一種與豬肉pH值性狀相關的分子標記鑒定及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于家畜分子標記制備【技術領域】，具體涉及兩個與豬肉pH值性狀相關的SNP分子標記和由這兩個SNP構成的單倍型定位及應用。該SNP分子標記由全基因組關聯分析中得到，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：1-2以及圖2-3所示。再利用所得到的SNP經單倍型分析得到一個如圖4所示的相應的單倍型。本發明的標記及單倍型可用于豬肉pH值性狀相關檢測中。
【專利說明】一種與豬肉PH值性狀相關的分子標記鑒定及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于家畜分子標記制備【技術領域】，具體涉及兩個與豬肉PH值性狀相關的SNP分子標記和這兩個SNP構成的單倍型的鑒定及應用。
【背景技術】
[0002]近幾年，在豬育種工作中，提高瘦肉含量和降低背膘厚一直被育種者作為主要育種目標，并取得了顯著的成效。但這種選育方式的遺傳選擇最終導致肌內脂肪含量的下降，進而導致豬肉品質的下降。隨著消費者對肉質要求的不斷提高，改善豬肉品質的遺傳研究已成為畜牧業的研究熱點。
[0003]肉質性狀是一個復雜的性質。影響肉質的因素很多，包括遺傳、營養、環境衛生、屠宰前的管理、屠宰工藝和屠宰后的加工處理。評定豬肉品質好壞的指標主要包括:肌內脂肪含量、大理石紋、pH、肉色、系水力、滴水損失、肌纖維特性(類型、直徑、面積比等)及肉品中脂肪酸的組成等。
[0004]pH值是肉品質測定的最重要的指標之一。pH值直接體現了肌肉酸度，對豬肉品質影響很大。肉品PH值多用pH計直接測定。機體在屠宰后肌肉的運動機能被終止并處于缺氧狀態，但新陳代謝仍在繼續消耗ATP，短時間內磷酸肌酸由肌酸激酶使ADP變成ATP，除此之外不會再生成ATP，這時糖酵解產生的乳酸使肌肉pH值降低，但隨著ATP分解生成的胺的積累和PH值的降低使糖原酵解的酶活性減弱甚至失活，最終導致糖酵解停止，肌肉的pH值達穩定狀態(Kocwin-Podsiadla, Przybylski et al.1995)。
[0005]由于肉質性狀的測定只能在屠宰后進行而且相對困難，因此采取傳統的育種方法進行肉質改良受到一定的限制。此外，目前對影響肉質性狀的基因的研究，以及這些基因之間的通路研究尚不全面透徹，同樣限制了育種進展。而分子育種可以克服這些困難，為提高豬肉品質提供另一條研究途徑，直接從DNA水平上分析數量遺傳變異，使單個基因甚至單個位點對數量性狀影響的檢測成為可能。因此，采用分子遺傳學方法從本質上提高豬肉品質越來越受到關注，已經成為該研究方向的重要研究途徑。
[0006]雖然候選基因法和QTL定位已經在豬標記輔助選擇中用于豬肉質性狀遺傳標記的發現，并取得了一定的成效，如豬與所有性狀相關QTL有8421個。但是候選基因法只能檢索預先設定候選基因，而不能識別新基因；QTL定位的限制在于QTL區域一般跨度很大，很難做到精細定位。如今，全基因組關聯分析(Genome-wide Association Study,GffAS)已成為識別與重要經濟性質有關的候選基因或特定地基因組區域的新策略。相對候選基因法和QTL定位，GWAS可以更準確的定位和識別新基因。它在家畜育種中已經得到廣泛的應用，如提高奶牛產奶量等。隨著豬高密度的SNP(Single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態性)芯片的開發，以及豬基因組測序工作的完成(Groenen，Archibald et al.), GffAS為豬的分子育種開辟了一個新領域。[0007]目前為止，已經確認為豬肉質性狀的主效基因有氟烷基因、酸肉基因和PRKAG3基因。[0008]氟烷基因(Halothane gene, Hal)是最早被發現的影響豬肉品質的一個重要標記基因。它位于豬6號染色體的蘭尼定受體I基因(RyanodinereceptorI, RYR1)的發生突變，其隱形基因對豬肉品質造成了不利影響，導致白肌肉(pale, soft and exudative, PSE肉)的產生(Hradecky, Hruban et al.1980 ;Reik, Rempel et al.1983 !Hamilton, Ellis etal.2000)。酸肉(RN)基因位于15號染色體，其不利的突變RN最先在漢普夏豬中被發現，使豬屠宰后肌肉pH值偏低，影響豬肉品質。