用于惡性腫瘤診斷的引物、試劑盒和系統的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于惡性腫瘤診斷的引物、試劑盒和系統。所述用于惡性腫瘤診斷的引物為PTPRO甲基化特異性引物，所述PTPRO甲基化特異性引物包括：第一甲基化特異性引物序列5’-GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特異性引物序列5’-ACGACTACGCTAACGAACTCC-3’。實施本發明的用于惡性腫瘤診斷的引物、試劑盒和系統，通過檢測外周血PTPRO基因甲基化水平，可以簡單、方便且準確地診斷惡性腫瘤。
【專利說明】用于惡性腫瘤診斷的引物、試劑盒和系統
【技術領域】
[0001]本發明涉及惡性腫瘤領域，更具體地說，涉及一種用于惡性腫瘤診斷的引物、試劑盒和系統。
【背景技術】
[0002]乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。全球乳腺癌發病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢。乳腺癌已成為當前社會的重大公共衛生問題。乳腺癌的病因尚未完全清楚，研究發現乳腺癌的發病存在一定的規律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。所謂高危因素是指與乳腺癌發病有關的各種危險因素，而大多數乳腺癌患者都具有的危險因素就稱為乳腺癌的高危因素。
[0003]目前乳腺癌的診斷方法包括影像學檢查，細胞病理學和組織病理學診斷。影像學檢查包括乳腺X線攝影(乳腺鑰靶照相)、彩超、乳腺磁共振檢查等等。但是其通常效率較低并且檢測準確度不高。通常的細胞和組織病理學檢測包括細胞活檢。因此需要采用穿刺或者外科手術的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材。不但不方便，而且會對患者造成人體傷害。
【發明內容】
[0004]針對現有技術中的惡性腫瘤診斷要么準確度不高，要么需要對患者造成人體傷害才能獲得腫瘤組織的檢材的缺陷，提供一種能夠方便、準確地的進行惡性腫瘤診斷的引物、試劑盒和系統。
[0005]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:構造一種用于惡性腫瘤診斷的引物，所述用于惡性腫瘤診斷的引物為PTPRO甲基化特異性引物，所述PTPRO甲基化特異性引物包括:第一甲基化特異性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特異性引物序列 5’ -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3’。
[0006]在本發明所述的用于惡性腫瘤診斷的引物中，所述惡性腫瘤包括乳腺腫瘤和食管鱗腫瘤。
[0007]本發明解決其技術問題所采用的另一技術方案是:構造一種用于惡性腫瘤診斷的試劑盒，包括上述所述的PTPRO甲基化特異性引物和PTPRO非甲基化特異性引物，所述PTPRO非甲基化特異性引物包括:第一非甲基化特異性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特異性引物序列5’ -ACACCATATATCCCCATAAACAA-3’。
[0008]本發明解決其技術問題所采用的再一技術方案是:構造一種用于惡性腫瘤診斷的系統，包括:CT轉化試劑溶液、M-消化緩沖液、蛋白酶K溶液、重亞硫酸鹽轉化試劑盒、PTPRO甲基化特異性引物和PTPRO ^^甲基化特異性引物，其中所述PTPRO甲基化特異性引物包括:第一甲基化特異性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特異性引物序列5’ -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3’ ；所述PTPRO非甲基化特異性引物包括:第一非甲基化特異性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特異性引物序列5’ -ACACCATATATCCCCATAAACAA-3’。
