Kin17基因或蛋白在制備肺癌診斷及治療藥劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了Kin17基因或蛋白在制備肺癌診斷、預(yù)后評估及治療藥劑中的應(yīng)用，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，Kin17基因或蛋白可作為肺癌新的診斷標(biāo)志及藥物靶標(biāo)，Kin17蛋白在肺癌中的表達(dá)明顯升高，維持了腫瘤細(xì)胞的快速增殖活性，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。沉默肺癌中Kin17的表達(dá)能抑制肺癌細(xì)胞的增值活性，也能增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。Kin17基因或蛋白可用于肺癌的早期鑒別診斷、患者預(yù)后評估及臨床治療。
【專利說明】Kinl 7基因或蛋白在制備肺癌診斷及治療藥劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及肺癌新的診斷標(biāo)志及藥物靶標(biāo)，具體涉及Kinl7基因或蛋白在制備肺癌診斷、預(yù)后評估及治療藥劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率與致死率最高的惡性腫瘤，每年的新發(fā)肺癌病例有160萬，占所有惡性腫瘤的13%，每年因肺癌導(dǎo)致的死亡患者有140萬，占所有惡性腫瘤死亡的18%，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。肺癌的惡性程度較高，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，絕大多數(shù)患者在確診時已屬相對晚期，失去了根治性手術(shù)的機(jī)會。早期診斷和及早治療對肺癌患者的療效與預(yù)后至關(guān)重要。對于肺癌高危人群的篩查，一般根據(jù)病人的胸部癥狀、影像學(xué)檢查(如X線胸片、CT、MR1、PET-CT等)和血液中腫瘤標(biāo)志物(如CEA、CA125、NSE和CYFRA2121等)等。目前這些篩查指標(biāo)還不夠理想。很多肺癌患者在手術(shù)后易復(fù)發(fā)，而且外科手術(shù)和放療都是局部治療方式，無法控制肺癌的晚期轉(zhuǎn)移?；熓菍ν砥谵D(zhuǎn)移性癌癥患者的最主要治療手段。但常規(guī)的細(xì)胞毒性化療藥缺乏腫瘤細(xì)胞特異性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，也殺傷了骨髓及其他增殖旺盛的正常細(xì)胞，不良反應(yīng)嚴(yán)重；而且多次化療后產(chǎn)生的耐藥性也讓化療的療效已經(jīng)到達(dá)了平臺期。為了進(jìn)一步提高晚期肺癌的治療效果，近年來靶向治療方法越來越受到推崇。分子靶向治療方法特異性強(qiáng)，細(xì)胞毒性小，在治療晚期肺癌上具有獨(dú)有的優(yōu)勢。雖然目前很多靶向藥物的出現(xiàn)給肺癌患者帶來了希望，但也在臨床應(yīng)用中存在著藥物適用對象不廣、單藥療效不強(qiáng)、與化療藥協(xié)同作用不佳、耐藥性與不良反應(yīng)嚴(yán)重等諸多問題。 [0003]肺癌癌細(xì)胞具有旺盛的增殖力、持續(xù)的DNA復(fù)制潛能和蓄積的DNA損傷。Kinl7蛋白是一個在物種進(jìn)化過程中十分保守的蛋白質(zhì)，它主要與細(xì)胞的DNA復(fù)制、DNA修復(fù)及細(xì)胞增殖功能有關(guān)，在人體各組織器官中表達(dá)普遍較低。目前，關(guān)于Kinl7基因或蛋白肺癌新的診斷標(biāo)志及藥物IE標(biāo)還末見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供Kinl7基因或蛋白在制備肺癌診斷、預(yù)后評估及治療藥物中的應(yīng)用。
[0005]發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，Kinl7蛋白在肺癌中的表達(dá)明顯升高，維持了腫瘤細(xì)胞的快速增殖活性，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，Kinl7基因(核苷酸序列見SEQ IDNO:1)或蛋白(氨基酸序列見SEQ ID NO:2)可作為肺癌新的診斷標(biāo)志及藥物靶標(biāo)，Kinl7基因或蛋白可用于肺癌的早期鑒別診斷、肺癌患者的預(yù)后評估分析及臨床治療。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0006]圖1:Kinl7在肺癌患者標(biāo)本與良性病變患者標(biāo)本中的表達(dá)情況；
圖2:Kinl7在肺癌標(biāo)本的癌巢組織與A549細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織； 圖3:重組質(zhì)粒pET32a-KIN17中插入的Λ7Λ77基因的部分測序圖；圖4:1PTG誘導(dǎo)Kinl7蛋白在大腸桿菌中原核表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖；