PRKAG3(AMP — activatedProteinKinase3)基因主要影響豬肉的PH值、肉色及滴水損失。該基因中第R200Q發生突變是引起了 RN效應，使豬屠宰后24小時肌肉pH值降低，滴水損失增加(Milan, Jeon et al.2000 ；Lindahl, Enf ?It et al.2004 ；Lindahl, Enf ? It et al.2004 ；Zamaratskaia, Madej et al.2005)。對于豬肉質性狀的候選基因，目前已有多例報道，其中研究得較清楚的是H-FABP、MC4R、IGF2、MyoG, Myostatin, ACSL, PPAR y , AMPDU ADDl 和 CAST。
[0009]前人研究表明，DNAJC3 (P58IPK)基因編碼的蛋白在人和小鼠的所有組織中都有表達，尤其是在胰臟和肝臟中高表達(Korth，Lyons et al.1996)。胰島β細胞中有功能強大的內質網負責折疊、轉運和加工新合成的胰島素(Harding and Ron2002)。各種破壞內質網功能的刺激稱作內質網應激，會導致未折疊的蛋白質在內質網中積累(Schr ? der andKaufman2005)。DNAJC3是負反饋回路中的重要成分，可以抑制eIF_2 α信號通路，并減弱未折疊蛋白反應(Schr? der and Kaufman2005)。在小鼠中敲除DNAJC3基因后小鼠體重降低，即使自由采食10~12個月，小鼠的體脂〈10%，進而減少肥胖的產生。導致體脂減少的機制可能是β細胞的凋亡和可用胰島素的減少，進而阻止葡萄糖向脂肪的轉化和儲存(Ladiges, Knoblaugh et al.2005)。當胰島β細胞不能補償適當胰島素分泌時的胰島素抵抗，就產生二型糖尿病。
[0010]在人的二型糖 尿病人的胰臟中發現DNAJC3的蛋白水平上調。二型糖尿病的產生與胰島素信號通路的損傷有關。而胰島素控制著肝臟、肌肉和脂肪組織中葡萄糖和脂質的動態平衡。在肝臟中，胰島素促進葡萄糖和脂肪酸的合成。在肌肉和脂肪組織中，胰島素可以刺激葡萄糖的攝入(Stiles，Wang et al.2004)。在屠宰時肌肉中葡萄糖的含量和糖酵解決定了屠宰后24小時后豬肉pH值的高低(Fernandez and Tornbergl991)。
[0011]目前，研究豬DNAJC3基因功能的報道很少， 申請人:運用全基因組關聯分析的方法對這個基因的部分內含子進行了關聯分析和多態研究，并首次在豬DNAJC3基因的內含子找到的肉質性狀SNP分子標記及其單倍型。
【發明內容】
[0012]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供兩個與豬肉pH值性狀相關的SNP分子標記和這兩個SNP構成的單倍型的鑒定及應用。本發明運用全基因組關聯分析的方法尋找與豬肉PH值性狀相關的SNP分子標記及單倍型，以此作為豬肉pH值性狀相關的SNP分子標記及單倍型在標記輔助選擇中的應用。
[0013]本發明通過以下技術方案實現:
[0014] 申請人:通過克隆得到一個與豬肉pH值性狀相關的SNP分子標記，該分子標記的核苷酸序列如下所示:
[0015]AGACGTGGCTTGGACCTGGCGTTGCTCTATGTCTGTGGTGTAGACCGGTGGCTGCAGCTCCGGTTCAACCCCTGGCCTGG GATCCTCCATAGGCTGCAGGTGCAGTCCTAAAACAAAAACACTCTTTGTTTTAATTTAACAATCCTCTAAATTAAATTTT TGTTTGATTTT R GGGTAAATCAGCTCTGTGGCTACAAAAAATAAAAGATCGTTCTAGGGCTGCCACTGACTTGAGCTTG TTATTTTCTCTCTGTAAGTGCTCTAATGTGCTCAACAGAATCTATCCCAGTGTCCCAGCCC
[0016]上述序列172位的堿基R是C或T，導致多態性。
[0017]本發明通過克隆得到另一個與豬肉pH值性狀相關的SNP分子標記，該分子標記的核苷酸序列如下所示:
[0018]AGAGAGGACCAGGGCCAGGAGCTGAGTCTCTACAGCCGTGGAAGGTTTGGGCTGGGAGTGTCATGACAGGTGGGCTTTGA GGGAAACAGGTAGACATTTAGAACGTTAGATAAGGAAAGATGCCATGACTGGAGAAGGGAGAAGGAAGAATTAAGTAAGA TGCCCA RGTTTTTGGAGTGTTCAAATTGGTATGTGTTCAAGCTGTTCCCTGAGAAATTATTTAGAGGAGAAGAAAGGGT ACAAAAAATACAGCTCTCATAAAGACTTCCTGATTCTCAGCAGTTTATTTAATAATTTCTA