[0009]在本發明所述的用于惡性腫瘤診斷的系統中，所述惡性腫瘤包括乳腺腫瘤和食管鱗腫瘤。
[0010]在本發明所述的用于惡性腫瘤診斷的系統中，所述CT轉化試劑溶液包括:亞硫酸氫鈉、M-溶解緩沖液、M-稀釋緩沖液和M-反應緩沖液，其中所述M-溶解緩沖液為3摩爾/L氫氧化鈉，所述M-稀釋緩沖液為高壓過的超純水，所述M-反應緩沖液為10毫摩爾/L對
苯二酚。
[0011]在本發明所述的用于惡性腫瘤診斷的系統中，所述M-消化緩沖液通過將20毫克RNA酶A溶解于2毫升0.01摩爾/L醋酸鈉溶液，煮沸20分鐘，室溫冷卻，加入I摩爾/LTris鹽酸調整pH值到7.5制備。
[0012]在本發明所述的用于惡性腫瘤診斷的系統中，所述蛋白酶K溶液的濃度為20毫克
/毫升°
[0013]實施本發明的用于惡性腫瘤診斷的引物、試劑盒和系統，通過檢測外周血PTPRO基因甲基化水平，可以簡單、方便且準確地診斷惡性腫瘤。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中:
[0015]圖1示出了不同乳腺組織和外周血中PTPR0，所有患者癌組織和配套外周血中PTPRO甲基化變化；
[0016]圖2示出了檢測乳腺癌組織、癌旁組織以及外周血中PTPRO啟動子區甲基化水平的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0017]我們的研究證明PTPRO基因表達會逐漸被甲基化過程“沉默”。甲基化作用能夠將甲基加到一個基因上，這個甲基化基因的活性就降低并且使其編碼的蛋白水平也下降。因此，PTPRO基因被沉默時，PTPRO酶的水平就會相應下降，從而影響到PTPRO調控的蛋白質，進而導致癌癥的發生。
[0018]我們的研究發現75%原發性腫瘤標本都可以檢測得到PTPRO基因過甲基化，并且與腫瘤侵犯深度有關。而且乳腺癌患者的外周血樣本PTPRO基因過甲基化僅存在腫瘤組織同樣過甲基化的病例。這表明PTPRO基因可以作為一種無創性的針對乳腺癌及實體腫瘤的分子標記物。檢測外周血中PTPRO蛋白的表達情況可應用于乳腺癌及實體腫瘤早期篩查診斷、治療療效觀察、預后和復發監測等方面，作為一種重要指標和參考依據。同時我們也發現在其他癌癥患者的外周血中PTPRO表達量普遍比正常人外周血中PTPRO表達量要高。
[0019]因此，本發明提出通過檢測外周血中PTPRO蛋白的表達情況，對于乳腺癌、食管鱗癌患者等各類惡性腫瘤進行初期診斷。
[0020]下面通過實施例對本發明進行進一步地說明。在本發明中，除特別定義外，濃度單位均為每升溶液的摩爾濃度。本領域技術人員進一步知悉，本發明下述實施例中的各個濃度，摩爾分數，質量分數均可以根據實際進行進行調整。本領域技術人員可以實現上述調整。在本發明中，所有試劑均可以從SIGMA購得。
[0021]實驗一、通過檢測外周血中PTPRO蛋白的甲基化情況，對于乳腺癌患者進行診斷
[0022]實施步驟I臨床標本收集
[0023]采集對象:156例乳腺癌患者手術切除腫瘤組織標本及手術前外周血均來自2009至2010年間廣州軍區總醫院的臨床病例資料完整的患者，均為女性，平均年齡(47±9)歲。所有患者術前均未接受放療或化療。同期采集39例乳腺良性病變的患者腫瘤組織、正常組織和血漿作為對照組。
[0024]具體方法如下:分別抽取乳腺癌患者及乳腺良性病變患者抗凝外周血2毫升，使用eppendorf Centrifuge5417R低溫臺式離心機,2500轉/分鐘,離心15分鐘，收集上層血漿，-80°C保存，做好登記。
[0025]實施步驟2試劑制備
[0026]在使用前添加260微升的蛋白酶K儲存緩沖液到蛋白酶K管中。使得蛋白酶K的終濃度為20毫克/毫升，完全溶解后儲存在_20°C。在本發明的一個優選實施例中，可以采用滅菌的50mmol/Tris (PH8.0), 1.5mmol/L乙酸鈣溶解,配置成20mg/mL的溶液。
