一種鑒定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法
【專利摘要】本發明涉及一種鑒定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法，屬于水稻遺傳改良與農業生物技術應用領域。根據Pi-ta和Pi-b基因抗、感等位基因的差異，開展了分子標記引物的改良、PCR反應組分的摸索以及循環參數的優化，建立了能同時鑒定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法。與單個基因的標記檢測方法相比，本發明能夠對水稻種質資源或育種群體中Pi-ta和Pi-b的抗、感基因型進行同步鑒定和選擇，從而提高稻瘟病抗性基因的聚合育種效率，加速抗病品種的選育。
【專利說明】—種鑒定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鑒定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法，屬于水稻遺傳改良與農業生物技術應用領域，專用于含P1-ta與P1-b抗性基因水稻資源的鑒定和聚合育種研究。
二、【背景技術】
[0002]稻痕病是由子囊菌(Magnaporthegrisea)引起的一種水稻真菌病害,其危害面積和程度之大已經對水稻高產、穩產造成了嚴重的阻礙。據統計，全球每年因稻瘟病損失的水稻產量約占總產量的10%~15%，足以供應6000萬人I年的口糧(鄭釗等，分子植物育種，2009，7(3):385-392)，而我國的稻瘟病危害也相當嚴重，自上世紀90年代以來，我國稻瘟病的年發生面積均在380萬hm2以上，年損失稻谷達數億公斤(董繼新等，農業生物技術學報，2000，8 (I):99-102.)。實踐證明，培育抗性品種是防治稻瘟病最經濟、有效的方法。但由于稻瘟病菌變異性強，很多抗性品種種植幾年就會喪失抗性(沈瑛等，植物病理學報，1993, 23 (4): 309-313)。因此,利用分子標記輔助選擇(Marker-assistedSelection,MAS)技術將多個具有不同抗譜的稻瘟病抗病基因聚合到同一個品種中，是培育具有持久抗瘟性品種的有效措施(HittalmaniS, etal.，TheorApplGenet, 2000，100(7): 1121-1128)。
[0003]隨著分子生物學技術的迅速發展，迄今已有50多個主效抗稻瘟病基因被精細定位，其中 24 個基因被克隆(ZhaiC, etal., NewPhytologist, 2011, 189 (I): 1-14; HayashiN, etal., PlantJ, 2010, 64(3):498-510;OkuyamaY, etal., PlantJ, 2011, 66 (3):467-479; YuanB,etal., TheorAppl Genet,2011,122 (5):1017-1028;TakahashiA, etal., BMCPlantBiolog
I,2010, 10:175)。P1-ta和P1-b是最早被克隆的兩個主效稻瘟病抗性基因。其中，Pi_ta是目前研究最廣泛的稻瘟病抗性基因，該基因起源于秈稻，位于水稻第12染色體著絲點附近區域。P1-ta與無毒基因AVR-Pita直接互作，并遵循基因對基因假說(BryanGT，etal.，PlantCell, 2000，12(11):2033-2046)。Pi_b基因來源于水稻品種“BL1”，位于水稻第2染色體長臂近末端區域，與RFLP標記RZ123，C379，C2782B連鎖，該基因對日本大多數稻瘟病菌生理小種具有抗性并受環境因素(如溫度、光照等)的誘導和調控(WangZX，etal.，PlantJ, 1999，19(1):55-64)。
[0004]為提高含稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b水稻資源鑒定和品種選育效率，許多研究者進行了大量的嘗試，并相繼開發了上述兩個基因的抗、感位點的功能標記，用于稻瘟病抗性種質資源的篩選、鑒定。李進斌等利用特異性功能標記分析了云南地方稻種中抗性基因P1-ta和P1-b的等位性變異和分布(李進斌等，中國水稻科學，2012，26(5):593-599)；劉華招和時克等利用同樣的分子標記分別對黑龍江水稻主推品種和我國主栽品種進行了P1-ta和P1-b基因型的鑒 定和分析(劉華招等，東北農業大學學報，2011，42 (41): 27-31;時克等，植物遺傳資源學報，2009，10 (I): 21-26)。這些研究側重于利用標記分析Pi_ta和P1-b抗性基因在不同水稻品種中的分布，很少涉及對上述標記進行檢測方法的優化，同時對抗性基因P1-ta和P1-b進行基因型鑒定的分子標記方法目前尚未見報道。與單一基因分子標記的PCR方法相比，多重PCR在一次反應中就可對多個目標基因的等位性進行檢測，具有效率高、成本低等優點，因而在品種資源鑒定和標記輔助育種中有著廣闊的應用前景(MaW, etal., Euphytica, 2003, 134(I):51-60;NakamuraT, etal., Genome, 2002, 45(6):1150-1156)。
