具有解酒功能厭氧菌的篩選方法

具有解酒功能厭氧菌的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有解酒功能厭氧菌的篩選方法。方法包括配制篩選用培養(yǎng)基；取發(fā)酵乳、泡菜等發(fā)酵食品；液體富集培養(yǎng)；固體培養(yǎng)基分離；得到初篩菌株的純培養(yǎng)物；定量分析初篩菌株的解酒能力，選取性能突出的菌株即可。本發(fā)明篩選的菌株能在體內(nèi)厭氧環(huán)境中迅速降解乙醇，并安全可靠。本發(fā)明方法具有簡單有效、針對性強、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點，并且能篩選出安全高效的解酒功能菌株。
【專利說明】具有解酒功能厭氧菌的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及菌的篩選方法，尤其涉及一種功能性厭氧菌的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酒自古以來同我國歷史文化密不可分，在世界各地酒同樣是倍受歡迎的飲品。適量飲酒能為身體健康帶來益處，但是過量飲酒導(dǎo)致的醉酒不僅會對身體造成負(fù)面影響，而且酒醉往往會使人失去理智以致嚴(yán)重后果。因此，研制開發(fā)高效的解酒制品成為國內(nèi)外共同關(guān)注的課題。
[0003]目前市場上的解酒制品多側(cè)重化學(xué)合成藥物和天然中草藥，未有以活體益生菌為載體的解酒制品，解酒效果也相對比較不夠理想，未能根本上減少人體對乙醇的吸收和減輕乙醇的毒害作用。
[0004]益生菌被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織定義為“當(dāng)攝入足夠的量能為宿主提供健康益處的活的微生物”。乳酸菌和雙歧桿菌是最常見的益生菌類型并且不斷有證據(jù)表明一些益生乳酸桿菌能提供對健康有益的作用，如抑制有害的腸道細(xì)菌和代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)免疫功能，抑制腸道疾病，抗過敏，抑制炎癥和抗癌等功效。被用于作為各種發(fā)酵乳制品和膳食補充劑的發(fā)酵劑的雙歧桿菌 已經(jīng)被證實了有益生和對胃的保護作用[1]。以富含益生菌的食品作為篩選對象，得到具有解酒效果的功能性益生菌株，不僅可以為開發(fā)高效的益生菌解酒產(chǎn)品提供基礎(chǔ)，而且具有重要的理論價值和應(yīng)用前景。
[0005]但是考慮到體內(nèi)的厭氧環(huán)境，篩選條件必須為嚴(yán)格的厭氧條件。
[0006]綜合考慮體內(nèi)的厭氧環(huán)境和安全性問題，克服傳統(tǒng)篩選方法篩選到的解酒菌株難以適應(yīng)體內(nèi)的厭氧環(huán)境，并且由于安全性無法直接用于人體，即使獲得了菌株，其在體內(nèi)對酒精的降解效能低且不穩(wěn)定的缺陷，使得篩選得到的具有解酒功能厭氧菌可用于幫助人體減輕酒精的毒害作用和盡快醒酒，并能用于開發(fā)新型微生物解酒制劑。
[0007]參考文獻:
[I] Gomi A, Harima-Mizusawa N, Shibahara-Sone H, et al.Effect ofBifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production inan acute gastric injury rat model[J].Journal of Dairy Science, 2013， 96(2):832-837。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)篩選解酒菌存在的難以適應(yīng)體內(nèi)的厭氧環(huán)境并且由于安全性無法直接用于人體，對酒精的降解效能低且不穩(wěn)定的問題，提供一種具有解酒功能厭氧菌的篩選方法。
[0009]具有解酒功能厭氧菌的篩選方法包括如下步驟:
1)分別配制液體富集培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；
2)取發(fā)酵乳、泡菜發(fā)酵食品樣品5~8g ；3)將步驟2)的食品樣品于步驟I)的液體富集培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)5~10h，使乙醇耐受菌充分富集，得到富集培養(yǎng)液；
4)將固體培養(yǎng)基加熱融化，然后冷卻至45°C，迅速將ImL富集培養(yǎng)液與之混合，搖勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落，得到具有解酒功能厭氧菌株；
5)對具有解酒功能厭氧菌株分離純化，并得到具有解酒功能厭氧菌株的純培養(yǎng)物；
