用于檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒及其使用方法。所述試劑盒包括一對可以同時擴增α-珠蛋白基因簇中α1區段的特征序列A1和α2區段的特征序列A2的引物，一對擴增α-珠蛋白基因簇中--SEA基因型的引物，一對擴增α-珠蛋白基因簇中--THAI基因型的引物；一條特異性檢測α1區段的特征序列A1的熒光探針，一條特異性檢測α2區段的特征序列A2的熒光探針，一條特異性檢測--SEA基因型擴增產物的熒光探針，以及一條特異性檢測--THAI基因型擴增產物的熒光探針。本發明所述試劑盒對α-地中海貧血珠蛋白基因缺失檢測具有高度的靈敏性、穩定性、準確性及較高的特異性。
【專利說明】用于檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學檢測【技術領域】，具體涉及一種用于檢測常見缺失型α -地中海貧血的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]地中海貧血簡稱地貧， 是最常見的單基因遺傳疾病之一，常見的地貧種類有α-地貧和β_地貧，分別由α-蛋白基因簇和β_珠蛋白基因簇異常表達引起。在我國，廣西、廣東和海南是地中海貧血的高發省份，其中廣西α-地貧的發病率是15.5%。中國人群中，缺失型α-地貧的基因型常見基因型為--SEA、-α 37和-α42，以及廣西區內相對常見的泰國型缺失(一?1)。
[0003]同源基因定量技術是一種根據基因的同源性，采用共同的擴增引物對同源基因進行擴增，最后采用熒光標記法或者探針法對基因的含量進行相對定量的方法。α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)由調控因子(HS-40)，α基因(α?和α 2)，ζ基因U 2)，假基因(Ψ ζ I, Ψ α 2αη?Ψ α I)和 θ 組成，其排列順序為:HS40 - ζ2-Ψζ1-Ψα2_Ψα1-α 2 - α 1- Θ。α地中海貧血基因據其同源性，可劃分為XI，Χ2，Yl, Υ2，Zl和Ζ2區間，其中-α 3 7(也稱為右側缺失)的形成源于Zl和Ζ2之間的同源重組，其DNA結構表現為僅僅包含一個α I區段，而-α 4 2 (也稱為左側缺失)則來源于Xl和Χ2之間的同源重組，如圖1所示,其DNA結構表現為存在一個α 2-α I的融合基因。對-α 3 7和-α 4 2攜帶者而言,其表現型及危害相似。然而，由于-α 3 7和-α 4 2均由大區段同源基因重組產生，因而不同個體所攜帶的- α 3 7或- α 4 2基因序列并不一致，因此，目前常用的診斷方法為通過跨越斷點式PCR (Gap-PCR)將其擴增出來，但因其區段長度較長，導致檢測時間也較長。另一方面，由于- α 3 7和- α 4 2的危害相似，如果可以將其簡并進行檢測，則可以實現短區段快速擴增檢測。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種用于檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒及其使用方法。采用該試劑盒可以相對定量檢測α-珠蛋白基因簇中α?和α2功能基因的拷貝數及拷貝數的變化。
[0005]本發明所述的用于檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒，包括擴增引物和熒光探針，所述的擴增引物為:一對可以同時擴增α-珠蛋白基因簇中α I區段的特征序列Al和α 2區段的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R，一對擴增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一對擴增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物THA1-F和THA1-R ;所述的熒光探針為:一條特異性檢測α I區段的特征序列Al的熒光探針Al-Prob，一條特異性檢測α 2區段的特征序列Α2的熒光探針A2_Prob，一條特異性檢測一SEA基因型擴增產物的熒光探針SEA-Prob，以及一條特異性檢測一?1基因型擴增產物的熒光探針THA1-Prob ；
[0006]其中:
[0007]所述的可以同時擴增α-珠蛋白基因簇中α I區段的特征序列Al和α 2區段的特征序列Α2的引物對中，
[0008]AIA2-F: 5，-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3，；
[0009]A1A2-R:5， -GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3，；
[0010]所述的擴增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物對中，
[0011]SEA-F: 5，-CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3，；
[0012]SEA-R:5’ -CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’ ；
[0013]所述的擴增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物對中，
[0014]THA1-F:5，-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3，；