[0005]為實現對稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b基因型的快速鑒定，本發明通過標記引物的改良、PCR反應組分的摸索以及循環參數的優化，構建了稻瘟病兩個抗性基因分子標記的多重PCR反應體系。由于體系內引物之間不存在相互抑制、互補和錯配，因而能在同一 PCR體系中能對水稻品種中P1-ta和P1-b兩個基因進行同步篩選和鑒定，通過多次試驗反復驗證，結果非常準確、穩定。因此，作為一種高效的分子標記方法，本發明不僅能有效鑒定水稻品種資源中稻瘟病的抗、感基因型，同時也能應用于P1-ta和P1-b抗性基因的聚合育種，加速稻瘟病抗性水稻品種的培育。
三、
【發明內容】
[0006]技術問題:本發明針對稻瘟病抗性種質篩選和聚合育種中，利用單一 PCR的方法對P1-ta和P1-b基因型進行區分其試驗流程較為煩瑣，費時費工的狀況，通過分析標記引物、PCR反應組分和循環參數對多重PCR體系的影響，構建了稻瘟病抗病基因P1-ta和Pi_b的多重PCR方法。通過在一次PCR反應對稻瘟病基因P1-ta和Pi_b不同基因型進行快速、準確的擴增，以達到抗性資源鑒定和標記聚合育種，是本發明的宗旨。[0007]技術方案:
[0008]本發明“一種鑒定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法”，其特征在于:
[0009]利用PCR反應體系I中，
[0010]抗病等位基因P1-ta特異性引物:
[0011]正向P1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0012]反向P1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0013]抗病等位基因P1-b特異性引物:
[0014]正向P1-b-F 序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
[0015]反向P1-b-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’
[0016]和PCR反應體系II中，
[0017]感病等位基因p1-ta特異性引物:
[0018]正向p1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3’
[0019]反向p1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0020]感病等位基因p1-b特異性引物:
[0021 ]正向 p1-b-F 序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’
[0022]反向p1-b-R 序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’
[0023]鑒定水稻稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法為:
[0024](I)水稻植株基因組 DNA 的提取(SDS 法)，參照 DellaportaSL, etal.，PlantMolBiolRep, 1983，1 (1):19221.)；
[0025](2)將稻瘟病抗病等位基因P1-ta特異性引物與P1-b特異性引物加入PCR反應體系I中，同時將感病等位基因P1-ta特異性引物與p1-b特異性引物加入PCR反應體系II中，并對水稻種質資源或育種群體植株的DNA進行擴增；
[0026](3) PCR反應體系I和II中20 μ LPCR反應體系包括=IOng/μ L的DNA2.0 μ L，含25mmol/LMgCl2 的 10XPCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L, 5U/ μ L 的 Taq0.5 μ L,ddH2013.1 μ L和 4pmol/y L 的引物2.0μ L:其中體系 I 中為引物 P1-ta-F、P1-ta-R、P1-b_F和 P1-b-R 各 0.5 μ L，體系 II 中為引物 p1-ta-F, p1-ta-R, p1-b-F 和 p1-b-R 各 0.5 μ L。
[0027](4) PCR體系I和II中的反應程序包括:95°C預變性3min ;然后94°C變性lmin，55°C復性lmin，72°C延伸lmin，6個循環;再進行94°C變性lmin，55°C復性50s，72°C延伸30s, 32個循環，最后72°C延伸6min，10°C冷卻IOmin后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應；(5)反應產物在質量比濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化乙錠染色并于凝膠成像；如果體系I所用兩對引物能同時擴增出1，042bp和365bp兩條特征條帶，即為含Pi_ta和P1-b基因的純合體；如果體系II所用兩對引物能同時擴增出1，042bp和803bp兩條特征條帶，即為含P1-ta與p1-b基因的純合體；如果體系I和體系II分別擴增出1，042bp和803bp的特征條帶，則為含P1-ta與p1-b基因的純合個體；如果體系I和體系II分別擴增出365bp和l，042bp，則為含p1-ta與P1-b基因的純合個體。
[0028]有益效果