6)將具有解酒功能厭氧菌株的純培養(yǎng)物接于MRS液體培養(yǎng)基于厭氧培養(yǎng)箱中、36~38°C條件下培養(yǎng)36~48 h，得到菌液；
7)各取200μ L菌液，以空白培養(yǎng)液作為參照，分光光度計下600 nm處測定樣品菌液相對濃度OD6c?，根據(jù)讀數(shù)用無菌水稀釋菌液至相同菌液濃度IO6~IO8 cfu/mL ；
8)將稀釋的菌液5mL分別與等體積5 %~80 % (v/v)乙醇迅速混合均勻，厭氧環(huán)境37°C靜置0.5~1 h，進行解酒反應(yīng)； 9)測定解酒反應(yīng)前后乙醇濃度的變化值，比較即可得到各初篩菌株的解酒能力的定量大小，選取性能突出的菌株即可。
[0010]所述的液體富集培養(yǎng)基由MRS培養(yǎng)基添加8 % (v/v)無水乙醇，pH 6.8。所述的每升固體篩選培養(yǎng)基是由0.5~2 g KH2PO4、0.3~0.6 g MgSO4.7Η20、0.I~0.5 g NaCl、4~6 g(NH4)2SO4^0.01-0.02 g FeSO4.7Η20、20~25 g瓊脂、8 % (v/v)無水乙醇和余量的蒸餾水組成。固體篩選培養(yǎng)基滅菌前的pH為7。
[0011]整個篩選過程在厭氧條件下進行。
[0012]本發(fā)明使用的固體篩選培養(yǎng)基中乙醇為唯一碳源，液體和固體培養(yǎng)基均用于厭氧狀態(tài)培養(yǎng)微生物且兩種培養(yǎng)基中乙醇的添加均在滅菌冷卻后接種培養(yǎng)前進行。篩選到的解酒菌株能在體內(nèi)厭氧環(huán)境高效穩(wěn)定地降解乙醇，并且菌株來源為食品，故安全可靠。本發(fā)明的方法具有簡單有效、針對性強、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點，并且能篩選出安全高效的體內(nèi)解酒功能菌株。本發(fā)明的使用不僅能為新型微生物解酒制品的開發(fā)提供載體，而且為益生菌功能的研究和利用開辟了新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本篩選方法實施例1定量篩選結(jié)果圖。
[0014]圖2為本篩選方法實施例2定量篩選結(jié)果圖。
[0015]圖3為基于篩選得到的性能突出菌株K4-8與H4和相類似菌株16S rDNA序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實施方式】
[0016]下面詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施例。
[0017]實施例1、
1)分別配制液體富集培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；
液體富集培養(yǎng)基:由MRS培養(yǎng)基添加8 % (v/v)無水乙醇，pH 6.8 ；
固體篩選培養(yǎng)基:由 2 g KH2P04、0.6 g MgSO4.7Η20、0.5 g NaCl,6 g (NH4)2SO4^0.02g FeSO4.7H20、25 g瓊脂、8 % (v/v)無水乙醇和余量的蒸餾水組成，滅菌前的pH為7 ;
2)選擇新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品奶疙瘩作為篩選樣品，取新鮮的奶疙瘩8g；3)將新鮮的奶疙瘩8g放入盛50 mL已滅菌富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于厭氧培養(yǎng)箱中37°C下靜置培養(yǎng)10 h，使樣本中乙醇耐受菌充分富集，得到富集培養(yǎng)液；
4)將固體培養(yǎng)基加熱融化，然后冷卻至45°C，迅速將ImL富集培養(yǎng)液與之混合，搖勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落，得到具有解酒功能厭氧菌株；
5)對具有解酒功能厭氧菌株分離純化，并得到具有解酒功能厭氧菌株的純培養(yǎng)物；
6)配制發(fā)酵培養(yǎng)基及重鉻酸鉀-硫酸溶液；
發(fā)酵培養(yǎng)基=MRS培 養(yǎng)基，pH 6.8 ；
重鉻酸鉀-硫酸溶液:取重鉻酸鉀I g溶于25 mL水中，邊攪拌邊小心加入4 mL濃硫
酸；
7)挑取待測菌株的一環(huán)菌體接種于MRS液體培養(yǎng)基，于厭氧培養(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)48 h，得到菌液。
[0018]8)各取200 μ L菌液，以空白培養(yǎng)液作為空白對照，分光光度計下600 nm處測定樣品吸光度，分光光度計讀數(shù)即為菌液相對濃度OD6tltl ;根據(jù)讀數(shù)用無菌水稀釋培養(yǎng)物至相同菌液濃度IO7 cfu/mL。
[0019]9)向玻璃試管中加入乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，每個試管中加入重鉻酸鉀-硫酸溶液