[0027]轉化試劑的制備:可采用固體化合物亞硫酸氫鈉配置CT轉化試劑。添加790微升M-溶解緩沖液和300微升的M-稀釋緩沖液到1.78克亞硫酸氫鈉粉末中，再添加160微升的M-反應緩沖液混合。在室溫下溶解并且震蕩10分鐘或在搖床上搖動10分鐘。應當在制備后立即使用，制備好的CT轉化試劑對光很敏感，所以盡量減少在光下的暴露，應當在制備后立刻使用，其保存條件為隔夜使用室溫保存，一周內使用4°C保存，一個月內使用-20°C保存。
[0028]其中M-溶解緩沖液為3摩爾/L氫氧化鈉。M-稀釋緩沖液為高壓過的超純水。M-洗滌緩沖液為用高壓過的超純水稀釋的70%乙醇。M-反應緩沖液為10毫摩爾/L對苯二酚。
[0029]M-洗滌緩沖液的制備:添加24毫升無水乙醇到M-洗滌緩沖液試劑中。
[0030]實施步驟3DNA提取
[0031]血衆分離DNA利用重亞硫酸鹽轉化試劑盒(EZ DNA Methylation-Direct Kit?試劑盒)中試劑，按下表配方加入反應液，蛋白酶消化反應30分鐘。
[0032]
【權利要求】
1.一種用于惡性腫瘤診斷的引物，其特征在于，所述用于惡性腫瘤診斷的引物為PTPRO甲基化特異性引物，所述PTPRO甲基化特異性引物包括:第一甲基化特異性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特異性引物序列5， -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3，。
2.根據權利要求1所述的用于惡性腫瘤診斷的引物，其特征在于，所述惡性腫瘤包括乳腺腫瘤和食管鱗腫瘤。
3.一種用于惡性腫瘤診斷的試劑盒，其特征在于，包括根據權利要求1或2所述的PTPRO甲基化特異性引物和PTPRO非甲基化特異性引物，所述PTPRO非甲基化特異性引物包括:第一非甲基化特異性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特異性引物序列 5，-ACACCATATATCCCCATAAACAA-3，。
4.一種用于惡性腫瘤診斷的系統，其特征在于，包括:CT轉化試劑溶液、M-消化緩沖液、蛋白酶K溶液、重亞硫酸鹽轉化試劑盒、PTPRO甲基化特異性引物和PTPRO非甲基化特異性引物，其中所述PTPRO甲基化特異性引物包括:第一甲基化特異性引物序列5’ -GGTACGTTTTTGGAGGATTTC-3’和第二甲基化特異性引物序列5 ’ -ACGACTACGCTAACGAACTCC-3 ’；所述PTPRO非甲基化特異性引物包括:第一非甲基化特異性引物序列5’ -TTTGGTATGTTTTTGGAGGATTTT-3’和第二非甲基化特異性引物序列5’ -ACACCATATATCCCCATAAACAA-3’。
5.根據權利要求4所述的用于惡性腫瘤診斷的系統，其特征在于，所述惡性腫瘤包括乳腺腫瘤和食管鱗腫瘤。
6.根據權利要求4所述的用于惡性腫瘤診斷的系統，其特征在于，所述CT轉化試劑溶液包括:亞硫酸氫鈉、M- 溶解緩沖液、M-稀釋緩沖液和M-反應緩沖液，其中所述M-溶解緩沖液為3摩爾/L氫氧化鈉，所述M-稀釋緩沖液為高壓過的超純水，所述M-反應緩沖液為10毫摩爾/L對苯二酚。
7.根據權利要求4所述的用于惡性腫瘤診斷的系統，其特征在于，所述M-消化緩沖液通過將20毫克RNA酶A溶解于2毫升0.01摩爾/L醋酸鈉溶液，煮沸20分鐘，室溫冷卻，加入I摩爾/L Tris鹽酸調整pH值到7.5制備。
8.根據權利要求4所述的用于惡性腫瘤診斷的系統，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的濃度為20暈克/毫升。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004832SQ201410191177
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】張灝 申請人:張灝