[0029]本發明提供的“一種鑒定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法”，具有以下優點:(I)本發明方法中的分子標記是根據基因的變異位點設計的功能性標記，能直接反映植株的表型，不存在由于遺傳交換而造成的錯誤鑒定；
[0030](2)本發明方法中的分子標記均為PCR標記，不涉及DNA測序、限制性內切酶等的使用，不存在操作煩瑣，費用昂貴等弊端，更為高效、快捷；
[0031](3)本發明提供的多重PCR方法能夠實現對含稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的品種資源進行快速、準確的鑒定。由于水稻稻瘟病抗性基因資源相對較多，很難根據其表型進行有效區分，通過本發明提供的分子標記方法能夠對大量稻瘟病抗性資源進行檢測，直接判定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b是否存在，而不需要通過大量、復雜的遺傳試驗設計來對其基因來源進行分析；
[0032](4)本發明提供的多重PCR方法能有效用于稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的聚合育種。傳統育種的做法，首先是利用含P1-ta和P1-b基因的水稻品種與推廣品種進行雜交，然后在分離群體中利用人工接種的方法進行抗病性鑒定，這樣的選育方法不僅受植株生長發育階段的影響，而且耗時、耗力、耗成本。而利用與P1-ta和P1-b基因直接相關的分子標記所構建的多重PCR方法對植株DNA進行檢測，可以在苗期鑒定出含P1-ta和Pi_b雙基因的目標單株，這樣不僅節約育種成本，而且大大提高了稻瘟病抗性品種的選擇效率；
[0033](5)與現有單一基因分子標記的PCR方法相比，本發明提供的多重PCR方法通過兩個反應體系、一次PCR擴增就可以檢測P1-ta和P1-b兩個基因的不同基因型。因此不存在操作煩瑣，費用昂貴等弊端，更為高效、快捷。
四、【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1抗病等位基因P1-ta和P1-b多重PCR的驗證
[0035] (M =DNA分子量標準，100-2，OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因對照品種嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b感病等位基因對照品種麗江新團黑谷；3-12:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因品種南粳44、南粳45、武運粳7號、武運粳8號、武運粳21、武粳15、武香粳14、常農粳5號、鹽稻9號、揚粳805)
[0036]圖2感病等位基因p1-ta和p1-b多重PCR的驗證
[0037](M =DNA分子量標準，100-2，OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因對照品種嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b感病等位基因對照品種麗江新團黑谷；3~12:含pi_ta和pi_b感病等位基因品種徐稻3號、徐稻4號、徐稻6號、鎮稻88、淮稻5號、淮稻9號、連粳4號、連粳5號、連粳6號、連粳7號)
[0038]圖3抗病等位基因P1-ta和P1-b多重PCR對育種品系基因型的檢測
[0039](M =DNA分子量標準，100-2，OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因對照品種嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b感病等位基因對照品種麗江新團黑谷；，3~24:部分檢測品系)
[0040]圖4感病等位基因p1-ta和p1-b多重PCR對育種品系基因型的檢測
[0041](M =DNA分子量標準，100-2, OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因對照品種嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b 感病等位基因對照品種麗江新團黑谷；3~24:部分檢測品系)
五、【具體實施方式】
[0042]為充分公開本發明“一種鑒定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法，以下結合方法驗證和實施實例加以說明。其具體實施步驟如下:
[0043](I)稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b多重PCR方法的構建
[0044]I)分子標記引物的改良
[0045]根據已知P1-ta和P1-b基因抗、感位點功能標記的引物序列，并對其進行改良。由于5’端序列與擴增產物的特異性無關的原則，調整5’端第I個堿基的序列，避免引物間互補配對；同時GC含量也隨之變化，使在同一 PCR體系中能夠擴增的四條引物具有相同的退火溫度。通過梯度PCR對引物的退火溫度進行摸索，明確能夠擴增的最適退火溫度。
[0046]PCR反應體系I中(退火溫度55 °C )，
[0047]抗病等位基因P1-ta特異性引物:
[0048]正向P1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0049]反向P1-ta-R 序列:5，-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0050]抗病等位基因P1-b特異性引物:
[0051 ]正向 P1-b-F 序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
[0052]反向P1-b-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’
[0053]PCR反應體系II中(退火溫度55 °C )，
[0054]感病等位基因p1-ta特異性引物:
[0055]正向p1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3’
[0056]反向p1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0057]感病等位基因p1-b特異性引物:
[0058]正向p1-b-F 序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’
[0059]反向p1-b-R 序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’
[0060]2)多重PCR反應體系中反應組分和PCR擴增過程中循環參數的優化
[0061 ] 按照引物、dNTP,DNA聚合酶等用量配制多重PCR體系，進行PCR擴增和電泳檢測。結合抗、感等位基因對照材料(含P1-ta和P1-b抗病等位基因對照品種嘉33和含p1-ta和p1-b感病等位基因對照品種麗江新團黑谷)擴增的結果，從引物用量、退火溫度、延伸時間和循環數等方面對體系進行調試優化。在體系調試和優化中，主要調整引物濃度相對比例和延伸時間。實驗中先加入等濃度的引物量，根據擴增結果再進行調整，增大弱擴增的引物
用量，
[0062]減少強擴增的引物用量；在優化延伸時間時，弱擴增適當延長。最終，在多重PCR反應體系中，使標記引物在含目標基因的對照材料中擴增出清晰的特異條帶，而在不含目標基因的對照材料中無特異條帶出現。
[0063]PCR 反應體系 I 和 II 中 20 μ LPCR 反應體系包括:10ng/ μ L 的 DNA2.0 μ L，4pmol/μ L 的引物 2.Ομ L:其中體系 I 中引物 P1-ta-F、P1-ta-R, Pi_b_F 和 Pi_b_R 各 0.5 μ L，體系 II 中引物 p1-ta-F、p1-ta-R、p1-b-F 和 pi_b_R 各 0.5 μ L,含 25mmol/LMgCl2 的10XPCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L, 5U/ μ L 的 Taq0.5 μ L 和 ddH2013.1 μ L ；
[0064]PCR體系I和II中的反應程序包括:95°C預變性3min ;然后94°C變性lmin，55°C復性lmin，72°C延伸lmin，6個循環;再進行94°C變性lmin，55°C復性50s，72°C延伸30s, 32個循環，最后72°C延伸6min，10°C冷卻IOmin后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應；
[0065](2)多重PCR擴增試驗中所用水稻材料
[0066]驗證抗病等位基因P1-ta和P1-b的多重PCR體系(簡稱體系I)時選用的品種:南粳44 (早熟晚粳品種，江蘇省農業科學院糧食作物研究所)，南粳45 (遲熟中粳品種，江蘇省農業科學院糧食作物研究所)，武運粳7號(早熟晚粳品種，江蘇常州武進稻麥育種場)，武運粳8號(遲熟中粳品種，江蘇常州武進稻麥育種場)，武運粳21 (中熟中粳品種，江蘇常州武進稻麥育種場)，武粳15 (遲熟中粳品種，江蘇省常州市武進稻麥育種場)，武香粳14 (早熟晚粳品種，江蘇常州武進稻麥育種場)，常農粳5號(早熟晚粳稻品種，江蘇常熟農業科學研究所)，鹽稻9號(遲熟中粳品種，江蘇沿海地區農業科學研究院)、揚粳805 (遲熟中粳品種，江蘇里下河地區農業科學研究院)。
[0067] 驗證感病等位基因p1-ta與p1-b的多重PCR體系(簡稱體系II)時選用的品種:徐稻3號(中熟中粳稻品種，江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所)，徐稻4號(中熟中粳稻品種，江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所)，徐稻6號(遲熟中粳稻品種，江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所)，鎮稻88 (中熟中粳品種，江蘇鎮江丘陵地區農業科學研究所)，淮稻5號(遲熟中粳稻品種，江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所)，淮稻9號(遲熟中粳稻品種，江蘇省徐淮地區淮陰農業科學研究所)，連粳4號(中熟中粳稻品種，江蘇連云港市農業科學院)、連粳5號(中熟中粳稻品種，江蘇連云港市農業科學院)、連粳6號(中熟中粳稻品種，江蘇連云港市農業科學院)、連粳7號(中熟中粳稻品種，江蘇連云港市農業科學院)。
[0068]對照材料?嘉33(中熟晚粳品種，浙江嘉興市農業科學研究院)和麗江新團黑谷(云南粳型地方品種)。