1.0mL，充分搖勻，并蓋好蓋子；將試管置于沸水域中10 min，使乙醇充分揮發(fā)，并被重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化；取出試管，于波長610 nm處測定重鉻酸鉀-硫酸溶液的吸光值；以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對照，即可得到樣品的乙醇濃度。
[0020]10)將同一濃度的菌液5 mL分別與等體積40 % (v/v)乙醇溶液迅速混合均勻，厭氧環(huán)境37°C靜置0.5 h ;然后按照4中所述的方法，測定乙醇的殘留量；比較即可得到各初篩菌株的解酒能力的定量大小，選取性能突出的菌株即可。
[0021]實施例2、
1)分別配制液體富集培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；
液體富集培養(yǎng)基:由MRS培養(yǎng)基添加8 % (v/v)無水乙醇，pH 6.8 ；
固體篩選培養(yǎng)基:由 I g KH2P04、0.3 g MgS04.7Η20、0.I g NaCl、5 g (NH4)2SO4^0.01g FeSO4.7H20、25 g瓊脂、8 % (v/v)無水乙醇和余量的蒸餾水組成，滅菌前的pH為7 ;
2)選擇新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品奶疙瘩作為篩選樣品，取新鮮的奶疙瘩6g；
3)將新鮮的奶疙瘩6g放入盛50 mL已滅菌富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于厭氧培養(yǎng)箱中37°C下靜置培養(yǎng)6 h，使樣本中乙醇耐受菌充分富集，得到富集培養(yǎng)液；
4)將固體培養(yǎng)基加熱融化，然后冷卻至45°C，迅速將ImL富集培養(yǎng)液與之混合，搖勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落，得到具有解酒功能厭氧菌株；
5)對具有解酒功能厭氧菌株分離純化，并得到具有解酒功能厭氧菌株的純培養(yǎng)物；
6)配制發(fā)酵培養(yǎng)基及重鉻酸鉀-硫酸溶液；
發(fā)酵培養(yǎng)基=MRS培養(yǎng)基，pH 6.8 ；
重鉻酸鉀-硫酸溶液:取重鉻酸鉀I g溶于25 mL水中，邊攪拌邊小心加入4 mL濃硫
酸；
7)挑取待測菌株的一環(huán)菌體接種于MRS液體培養(yǎng)基，于厭氧培養(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)36 h，得到菌液。[0022]8)各取200 μ L菌液，以空白培養(yǎng)液作為空白對照，分光光度計下600 nm處測定樣品吸光度，分光光度計讀數(shù)即為菌液相對濃度OD6tltl ;根據(jù)讀數(shù)用無菌水稀釋培養(yǎng)物至相同菌液濃度IO6 cfu/mL。
[0023]9)向玻璃試管中加入乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，每個試管中加入重鉻酸鉀-硫酸溶液
1.0mL，充分搖勻，并蓋好蓋子；將試管置于沸水域中10 min，使乙醇充分揮發(fā)，并被重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化；取出試管，于波長610 nm處測定重鉻酸鉀-硫酸溶液的吸光值；以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對照，即可得到樣品的乙醇濃度。
[0024]10)將同一濃度的菌液5 mL分別與等體積80 % (v/v)乙醇溶液迅速混合均勻，厭氧環(huán)境37°C靜置I h ;然后按照4中所述的方法，測定乙醇的殘留量；比較即可得到各初篩菌株的解酒能力的定量大小，選取性能突出的菌株即可。
[0025]實施例3、
1)分別配制液體富集培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基；
液體富集培養(yǎng)基:由 MRS培養(yǎng)基添加8 % (v/v)無水乙醇，pH 6.8 ；
固體篩選培養(yǎng)基:由 0.5 g KH2P04、0.3 g MgSO4.7Η20、0.I g NaCl,4 g (NH4)2SO4^0.01g FeSO4.7H20、20 g瓊脂、8 % (v/v)無水乙醇和余量的蒸餾水組成，滅菌前的pH為7 ;
2)選擇韓國傳統(tǒng)發(fā)酵食品韓國泡菜作為篩選樣品，取韓國泡菜5g；
3)將韓國泡菜5g放入盛50 mL已滅菌富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于厭氧培養(yǎng)箱中37°C下靜置培養(yǎng)5 h，使樣本中乙醇耐受菌充分富集，得到富集培養(yǎng)液；
