄后水平，都可以直接影響鄰近基因的表達。具體的調控機制有:(I)通過提供調控元件來調節其鄰近基因的表達；(2)通過轉座破壞已有的調控元件；(3)產生反義RNA來沉默鄰近基因的表達等。但是已有的報道主要集中在少數轉座子家族，如人類的Alu類轉座子。
[0004] 微型反向重復轉座元件(MITE)是一類不具有編碼轉座酶能力的非自主DNA轉座子，其序列結構如圖1所示。MITE轉座子最初是由Bureau和Wessler在玉米種的基因組中發現并命名。目前對于其研究仍停留在對其全基因組鑒定和擴增機制上。目前已有的報道表明MITE轉座子廣泛分布于真核生物基因組中并且在基因組中通常具有高拷貝、高保守和偏向分布于基因附近等特征。但是真核生物基因組中為什么會保留如此多拷貝的MITE序列？為什么偏向分布于基因附近？帶著這些疑問我們應用生物信息學的方法在家蠶基因組中鑒定出了具有高拷貝、高保守性和偏向分布于基因附近的BmMITE-2轉座子。進一步通過轉基因，細胞轉染和一些常用的分子檢測方法證明了該轉座子具有增強子的作用。
【發明內容】
[0005]本發明是利用生物信息學，分子和細胞生物學方法在家蠶中鑒定并證實了家蠶BmMITE-2轉座子起到了增強子的作用。目的在于將該元件構建到表達載體或者轉基因載體中可以有效增加目的基因表達的效果。
[0006]本發明 申請人:利用生物信息學方法在家蠶基因組中鑒定了一個微型反向重復轉座子BmMITE-2。應用PCR和TA克隆的方法在家蠶基因組中獲得了該轉座子的序列。測序驗證為我們的目的序列。然后將該轉座子分別連接到轉基因載體PiggyBac (A3-EGFP-SV40)和細胞轉染載體pGL3-Basic Vector載體的報告基因的5’端，再將這兩個載體分別進行家蠶的轉基因顯微注射和細胞轉染實驗，結果證實了 BmMITE-2轉座子具有增強子的作用。這不但有助于原核/真核表達獲取高豐度的目的蛋白而且對家蠶生物反應器的發展也將起到推動作用。
[0007]本發明的家蠶增強子BmMITE-2通過以下步驟獲得和證實:[0008](I)家蠶BmMITE-2轉座子的鑒定:首先應用MUST軟件在家蠶9倍基因組序列進行MITE轉座子序列的搜索。結果在家蠶基因組中鑒定出BmMITE-2轉座子。該轉座子的一致序列(consensus sequence)長度278bp,末端反向重復序列(TIR)長度20bp (TGAGTCGACTATTATCAAAG)，TSD 為 TA。進一步以 BmMITE-2 的一致序列作為問詢序列，用BLASTN程序在家蠶9倍基因組數據庫中搜尋BmMITE-2的同源序列(e值<e_6，相似度>80% ,序列長度>80bp)，最終發現BmMITE-2轉座子家蠶基因組中具有2790個拷貝。最后應用Perl程序分析這些拷貝在家蠶基因附近的分布情況，發現BmMITE-2轉座子偏向分布于家蠶的基因附近。
[0009](2)家蠶BmMITE-2轉座子序列的獲得:以家蠶大造品系的基因組DNA為模板，BmMITE-2轉座子的核苷酸序列設計特異性引物(構建細胞轉染載體的上游引物為:5’GAGTGAGTCGACTATTATCAAAGCCGGCAATGTGACT-3’ ;構建細胞轉染載體的下游引物為:5’ -GCTAGctgagtcgtctattatcaaaggtggcaatctgtgcat-S'下劃線分別為限制性內切酶 Xho I 和 NheI酶切位點；構建轉基因載體的上游引物為:5’ -AGATCTTGAGTCGACTATTATCAAAGCCGGCAATGTGACT-3’ ；構建轉基因載體的下游引物為:5’ -AGATCTTGAGTCGTCTATTATCAAAGGTGGCAATCTGTGCAT-3’下劃線為限制性內切酶bgl II酶切位點；)進行PCR擴增，獲取目的條帶，PCR產物回收后與PMD-19-T載體連接轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，獲得陽性克隆后送往上海生工生物工程公司測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致。
[0010](3)將目的片段構建到轉基因載體和細胞轉染載體
[0011]轉基因載體構建:將含有目的片段的T克隆載體和轉基因載體PiggyBac (A3-EGFP-SV40)分別用Bgl II進行酶切，分別回收目的片段和載體骨架，電泳檢測后，將骨架進行去磷酸化處理，然后用DNA連接酶將目的片段BmMITE-2與轉基因載體連接，并轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選獲得含有BmMITE-2重組質粒的克隆，然后將擴大培養的菌液送往上海生工生物工程公司測序，測序結果與第一次測得的序列一致，獲得正確的克隆；