[0019]上述序列的167位中的堿基R是A或G，導致多態性。
[0020]上述制備的分子標記可以單獨或組合使用在豬肉pH性狀檢測中的應用。
[0021] 申請人:提供了一種與豬肉pH值性狀相關的SNP分子標記的制備方法，其在于下列步驟:
[0022]I)提取豬基因組DNA;
[0023]2)采集豬的背最長肌，用pH計測量三次試驗豬背最長肌肉樣的pH值，取三次所測結果的平均值作為該肉樣的PH值；
[0024]3)將豬基因組DNA樣品在全基因組芯片上做基因分型；
[0025]4)采用PLINK軟件進行全基因組關聯分析；從中選取與屠宰后24小時的豬肉pH值顯著關聯的SNP,運用Ensembl網站的Variant Effect Predictor工具，注釋該SNP ;然后利用生物信息學方法，對目標區域內的基因進行功能注釋；通過QTLdb網站檢索該位點是否落在報道的與豬肉PH值性狀有關的QTLs中，進一步確定與豬肉pH值性狀相關聯的SNPs ;利用Haploview進行連鎖不平衡分析和單倍型分析。
[0026]本發明通過全基因組關聯分析(GWAS)的方法得到與豬的部分肉質性狀特別是與豬肉PH值性狀相關聯的SNP分子標記，為豬的分子標記輔助選擇提供了兩個新的分子標記和一個單倍型。
[0027]更詳細的技術方案參見《【具體實施方式】》。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]序列表SEQ ID NO:1是從NCBI網站下載的與豬肉質性狀相關基因DNAJC3內含子I部分核苷酸序列，經過檢測分析得到本發明的第一個分子標記，序列長度為300bp，在該序列的172bp處存在一個等位基因的突變，即由C突變為T。
[0029]序列表SEQ ID NO:2是從NCBI網站下載的與豬肉質性狀相關基因DNAJC3內含子IV部分DNA序列。經過檢測 分析得到本發明的第二個分子標記，序列長度為300bp，在該序列的167bp處存在一個等位基因的突變，即由A突變為G。
[0030]圖1:是本發明的技術流程圖。
[0031]圖2:本發明克隆的豬DNAJC3基因內含子I的部分序列，其中位于豬11號染色體DNAJC3基因第I個內含子第23633位堿基處(在本克隆的片段中的第172bp處)的即括號內為等位基因的突變位點。
[0032]圖3:本發明克隆的豬DNAJC3基因內含子IV的部分序列，其中位于豬11號染色體DNAJC3基因第4個內含子第8181位堿基處(在本克隆的片段中的第167bp處)的即括號內為等位基因的突變位點。
[0033]圖4:本發明分析得到的由多態性位點rs80855156和rs80882127構成的一個單倍型。
【具體實施方式】
[0034]一、實驗樣品采集
[0035]實驗豬群來自湖北金林原種畜牧有限公司種豬場的233頭純種大白豬公豬(已閹害I]，體重為90kg左右)。豬群自由采食、飲水，整個飼喂方式、飼養條件等始終保持一致，為常規方法。[0036]在屠宰前，采集所有試驗豬的耳組織樣品，放入75%乙醇中保存，為提取豬基因組DNA(具體方法參照北京天根生化技術有限公司生產的基因組DNA試劑盒提供的說明書)備用。屠宰完后，從胸、腰椎間砍斷脊柱與眼肌。然后切取左半胴體背最長肌為肉樣，用于肌肉品質測定。
[0037]二、背最長肌pH值測定
[0038]試驗豬死亡后24h，用手術刀在胴體上劃開一個小口，將電子溫度計插入樣品中測定溫度，并根據當時室溫用pH = 4.0和pH = 7.0的標準液對酸度計進行標定；于樣品最少Icm深處用手術刀或剪刀將肉樣搗碎；小心地將探頭插入搗碎的肉樣中，讓探頭與肉樣充分接觸；待酸度計讀數穩定時，記下PH值；然后在采樣部位另選兩處，按上述同樣的方法進行測定；取三次檢測結果的平均值，作為該肉樣的PH值。
[0039]二、豬基因組DNA的提取與檢測
[0040]試驗采用北京天根生化技術有限公司生產的基因組DNA試劑盒(TIANamp GenomicDNA Kit)從豬耳組織中提取豬基因組DNA，具體操作步驟如下:
[0041]I)用眼科手術剪(用前酒精棉擦拭干凈)將取自大白豬耳樣剪成糊狀，加200 μ I緩沖
[0042]液GA (該試劑盒自帶)，振蕩至徹底懸浮。
[0043]2)加入20 μ I蛋白酶K溶液(該試劑盒自帶)，混勻，置于56°C水浴鍋消化過夜。
[0044]3)加入200 μ I緩沖液GB (該試劑盒自帶)，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶
液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
[0045]4)加入200 μ I無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
[0046]5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(~13，400Xg)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0047]6)向吸附柱CB3中加入500 μ I緩沖液⑶(該試劑盒自帶)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0048]7)向吸附柱CB3中加入600 μ I漂洗液PW(該試劑盒自帶)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0049]8)重復操作步驟7。
[0050]9)將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0051]10)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ 1洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0052]11)取2 μ L上一步所得溶液DNA溶液和I μ L加樣緩沖液混勻，上樣于1.2%的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳20分鐘左右，紫外燈下觀測電泳結果并拍照，以判斷DNA的完整性。用 NanoDrop2000 核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific,USA)對提取后的 DNA進行質量檢測，A260/A280的比值在1.7-2.1之間，A260/A230在1.8-2.2之間被判定為合格。對合格的DNA進行濃度測定，然后將濃度統一稀釋至200ng/ μ L，放入_20°C的冰箱存放。不合格的DNA樣品則需要重新提取。
[0053]四、SNP芯片基因型判定及基因型數據的質控
[0054]將233頭豬耳樣中提 取的基因組DNA樣品在Illumina公司研制的PorcineSNP60BeadChip全基因組芯片上雜交。該芯片中包含61177個SNP位點。
[0055]采用PLINK軟件對所有個體的原始基因型數據進行質控檢驗，以SNP基因型檢出率(SNP call rate) >90%、最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF) >0.01、哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)檢驗的P值〈10-6以及樣本檢出率(sample call rate) >90%等指標為標準。
[0056]五、數據整理與分析
[0057]I)表型數據分析
[0058]利用SAS9.2統計分析軟件，對屠宰后24小時的pH測定值，進行描述性統計分析，包括計算該性狀的平均值、標準差、最大值和最小值。
[0059]2)全基因組關聯分析
[0060]采用PLINK軟件，進行GWAS分析。 申請人:運用下述混合模型分析數據。模型為:
[0061]Yij = μ +Genotypei+ ε i j
[0062]其中，Yij為處理后的性狀值；μ為每個性狀的均值；genotypei為基因型效應；ε ij為隨機效應。
[0063]3)檢驗SNP與性狀關聯的顯著性。
[0064]當某個SNP符合P〈10_4條件時，我們就認為這個SNP達到了全基因組的基因組水
平顯著。
[0065]4) SNP 注釋
[0066]根據芯片SNP 信息，在 Ensembl 網站(www.ensembl.0rg)的 Sus scrofa Buidl0.2數據庫中，運用Variant Effect Predictor工具,注釋該SNP,即確定SNP位點所在染色體及其在染色體上的物理位置，并由此確定這些顯著SNPs在Ensembl數據庫中已知基因的內部還是側翼區域內。然后利用生物信息學方法，根據Ensembl、NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等網站提供的基因結構、基因類型、基因功能和通路等信息，對目標區域內的基因進行功能注釋。最后通過QTLdb (cn.animalgenome.0rg/cg1-bin/QTLdb/index)網站檢索該位點是否落在已報到的與肉質性狀有關的QTLs中，進一步確定與豬肉質性狀相關聯的SNPs。
