實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體及其制備方法，piggyBac載體含有3個末端反向重復序列，位于中間位置的末端反向重復序列為193bp且與左側末端反向重復序列的方向相同，其制備方法簡單，制得的piggyBac載體在轉座酶的作用下外側2個末端反向重復序列插入到家蠶基因組中，然后由轉座酶激活中間位置的末端反向重復序列和右側末端反向重復序列，進而刪除中間位置的轉座子，從而剩下只有一個末端反向重復序列的轉座子，該轉座子不能被轉座酶激活，從而長期穩定存在于宿主中，實現轉基因的長期穩定性；為轉基因家蠶素材在實際生產中提供穩定性保障。
【專利說明】實現家蠶轉基因長期穩定性的PiggyBac載體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，特別涉及一種實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體實現轉基因穩定性的piggyBac載體,還涉及該載體的制備方法。
【背景技術】
[0002]來源于粉紋夜蛾的piggyBac轉座子是迄今為止應用最為廣泛的轉基因載體之一，它在包括哺乳動物、昆蟲、原生動物以及渦蟲等三十余個不同物種或生殖種系中取得了轉基因的成功。piggyBac是典型的II型轉座子家族成員，在其內部區域序列(internalregion)編碼的轉座酶(transposase)的協助下，它通過其兩端的末端反向重復序列(ITRs)，在“TTAA”特征靶序列處發生轉座插入。轉基因即是通過將外源基因序列替換掉piggyBac內部編碼轉座酶的序列，并由瞬時表達轉座酶的方式來實現。隨著瞬時表達的轉座酶的消失，攜帶有轉基因序列的piggyBac不會再次發生轉座。這種模式對于轉基因的建立和持續表達十分重要。雖然受未知因素影響，比如內源性的轉座酶，或者外部提供的轉座酶而導致piggyBac攜帶的轉基因發生再次轉座的事件不會對基礎研究產生太大影響。但是，piggyBac的長期穩定性對于那些有望應用到實際生產上去的轉基因品系卻尤其重要。
[0003] 家蠶不僅是重要的經濟產絲昆蟲，為農業經濟做出卓越貢獻。同時家蠶也是公認的鱗翅目昆蟲模式生物代表，推動了生命科學的發展。隨著家蠶基因組的解析，對家蠶的研究已經進入功能基因組時代。自從2000年Tamura等人報告piggyBac的轉基因技術在家蠶中成功應用的案例后，該技術被廣泛的應用到家蠶的基礎與應用研究中。許多家蠶的功能基因通過該技術得以詳細的詮釋。更為重要的是，該技術也成為家蠶遺傳改良的有力工具，被廣泛的用于蠶絲力學性能改良、轉基因家蠶生物反應器以及轉基因家蠶抗性素材培育等應用研究中，并取得巨大進展。隨著PiggyBac技術在家蠶中的廣泛使用，越來越多的跟實際應用緊密相關的轉基因家蠶正被逐步的推向實用化，并且Xu等人曾報道過家蠶基因中存在許多PiggyBac-1ike的轉座子元件,并且推測相當一部分還具有轉座活性。因此對家蠶轉基因的PiggyBac載體進行改進以提高轉基因在家蠶基因組中的長期穩定顯得尤為重要。
【發明內容】
[0004]有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體，提聞轉基因在家香基因組中的長期穩定性；本發明的目的之二在于提供該載體的制備方法，其制備方法簡單。
[0005]為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案:
[0006]1、實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體,所述piggyBac載體含有3個末端反向重復序列，位于中間位置的末端反向重復序列小于679bp且與左側末端反向重復序列的方向相同。[0007]優選的，所述位于中間位置的末端反向重復序列為193bp。
[0008]優選的，所述位于中間位置的末端反向重復序列的序列如SEQ ID N0.5所示。
[0009]更優選的，所述piggyBac載體依次包括左側反向重復序列，外源基因表達框1、位于中間位置的末端反向重復序列、外源基因表達框II和右側末端反向重復序列。
[0010]優選的，所述外源基因表達框I與位于中間位置的末端反向重復序列之間還包括限制性酶切位點。
[0011]優選的，所述限制性酶切位點為AscI限制性酶切位點。
[0012]更優選的,所述piggyBac載體的序列如SEQ ID N0.7所示。
[0013]2、所述實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體的制備方法，包括如下步驟:以pBac [3xp3-EGFPaf]載體為模板，設計擴增左側反向重復序列的引物，然后進行PCR擴增，然后將擴增產物通過MluI和AscI酶切，酶切后插入到pBac [3xp3_EGFPaf]載體的AscI位點，篩選插入方向與pBac[3xp3-EGFPaf]載體的左側反向重復序列同向的載體，得實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體。
[0014]優選的，所述擴增左側反向重復序列的引物如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