[0012]細胞轉染載體構建:將含有目的片段的T克隆載體和細胞轉染載體pGL3-BasicVector分別用限制性內切酶Xho I和Nhe I進行雙酶切，分別回收目的片段和載體骨架，電泳檢測后，用DNA連接酶將目的片段BmMITE-2與細胞轉染載體連接，并轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選獲得含有BmMITE-2重組質粒的克隆，然后將擴大培養的菌液送往上海生工生物工程公司測序，測序結果與第一次測得的序列一致，獲得正確的克隆；
[0013](4)轉基因家蠶的獲得，分子檢測和細胞轉染結果
[0014]對家蠶大造品系產下3-4小時內的蠶卵進行轉基因顯微注射，在Fl代進行轉基因陽性家蠶的篩選和飼養。在2齡幼蟲眠期，分別將有BmMITE-2插入和無BmMITE-2插入的轉基因家蠶置于熒光顯微 鏡下拍照，比較不同轉基因家蠶發出的綠色熒光信號的強弱。然后提取5齡3天的不同轉基因家蠶的mRNA并反轉錄成cDNA，利用熒光定量PCR的方法檢測綠色熒光蛋白基因EGFP在不同家蠶轉基因系里的表達差異。
[0015]將構建好的具有BmMITE-2轉座子插入的細胞轉染載體，內參質粒和轉染試劑一同轉入家蠶的卵巢細胞系(BmN)內，轉染后的細胞27°C培養24~48個小時候后，用熒光素酶活性檢測儀來檢測這兩種報告基因的表達量。
[0016]本發明的優點是:[0017]目前對于家蠶的研究已進入后基因組即功能基因組時代，根據已有的報道大量與家蠶抗性和絲蛋白產量相關的基因被鑒定。然而尋找到合適的增強子來增加這些基因在家蠶中的表達以期獲得抗病力強和高產繭絲的家蠶品種變得尤為迫切。所以我們發明的這一增強子不但有望推動家蠶優良品種的繁育而且可能對家蠶生物反應器的發展起到推動作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為轉基因驗證BmMITE-2轉座子具有增強子作用。其中A顯示的分別是具有和沒有BmMITE-2轉座子插入的轉基因載體pBac(A3-EGFP-SV40)整合進家蠶基因組后的轉基因系在體視顯微鏡下呈現的綠色熒光信號強度。B為熒光定量PCR檢測不同轉基因系報告基因EGFP的mRNA表達情況。
[0019]圖2為雙熒光素酶報告基因檢測結果。
【具體實施方式】
[0020]實施例1:
[0021]家蠶BmMITE-2轉座子的鑒定:應用MUST軟件在家蠶9倍基因組序列進行MITE轉座子序列的搜索。結果在家蠶基因組中鑒定出BmMITE-2轉座子(NCBI登錄號為KC874840)。該轉座子的一致序列(consensus sequence)長度278bp,末端反向重復序列(TIR)序列長度2(^口0^61^1^0^1"^1^446)，靶位點正向重復(TSD)序列為TA。BmMITE-2的具體序列組成，見 SEQ ID NO:1。
[0022]實施例2:
[0023]家蠶BmMITE-2轉座子對下游基因表達增強作用的鑒定:將BmMITE-2轉座子構建到家蠶轉基因載體Pi ggyBac (A3-EGFP-SV40)上，然后分別用有BmMITE-2插入和無BmMITE-2插入的PiggyBac載體對家蠶進行轉基因注射，分別獲得陽性的轉基因家蠶并熒光顯微鏡拍照，結果發現有BmMITE-2插入的轉基因家蠶的熒光信號要明顯強于沒有BmMITE-2插入的對照組(見附圖1A)。進一步用熒光定量PCR的方法檢測不同轉基因家蠶5齡3天幼蟲GFP基因mRNA水平的表達量后，發現具有BmMITE-2插入的轉基因家蠶GFP基因的表達量要顯著地高于對照組(見附圖1B)。
[0024] 為了進一步證明BmMITE-2插入到基因的5’端會增強其下游基因的表達，我們進行了雙熒光素酶報告基因轉染實驗。我們首先將家蠶的A3啟動子序列構建到螢火蟲熒光素酶報告基因載體(pGL3Basic Vector)的報告基因的5’端，然后再將BmMITE-2的序列構建到A3啟動子的前面。然后將這個構建好的載體和內參載體(海腎熒光素酶報告基因)共轉染家蠶卵巢細胞(BmN)，轉染48小時后測酶活。結果發現當熒光素酶報告基因的5’端插入了 BmMITE-2時，顯著的增加了報告基因的表達量(P〈0.01)(見附圖2)。
【權利要求】
1.具有增強子作用的BmMITE-2轉座子，其特征在于該轉座子是家蠶來源的，序列組成如 SEQ ID NO:1 所示。
2.根據權利要求1的增強子，其中所說的增強子來源于家蠶BmMITE-2轉座子。
3.根據權利要求1或2，其中所說的家蠶是家蠶大造品系。
4. 根據權利要求1中的增強子BmMITE-2轉座子在構建家蠶重組表達載體并提高外源或內源基因表達產物的產率中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103952404SQ201410192824
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】張澤, 韓民錦, 唐洲 申請人:重慶大學