圖5:純化后的His標(biāo)簽Kinl7蛋白的SDS-PAGE電泳圖(左)與Western_blot鑒定圖(右)；
圖6:用siRNA_Kinl7下調(diào)Kinl7表達(dá)(左)，抑制了肺癌A549細(xì)胞的生長增殖活性(右)；
圖7:用siRNA_Kinl7剔降Kinl7，能增強(qiáng)化療藥卡鉬對肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用。
【具體實施方式】
[0007]Kinl7基因或蛋白的定名與序列
編碼Kinl7蛋白的基因定名為“KIN17基因”，KIN17基因編碼的蛋白定名為“Kinl7蛋白”，KIN17基因的登錄號為:NM_012311。
[0008]KIN17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]Kin17蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]下面結(jié)合具體的實驗對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。 [0011]Kinl7基因或蛋白應(yīng)用于肺癌診斷:
隨機(jī)選取施行手術(shù)活檢并經(jīng)病理學(xué)診斷的肺癌患者90例(其中非小細(xì)胞患者65例、小細(xì)胞肺癌患者25例)和和良性病變(如肺炎與肺纖維化等)患者40例，用免疫組化方法檢測Kinl7在這些患者病理標(biāo)本中的表達(dá)情況。
[0012]免疫組化檢測的步驟:
1)組織切片脫蠟至水，置于0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，100°C微波抗原修復(fù)處理20min，自然冷卻至室溫；
2)蒸餾水沖洗后，滴加3%H202孵育15min;然后用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)沖洗3次，每次3min ；
3)滴加1: 150稀釋的Kinl7抗體(購自Santacruz)，37°C孵育60min后，用PBS沖洗3次,每次3min ；
4)接著滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的EnVision?二抗試劑(購自Dako公司)，37°C孵育30min后，用PBS沖洗3次，每次3min。最后用3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色3min, Mayer蘇木素復(fù)染3min ；
5)梯度酒精脫水、透明、封固。
[0013]染色評分:分別就每張切片的染色強(qiáng)度(一，±，I +，2 +，3 +，4十)與陽性細(xì)胞的百分率(0-100)%進(jìn)行打分。計算染色得分=染色強(qiáng)度(0，0.5，1，2，3，4)X (0-100)。
如，某張玻片的染色強(qiáng)度是2 +，陽性細(xì)胞的百分率是65%，那得分等于2X60=130。得分(100定義為低表達(dá)，得分> 100定義為高表達(dá)。全部切片由兩個病理科醫(yī)生在不知道組織診斷性質(zhì)的情況下獨(dú)立打分。
[0014]根據(jù)染色評分結(jié)果對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，Kinl7在肺正常組織及良性病變組織中的表達(dá)較低，而在肺癌標(biāo)本中表達(dá)明顯異常升高0° <0.01);腫瘤細(xì)胞增殖越旺盛的組織部位，Kinl7的表達(dá)越強(qiáng)(圖1)。用Western blot方法檢測Kinl7在肺癌患者新鮮組織與A549細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Kinl7在肺癌標(biāo)本的癌巢組織與A549細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(圖2)。
[0015]因此，采用免疫組化、免疫熒光和實時定量PCR等方法對患者的肺病變組織中的Kinl7蛋白或基因表達(dá)進(jìn)行檢測，有助于鑒別診斷肺良性病變與肺癌病情診斷。
[0016]Kinl7蛋白的制備
純化Kinl7蛋白是制備Kinl7抗體及相關(guān)的診斷試劑的重要材料。為了研發(fā)基于Kinl7表達(dá)的肺癌診斷試劑，采用如下方法制備Kinl7蛋白。
[0017]1.先用引物 Pl (5，-CGGGATCCATGGGGAAGTCGGATTTTCT-3’，SEQ ID NO:3)和 P2(5’ - CGTAAGCTTTCAGGCAAGTTTAGAAATGTCTTC-3’，SEQ ID NO:4)從細(xì)胞中 PCR 擴(kuò)增基因開放閱讀框全長，經(jīng)用內(nèi)切酶及?HI和歷id分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后，插入到pET32a-c (+)載體中，測序分析(圖3)證明成功構(gòu)建pET32a-KIN17重組質(zhì)粒；