[0015]本發明的有益效果在于:本發明公開了實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體，通過設計含有3個末端 反向重復序列(ITRs)的piggyBac轉基因載體,轉座子在整合基因組后載體轉座從而刪除內部轉座子，剩下只有一個末端反向重復序列的片段，該片段不論在有轉座酶或無轉座酶的條件下均不能再次激活，因此可實現家蠶轉基因的長期穩定性，并且該PiggyBac載體的制備方法簡單，能夠大批量獲得，該載體的獲得對家蠶轉基因素材的開發應用具有重大意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖:
[0017]圖1 為 pBac[3ITRs679_AscI]和 pBac[3ITRsl93_AscI]載體結構圖(A:pBac[3ITRsl93-AscI]載體結構；B:pBac [3ITRs679_AscI]載體結構)。
[0018]圖2為3xp3DsRed/3xp3EGFP和DsRed熒光表型轉基因家蠶的篩選(A:卵期第7天熒光圖，a-a’’為3xp3DSRed/3xp3EGFP熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察，b-b’’為3xp3DSRed熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察；B:蟻蠶熒光圖，a-a’’為3xp3DSRed/3xp3EGFP熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察，b-b’’為3Xp3DsRed熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察；C:蛹期熒光圖，a-a’’為3xp3DSRed/3xp3EGFP熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察，b-b’’為3xp3DSRed熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察；D:蛾期熒光圖，a-a’ ’為3Xp3DsRed/3Xp3EGFP熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察，b_b’ ’為3xp3DsRed熒光表型分別在白光、綠色熒光和紅色熒光下觀察，標尺大小為2mm)。
[0019]圖3為含3個末端反向重復序列的piggyBac轉基因載體實現長期穩定性的原理圖。
[0020]圖4為轉基因轉基因家蠶中的分子檢測結果(A:引物設計示意圖；B:基因組PCR檢測圖；C:基因組Southern Blot圖，探針為地高辛標記的EGFP探針)。
[0021]圖5為家蠶后代轉基因穩定性調查結果(A:3Xp3DSRed/3Xp3EGFP家蠶后代的熒光觀察，a為紅色熒光觀察結果，b為綠色熒光觀察結果，c為白光觀察結果，3xp3EGFP熒光的丟失如b中箭頭所示，標尺大小為2mm ；B:3Xp3DSRed轉基因家蠶后代的熒光觀察，a_a’’分別表示Gl代蠶卵分別在紅色熒光、綠色熒光和白光下觀察結果，b-b’ ’分別表示G2代蠶卵分別在紅色熒光、綠色熒光和白光下觀察結果c-c’ ’分別表示G3代蠶卵分別在紅色熒光、綠色熒光和白光下觀察結果，d-d’’分別表示G4代蠶卵分別在紅色熒光、綠色熒光和白光下觀察結果e-e’’分別表示G5代蠶卵分別在紅色熒光、綠色熒光和白光下觀察結果，標尺大小為2mm ；C:基因組PCR檢測，引物F1/R1，F2/R2和F3/R3所擴增的序列；D:轉座酶基因在3xp3DSRed轉基因家蠶后代中的轉錄表達檢測)。
【具體實施方式】
[0022]下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。[0023]本發明中所使用的家蠶品種為大造(Dazao)，由本實驗室保存。家蠶由桑葉或人工飼料在25 °C人工氣候箱中飼養。質粒載體pSLfall80fa (Carsten Horn, et al2000)、pBac[3xp3EGFPaf](Carsten Horn, et al2000), pBac[3xp3DsRedaf](Aichun Zha0.etal2010)由本實驗室保存。
[0024]實施例1、轉基因載體的構建
[0025]構建含有3個末端反向重復序列(ITRs)的piggyBac轉基因載體,具體步驟如下:
[0026](I)根據pBac[3xp3EGFPaf]載體序列，設計兩條擴增piggyBac左側反向重復序列(ITR)的引物，具體為:PiggyL_F (679)-Mlu1: 5’ -ggcacgcgtagatctgacaatgttcagtg-3’ (SEQ ID N0.1)，下劃線為 MluI 酶切位點，PiggyL-F(193)-Mlu1:5，-ggcacgcgtgtcattttgactcacgcggt-3，(SEQ ID N0.2)，下劃線為 MluI 酶切位點，下游引物為 PiggyL-R-ASC1:5，-aaggcgcgcctcgagtaaagcgcaaatc-3，(SEQ ID N0.3),下劃線表示 ASCI 酶切位點。然后以 pBac [3xp3-EGFPaf]載體為模板，分別以 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.2 與SEQ ID N0.3為引物進行PCR擴增，PCR擴增條件為:94°C預變性4分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，共30個循環；最后72°C延伸10min，4°C保存。將擴增獲得片段分別命名為L2-679(SEQ ID N0.4)和L2-193 (SEQ ID N0.5)，并回收擴增片段連接到測序載體上進行測序鑒定。然后通過MluI和AscI酶切PCR擴增產物，酶切后分別插入到pBac[3xp3EGFPaf]載體的AscI位點中，然后經測序鑒定并篩選L2-679和L2-193的插入方向與pBac[3xp3EGFPaf]載體自身的左側ITRs序列同向的載體,分別得pBac [3xp3EGFP,L2-679af] (SEQ ID N0.6)和 pBac[3xp3EGFP,L2-193af] (SEQ ID N0.7)。SEQ ID N0.6 中，第5~1056位為PiggyR，第1055~1328位為3xp3啟動子，第1329~2049位為EGFP編碼區，第2050~2308位為SV40終止子，第2321~2999位為擴增所得L2-679，第3026~3033位為AscI限制酶識別位點，第3036~3043位為FseI限制酶識別位點，第3062~3740位為PiggyL ；SEQ ID N0.7中第5~1056位為PiggyR，第1055~1328位為3xp3啟動子，第1329~2049位為EGFP編碼區，第2050~2308位為SV40終止子，第2321~2513位為擴增所得L2-193，第2540~2547位為AscI限制酶識別位點，第2550~2557位為FseI限制酶識別位點，第2576~3254位為PiggyL。[0027](2)根據pBac[3xp3DsRedaf]載體序列，設計擴增3xp3DsRed的引物，具體為:3xp3DsRed-F~Mlu1:5’ -ggcacgcgtaattcgagctcgcccg-3’ (SEQ ID N0.8),下劃線為 MluI 酶切位點；3xp3DsRed-R_ASC1:5，-aaggcgcgccatcgataagctttaagatac_3’ (SEQID勵.9)，下劃線為八5(:1酶切位點，然后以？8&(3[31?3081^(1&幻為模板，SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9為引物進行PCR擴增，PCR擴增條件為:94°C預變性4分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸90秒，共30個循環；最后72°C延伸10min，4°C保存。擴增獲得3Xp3DsRed序列，然后將擴增獲得的序列3Xp3DsRed通過MluI和AscI酶切后分別插入到步驟(1)獲得的 pBac[3xp3EGFP，L2_679af]和 pBac[3xp3EGFP，L2_193af]中，形成pBac[3xp3EGFP, L2-679，3xp3DsRedaf]和 pBac[3xp3EGFP， L2-193，3xp3DsRedaf]，分別簡稱為 pBac[3ITRs679-AscI]和 pBac [3ITRsl93_AscI]，結構如圖1 所示。由圖1 可知，PBac[3ITRsl93-AscI]載體內部含有兩個同向的左側ITRs，一個在外側長度為679bp，命名為LI，一個在內部長度為193bp，命名為L2，右側ITR長度為1052bp，命名為R1。LI與L2之間含有一個紅色熒光篩選基因3xp3DSRed熒光篩選基因和AscI位點供外源基因的構建使用，L2與Rl之間含有3Xp3EGFP熒光篩選基因(圖1A)。pBac[3ITRs679_AscI]的內部結構與pBaC[3ITRS193-ASCI]相似，不同的是其內部的L2序列長度與外側的LI長度一樣，都為 679bp (圖1B)。獲得的 pBac [3ITRs679_AscI]和 pBac [3ITRsl93_AscI]分別含有 3 個末端反向重復序列，因此在轉座酶的作用下首先通過外側的L1/R1將整個載體序列插入到家蠶基因組中去，然 后由轉座酶激活內側的L2/R1發生再次轉座進而刪除L2/R1，剩下一個LI轉座臂，不管有無轉座酶的存在，其都不能發生轉座，因而實現家蠶轉基因長期穩定性。由于短的轉座子比長的轉座子更容易發生轉座。因此，改造后的PiggyBac載體中，L2/R1會比L1/R1更容易首先發生基因組整合。為了提高L1/R1首先發生轉座的頻率，本研究將L2的轉座臂序列縮短到193bp，希望以此減弱L2/R1首先發生轉座的頻率，從而增加L1/R1首先轉座的概率。