[0067]5)單倍型分析
[0068]選定染色體上包含所有與pH值性狀相關的顯著SNPs的區域，并利用Haploview(Version4.2)進行連鎖不平衡分析和單倍型分析。具體步驟如下:將待分析的SNP相應的map文件和ped文件導入到Haploview軟件分析。其中，map文件有兩列，一列是SNP的ID號，一列是該SNP在染色體上的位置(參照NCBI數據庫豬10.2版的基因組)；ped文件的前六列是固定的，依次為家系ID、個體ID、父本ID、母本ID、性別(“I”代表公畜；“2”代表母畜)、表型值，其次是基因型。
[0069]六、結果分析
[0070]對豬DNAJC3基因內含子I多態性位點rs80855156 (ASGA0051428)基因型檢測結果表明在233個個體中AA(TT)基因型有7個，AB (TC)基因型有61個，BB (CC)基因型有165個。所分析的肉質性狀是屠宰后24小時的pH。所得到的相關性狀是屠宰后24小時的pH。結果見表2。
[0071]表1DNAJC3基因內含子I多態性位點rs80855156基因型與屠宰后24小時pH的關聯分析
[0072]
【權利要求】
1.一個與豬肉PH值性狀相關的SNP分子標記，其特征在于，所述的分子標記的核苷酸序列如下所示:
AGACGTGGCTTGGACCTGGCGTTGCTCTATGTCTGTGGTGTAGACCGGTGGCTGCAGCTCCGGTTCAACCCCTGGCCTGG GATCCTCCATAGGCTGCAGGTGCAGTCCTAAAACAAAAACACTCTTTGTTTTAATTTAACAATCCTCTAAATTAAATTTT TGTTTGATTTT R GGGTAAATCAGCTCTGTGGCTACAAAAAATAAAAGATCGTTCTAGGGCTGCCACTGACTTGAGCTTG TTATTTTCTCTCTGTAAGTGCTCTAATGTGCTCAACAGAATCTATCCCAGTGTCCCAGCCC 上述序列172位的堿基R是C或T，導致多態性。
2.一個與豬肉pH值性狀相關的SNP分子標記，其特征在于，所述的分子標記的核苷酸序列如下所示:
AGAGAGGACCAGGGCCAGGAGCTGAGTCTCTACAGCCGTGGAAGGTTTGGGCTGGGAGTGTCATGACAGGTGGGCTTTGA GGGAAACAGGTAGACATTTAGAACGTTAGATAAGGAAAGATGCCATGACTGGAGAAGGGAGAAGGAAGAATTAAGTAAGA TGCCCA RGTTTTTGGAGTGTTCAAATTGGTATGTGTTCAAGCTGTTCCCTGAGAAATTATTTAGAGGAGAAGAAAGGGT ACAAAAAATACAGCTCTCATAAAGACTTCCTGATTCTCAGCAGTTTATTTAATAATTTCTA 上述序列的167位中的堿基R是A或G，導致多態性。
3.權利要求1或2所述的SNP分子標記構成一個豬基因型的單倍型的標記。
4.權利要求1或2所述的分子標記單獨或組合使用在豬肉pH值性狀檢測中的應用。
5.一種與豬肉pH值 性狀相關的分子標記的制備方法，其特征在于下列步驟: 1)提取豬基因組DNA； 2)采集豬的背最長肌，用pH計測量三次試驗豬背最長肌肉樣的pH值，取三次所測結果的平均值作為該肉樣的PH值； 3)將豬基因組DNA樣品在全基因組芯片上作基因分型； 4)采用PLINK軟件進行全基因組關聯分析，從中選取與屠宰后24小時的豬肉pH值顯著關聯的SNP,運用Ensembl網站的Variant Effect Predictor工具，注釋該SNP,然后利用生物信息學方法，對目標區域內的基因進行功能注釋，通過QTLdb網站檢索該位點是否落在報道的與豬肉PH值性狀有關的QTLs中，進一步確定與豬肉pH值性狀相關聯的SNPs ；利用Haploview進行連鎖不平衡分析和基因型的單倍型分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911377SQ201410176021
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】曹建華, 董謙, 趙書紅, 李新云 申請人:華中農業大學