2.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌BL21中，再用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)攜帶His標(biāo)簽的Kinl7蛋白，經(jīng)SDS — PAGE電泳分離及考馬斯亮藍(lán)染色后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)較好(圖
4)；
3.接著利用N1-NTAHis-Bind柱進(jìn)行親和層析來純化Kinl7蛋白。
[0018]純化終產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，一個和His標(biāo)簽Kinl7蛋白大小一致的蛋白條帶純度很高，達(dá)到95%以上(如圖5左);該主要條帶經(jīng)Western blot方法鑒定為Kinl7目的蛋白(圖5右)。
[0019]Kinl7基因或蛋白應(yīng)用于肺癌患者的預(yù)后評估的方案:
收集肺癌患者及腫瘤組織的病理參數(shù)的數(shù)據(jù)信息，統(tǒng)計分析病理組織中Kinl7表達(dá)與這些參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果顯示,患者肺癌標(biāo)本中Kinl7表達(dá)水平高低(評分> 100或者(100)與腫瘤大小Gd = 0.037，T-test)、腫瘤分化程度{P = 0.028，x 2檢驗)、K1-67表達(dá)水平0° = 0.024, X 2檢驗)及對化療藥物敏感性0° = 0.031，X 2檢驗)密切相關(guān)。通過患者的隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后死亡的肺癌患者的組織中，Kinl7的表達(dá)比沒有死亡的肺癌患者要高Od = 0.045，乂2檢驗)。
[0020]因此，對Kinl7基因或蛋白的檢測有助于評估與預(yù)測肺癌患者的疾病進(jìn)展?fàn)顩r、抗癌治療效果及預(yù)后情況。
[0021]Kinl7基因或蛋白應(yīng)用于肺癌的臨床治療的方案:
按照以下步驟進(jìn)行RNA干擾試驗:肺癌A549細(xì)胞經(jīng)血清饑餓2h后，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染 Kinl7 特異性的 siRNA (siRNA_Kinl7)與相對應(yīng)的對照 siRNA(siRNA_NC)到細(xì)胞中；48h后，收集兩組細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析及細(xì)胞生長曲線比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA_Kinl7的細(xì)胞中Kinl7表達(dá)被明顯下調(diào)，而且其生長速度明顯減慢Gd< 0.05，圖6)。因此，沉默肺癌細(xì)胞中Kinl7表達(dá)，抑制能夠肺癌細(xì)胞的增殖活性。
[0022]轉(zhuǎn)染siRNA_Kinl7與siRNA_NC到A549細(xì)胞48h后，在兩組細(xì)胞中各加入肺癌常用化療藥卡鉬，然后 比較兩組細(xì)胞的存活率變化；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA_Kinl7的A549細(xì)胞存活率下降得比對照組要更快(圖7)。因此，沉默肺癌細(xì)胞中與DNA復(fù)制、修復(fù)相關(guān)的Kinl7表達(dá)，能增強(qiáng)其對化療藥卡鉬的敏感性。
[0023]因此Kinl7可以作為肺癌治療的靶點(diǎn)，采用特異性的siRNA、shRNA、Kinl7特異性的抗體或者小分子藥物，沉默或者降低腫瘤組織中的Kinl7的表達(dá)，可用于肺癌的治療。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測Kinl7基因的方法在制備肺癌診斷或預(yù)后評估試劑中的應(yīng)用。
2.檢測Kinl7蛋白表達(dá)水平的方法在制備肺癌診斷或預(yù)后評估試劑中的應(yīng)用。
3.抑制Kinl7蛋白表達(dá)的制劑在制備治療肺癌或改善肺癌患者病情藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:抑制Kinl7蛋白表達(dá)的制劑選自Kinl7基因啟動子抑制劑、轉(zhuǎn)錄抑制劑和Kinl7蛋白合成抑制劑。
5.使Kinl7蛋白特異性失活的制劑在制備治療肺癌或改善肺癌患者病情藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:使Kinl7蛋白特異性失活的制劑選自Kinl7蛋白抗體 。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004831SQ201410188632
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】曾濤 申請人:曾濤