4)將固體培養(yǎng)基加熱融化，然后冷卻至45°C，迅速將ImL富集培養(yǎng)液與之混合，搖勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落，得到具有解酒功能厭氧菌株；
5)對具有解酒功能厭氧菌株分離純化，并得到具有解酒功能厭氧菌株的純培養(yǎng)物；
6)配制發(fā)酵培養(yǎng)基及重鉻酸鉀-硫酸溶液；
發(fā)酵培養(yǎng)基=MRS培養(yǎng)基，pH 6.8 ；
重鉻酸鉀-硫酸溶液:取重鉻酸鉀I g溶于25 mL水中，邊攪拌邊小心加入4 mL濃硫
酸；
7)挑取待測菌株的一環(huán)菌體接種于MRS液體培養(yǎng)基，于厭氧培養(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)36 h，得到菌液。
[0026]8)各取200 μ L菌液，以空白培養(yǎng)液作為空白對照，分光光度計下600 nm處測定樣品吸光度，分光光度計讀數(shù)即為菌液相對濃度OD6tltl ;根據(jù)讀數(shù)用無菌水稀釋培養(yǎng)物至相同菌液濃度IO6 cfu/mL。
[0027]9)向玻璃試管中加入乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，每個試管中加入重鉻酸鉀-硫酸溶液
1.0mL，充分搖勻，并蓋好蓋子；將試管置于沸水浴中10 min，使乙醇充分揮發(fā)，并被重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化；取出試管，于波長610 nm處測定重鉻酸鉀-硫酸溶液的吸光值；以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對照，即可得到樣品的乙醇濃度。
[0028]10)將同一濃度的菌液5 mL分別與等體積5 % (v/v)乙醇溶液迅速混合均勻，厭氧環(huán)境37°C靜置0.5 h ;然后按照4中所述的方法，測定乙醇的殘留量；比較即可得到各初篩菌株的解酒能力的定量大小，選取性能突出的菌株即可。
【權(quán)利要求】
1.一種具有解酒功能厭氧菌的篩選方法，其特征在于它包括如下步驟: 1)分別配制液體富集培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基； 2)取發(fā)酵乳、泡菜發(fā)酵食品樣品5~8g ； 3)將步驟2)的食品樣品于步驟1)的液體富集培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)5~10h，使乙醇耐受菌充分富集，得到富集培養(yǎng)液； 4)將固體培養(yǎng)基加熱融化，然后冷卻至45°C，迅速將1mL富集培養(yǎng)液與之混合，搖勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中、37°C條件下培養(yǎng)，直至長出菌落，得到具有解酒功能厭氧菌株； 5)對具有解酒功能厭氧菌株分離純化，并得到具有解酒功能厭氧菌株的純培養(yǎng)物； 6)將具有解酒功能厭氧菌株的純培養(yǎng)物接于MRS液體培養(yǎng)基于厭氧培養(yǎng)箱中、36~38°C條件下培養(yǎng)36~48 h，得到菌液； 7)各取200μ L菌液，以空白培養(yǎng)液作為參照，分光光度計下600 nm處測定樣品菌液相對濃度OD6c?，根據(jù)讀數(shù)用無菌水稀釋菌液至相同菌液濃度IO6~IO8 cfu/mL ； 8)將稀釋的菌液5mL分別與等體積5 %~80 % (v/v)乙醇迅速混合均勻，厭氧環(huán)境37°C靜置0.5~1 h，進行解酒反應(yīng)； 9)測定解酒反應(yīng)前后乙 醇濃度的變化值，比較即可得到各初篩菌株的解酒能力的定量大小，選取性能突出的菌株即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有解酒功能厭氧菌的篩選方法，其特征在于所述的液體富集培養(yǎng)基由MRS培養(yǎng)基添加8 % (v/v)無水乙醇，pH 6.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有解酒功能厭氧菌的篩選方法，其特征在于所述的每升固體篩選培養(yǎng)基是由 0.5~2 g KH2PO4、0.3~0.6 g MgSO4.7Η20、0.1~0.5 g NaCl、4~6 g(NH4)2SO4^0.01-0.02 g FeSO4.7Η20、20~25 g瓊脂、8 % (v/v)無水乙醇和余量的蒸餾水組成。
【文檔編號】C12N1/02GK103937674SQ201410154208
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】周文文, 屠鵬程, 鄭曉冬, 熱米拉, 李瑋, 高慧 申請人:浙江大學(xué)