[0015]THA1-R:5’ -CTTGGATCTGCACCTCTG-3’ ；
[0016]所述的特異性檢測特α I區段的征序列Al的熒光探針Al-Prob為:
[0017]Al-Prob:5’ 6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’ BHQ-1 ；
[0018]所述的特異性檢測α 2區段的特征序列Α2的熒光探針A2_Prob為:
[0019]A2-Prob:5’ ROX - CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’ BHQ-2 ；
[0020]所述的特異性檢測一SEA基因型擴增產物的熒光探針SEA-Prob為:
[0021]SEA-Prob:5’ -HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’ ；
[0022]所述的的特異性檢測一THAI基因型擴增產物的熒光探針THA1-Prob為:
[0023]THA1-Prob:5’ -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。
[0024]本發明所述的熒光探針中，FAM指羧基熒光素，HEX指六氯-6-甲基熒光素，ROX指羧基-X-羅丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ-1和BHQ-2是指熒光淬滅基團。
[0025]上述技術方案中，所述α I區段的序列為:5’-ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTG GCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’ ；該 α I 區段的特征序列 Al為:5 ’-GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，。
[0026]上述技術方案中，所述α 2區段的序列為:5’ -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3’ ；該 α 2 區段的特征序列 Α2 區段為:5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，。
[0027]本發明所述的用于檢測常見缺失型α -地中海貧血的試劑盒還包括一些現有試劑盒中常規且必須的組分，如緩沖液、酶液、MgCl2和dNTP等，具體的，酶液即為DNA聚合酶，具體可采用康為世紀所生產的GoldStar Taq DNA Polymerase,緩沖液為與GoldStar TaqDNA Polymerase配套的緩沖液。
[0028]本發明還提供采用上述試劑盒進行快速檢測常見缺失型α-地中海貧血(如一SEA、-α和一ΤΗΑΙ)的方法，包括以下步驟:
[0029]1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；
[0030]2)配制反應體系，具體為:
[0031]取可以同時擴增α-珠蛋白基因簇中α I區段的特征序列Al和α 2區段中的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R、擴增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R、擴增α -珠蛋白基因簇中一?ΑΙ基因型的Gap-PCR引物THA1-F和THA1-R ；特異性檢測α I區段的特征序列Al的熒光探針ΑΙ-ΡιχΛ、特異性檢測α 2區段的特征序列Α2的熒光探針Α2-ΡιχΛ、特異性檢測一SEA基因型擴增產物的熒光探針SEA-Prob、特異性檢測一?1基因型擴增產物的熒光探針THA1-Prob ；以及PCR緩沖液、酶液、MgCl2, dNTP、水和DNA模板配制成反應體系；
[0032]3)樣本檢測:分別將配制的反應體系進行PCR擴增，記錄每個PCR反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環次數Cq(Cq值的大小可以反映所檢測模板數的多少)；
[0033]4)數據分析及結果判定:根據定量檢測所獲得的Cq值，以正常基因型樣本為對照標本，按下述公式進行計算:
[0034]待檢樣本的基因ACq = Cq_A2-Cq_A1 ；
[0035]待檢樣本的基因Δ Δ Cq =八Cq_待檢樣本_ Δ Cq_正常樣本；
[0036]待檢樣本的Al和A2相對拷貝數比值R = 2肩;
[0037]根據R的值結合下述表1中進行結果判定:
[0038]表1:
[0039]
【權利要求】
1.用于檢測常見缺失型α-地中海貧血的試劑盒，包括擴增引物和熒光探針，其特征在于: 所述的擴增引物為:一對可以同時擴增α-珠蛋白基因簇中α I區段的特征序列Al和α 2區段的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R，一對擴增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R，以及一對擴增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR 引物 THA1-F 和 THA1-R ； 所述的熒光探針為:一條特異性檢測α I區段的特征序列Al的熒光探針ΑΙ-ΡιχΛ，一條特異性檢測α 2區段的特征序列Α2的熒光探針Α2-ΡιχΛ，一條特異性檢測__SEA基因型擴增產物的熒光探針SEA-Prob，以及一條特異性檢測一THAI基因型擴增產物的熒光探針THA1-Prob ； 其中: 所述的可以同時擴增α-珠蛋白基因簇中α I區段的特征序列Al和α 2區段的特征序列Α2的引物對中，