[0028](3)為測試改造后的piggyBac載體是否可以實現轉基因插入以及再次轉座，將活性hsp70啟動子驅動表達的piggyBac轉座酶基因的表達框(hsp70PIG)通過AscI分別構建到上述兩個載體中，形成 pBac{3ITRs679-hsp70PIG}和 pBac {3ITRsl93_hsp70PIG}。具體步驟為:根據phspBac vector序列(Handler AM等，1999),設計擴增活性hsp70啟動子驅動的PiggyBac轉座酶基因(hsp70PIG)的引物序列，具體為:Helper-F，5’ -aaggcgcgccctcattaggcaccccagg-3J (SEQ ID N0.10),下劃線為 ASCI 酶切位點，Helper-R,5? -aaggcgcgcctcaacaaacaa tttatttatgttta-3，(SEQ ID N0.11),下劃線為ASCI酶切位點，然后以phspBac質粒為模板，以SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示序列為引物進行PCR擴增，PCR擴增條件為:94 V預變性4分鐘，94 V變性30秒，56 V退火30秒，72 °C延伸150秒，共30個循環；最后72°C延伸lOmin，4 °C保存。擴增獲得hsp70啟動子驅動的PiggyBac轉座酶基因(hsp70PIG)，然后通過AscI位點分別構建到pBac[3ITRs679-AscI]和 pBac[3ITRsl93_AscI]載體中，形成 pBac[3ITRs679_hsp70PIG]和pBac[3ITRS193-hSp70PIG]，即獲得含3個末端反向重復序列的piggyBac轉基因載體，并將獲得的含3個末端反向重復序列的piggyBac轉基因載體轉化入大腸桿菌感受態細胞Transl-Tl 中。
[0029]本實施例中構建含3個末端反向重復序列的piggyBac轉基因載體是通過MluI和AscI同尾酶連接策略實現。
[0030]實施例2、制備和篩選轉基因家蠶
[0031]轉基因家蠶的制備采用顯微注射與熒光篩選進行，具體為:利用質粒提取試劑盒從大腸桿菌中提取 pBac[3ITRs679-hsp70PIG]和 pBac[3ITRsl93_hsp70PIG]載體的質粒DNA，然后按照400ng/y L的濃度分別注射已解除滯育家蠶早期胚胎，隨后用無毒膠水對注射孔進行封口，經35%的甲醛蒸汽消毒5分鐘后置于25°C、相對濕度為85%的環境中孵化，孵化得GO代幼蟲，將GO代幼蟲采用人工飼料飼育，至成蟲后進行自交或回交制種，獲得的Gl代蠶卵，將獲得的Gl代蠶卵在第7天時用宏觀體視熒光顯微鏡(Olypus MVXlO,日本)下檢測，在波長為510~550nm的激發光條件下觀察紅色熒光，在波長為460~490nm的激發光條件下觀察綠色熒光，篩選同時在眼睛或神經特異激發綠色熒光和紅色熒光的轉基因陽性蛾圈或者只發紅色熒光的轉基因陽性蛾圈(圖2)，并統計，結果如表1所示。
[0032]表1、轉基因家蠶熒光篩選統計結果
【權利要求】
1.實現家蠶轉基因長期穩定性的PiggyBac載體,其特征在于:所述piggyBac載體含有3個末端反向重復序列，位于中間位置的末端反向重復序列為193bp且與左側末端反向重復序列的方向相同。
2.根據權利要求1所述實現家蠶轉基因長期穩定性的PiggyBac載體，其特征在于:所述位于中間位置的末端反向重復序列的序列如SEQ ID N0.5所示。
3.根據權利要求1或2所述實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體，其特征在于:所述PiggyBac載體依次包括左側反向重復序列，外源基因表達框1、位于中間位置的末端反向重復序列、外源基因表達框II和右側末端反向重復序列。
4.根據權利要求3所述實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體，其特征在于:所述外源基因表達框I與位于中間位置的末端反向重復序列之間還包括限制性酶切位點。
5.根據權利要求4所述實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體，其特征在于:所述限制性酶切位點為AscI限制性酶切位點。
6.根據權利要求5述實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體,其特征在于:所述piggyBac載體的序列如SEQ ID N0.7所示。
7.權利要求1-6任一項所述實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:以pBac[3xp3-EGFPaf]載體為模板，設計擴增左側反向重復序列的引物，然后進行PCR擴增，然后將擴增產物通過MluI和AscI酶切，酶切后插入到pBac [3xp3-EGFPaf]載體的AscI位點，篩選插入方向與pBac [3xp3_EGFPaf]載體的左側反向重復序列同向的載體，得實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述擴增左側反向重復序列的引物如 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 所示。
【文檔編號】C12N15/66GK103923941SQ201410177428
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】夏慶友, 王峰, 徐漢福, 王元成, 王日遠, 趙萍 申請人:西南大學