A1A2-F:5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’ ；
A1A2-R:5， -GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3，； 所述的擴增α-珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物對中，
SEA-F:5’ -CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3’ ；
SEA-R:5’ -CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3’ ； 所述的擴增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物對中，
THA1-F:5’ -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’ ；
THA1-R:5’ -CTTGGATCTGCACCTCTG-3’ ； 所述的特異性檢測特α I區段的征序列Al的熒光探針Al-Prob為:
Al-Prob:5’ 6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3’ BHQ-1 ； 所述的特異性檢測α 2區段的特征序列Α2的熒光探針A2-Prob為:
A2-Prob:5’ ROX - CCTGGGCCGCACTGACCCTC-3’ BHQ-2 ； 所述的特異性檢測一SEA基因型擴增產物的熒光探針SEA-Prob為:
SEA-Prob:5’ -HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3’ ； 所述的的特異性檢測一THAI基因型擴增產物的熒光探針THA1-Prob為:
THA1-Prob:5’ -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 所述αI區段的序列為:
5’ -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTC
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于: 所述α I區段的特征序列Al為:
5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，； 所述α 2區段的特征序列Α2為:
5’ -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3，。
4.根據權利要求1~3中任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒還包括PCR緩沖液、酶液、MgCl2和dNTP。
5.采用權利要求1所述試劑盒進行快速檢測常見缺失型α-地中海貧血的方法，包括以下步驟: 1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板； 2)配制反應體系，具體為: 取可以同時擴增α-珠蛋白基因簇中α I區段的特征序列Al和α 2區段的特征序列Α2的引物A1A2-F和A1A2-R、擴增α -珠蛋白基因簇中一SEA基因型的Gap-PCR引物SEA-F和SEA-R、擴增α -珠蛋白基因簇中一ΤΗΑΙ基因型的Gap-PCR引物THA1-F和THA1-R ;特異性檢測α I區段的特征序列Al的熒光探針ΑΙ-ΡιχΛ、特異性檢測α 2區段的特征序列Α2的熒光探針A2-Pi*0b、特異性檢測一SEA基因型擴增產物的熒光探針SEA-Prob、特異性檢測一?1基因型擴增產物的熒光探針THA1-Prob ；以及PCR緩沖液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反應體系； 3)樣本檢測:分別將配制的反應體系進行PCR擴增，記錄每個PCR反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環次數Cq ； 4)數據分析及結果判定:根據定量檢測所獲得的Cq值，以正常基因型樣本為對照標本，按下述公式進行計算: 待檢樣本的基因ACq = Cq_A2-Cq_A1 ； 待檢樣本的基因Δ Δ Cq = Δ〇口_待檢樣本-Δ 0口_正常樣本；待檢樣本的Al和A2相對拷貝數比值R = 2-"'cq ； 根據R的值結合下述表1中進行結果判定: 表1:
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:步驟3)中，PCR擴增條件為:95°C預變性8~10分鐘，然后95°C 15~30秒，60°C退火50~70秒，39~49個循環。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:PCR擴增條件為:95°C預變性10分鐘，然后95°C 15秒，60°C退火60秒，40個循環。
【文檔編號】C12N15/11GK103966319SQ201410152710
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月16日 優先權日:2014年4月16日
【發明者】龍駒 申請人:龍駒