[0069]以上材料均為公知公用材料，江蘇省農業種質資源中期庫可免費提供。具體參考文獻為:王才林等，中國稻米，2007，13(2):33-34;仲維功等，江蘇農業科學，2011，3:82-83;吳昊等，南京農業大學學報，2007，30 (4):6_10;王曉東等，江蘇農業科學，2000，1:16-18;戚莉紅等，安徽農學通報，2008，10:123-128;屠美英等，江蘇農業科學，2006，6:32-35;邵建國等，上海農業科學，2006，6:40-41;蘇月紅等，江蘇農業科學，2008，5:80-10 ;王愛民等，2005，12:103-104;劉強等，現代農業科技，2010，4:50-51;吳玉玲等，北方水稻，2008，3:153;曾慶連，現代農業科技，2008，2:142;胡春明等，江西農業學報，2008，20(11):47-49;胥益鋒等，安徽農學通報，2012，4:25-29;姚麗鳴等，中國農技推廣，2008，2:19-20;李健等，江蘇農業科學，2013，6:64-65;殷春淵等，作物學報，2010，36 (8):1342-1354;季仁達等，中國稻米，2010，16 (6): 63-64;秦德榮等，安徽農學通報，2012，9:65-66;朱根華等，上海農業科技，2008，2:34;凌忠專等，中國農業科學，2001，34(1): 116-119。
[0070](3)多重PCR體系的驗證
[0071]I)水稻品種基因組DNA的提取
[0072]水稻品種基因組DNA 的提取(SDS 法)，參照 DellaportaSL, etal., PlantMolBiolReP, 1983，1 (1): 19221。具體步驟為:取水稻苗期葉片，在_20°C預冷的研缽中用液氮研磨并裝Al.5mL 離心管；加入 600uL 提取液(20%SDS，lMTris-HCl，0.5MEDTA，5MNaCl，65°C 預熱)，搖勻，65°C溫浴30min，中間振蕩3~4次；加入1/4體積5MKAC，搖勻后置冰上30min ;加入氯仿-異戊醇(24:1) 300~400uL，在搖床上充分振蕩，120rpm，30min ；8000~1000Orpm離心15分鐘，液面分層，下層顏色較深，上層微帶黃綠色，取上清(400uL左右)至另一離心管；加入等體積氯仿-異戍醇(24:1),搖床上充分振蕩,80~90rpm, 30min ；8000rpm離心15分鐘，轉移上清(400uL左右)至新的離心管；加入2倍體積_20°C預冷的無水乙醇，輕輕搖勻直到有絮狀物產生，12000rpm離心6min ;棄無水乙醇，加入4°C 70%乙醇，放置lOmin，棄上清，超凈工作臺上風干Ih ;加入100~200uLTE，-20°C保存。
[0073]2)多重PCR擴增和檢測
[0074]PCR反應體系I中，
[0075]抗病等位基因P1-ta特異性引物:
[0076]正向P1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0077]反向P1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0078]抗病等位基因P1-b特異性引物:
[0079]正向P1-b-F 序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
[0080]反向P1-b-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’
[0081]PCR反應體系II中，
[0082]感病等位基因p1-ta特異性引物:
[0083]正向p1-ta-F 序列:5，-AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3，
[0084]反向p1-ta-R 序列:5，-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0085]感病等位基因p1-b特異性引物:
[0086]正向p1-b-F 序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’
[0087]反向p1-b-R 序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’
[0088]將稻痕病抗病等位基因P1-ta與Pi_b兩對分子標記引物加入PCR反應體系I中，同時將感病等位基因p1-ta與p1-b兩對分子標記引物加入PCR反應體系II中，對水稻種質資源或育種群體植株的DNA進行擴增。PCR反應體系I和II中20 μ LPCR反應體系包括:IOng/μ L 的 DNA2.Ομ L，4pmol/y L 的引物 2.0 μ L:其中體系 I 中引物 P1-ta-F、P1-ta-R,P1-b-F 和 P1-b-R 各 0.5μ L，體系 II 中引物 p1-ta-F、p1-ta-R、p1-b-F 和 pi_b_R各 0.5 μ L，含 25臟01/11%(:12的 10XPCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L，5U/μ L 的 Taq0.5 μ L和ddH2013.1 μ L ；PCR體系I和II中的反應程序包括:95°C預變性3min ;然后94°C變性lmin，55°C 復性 lmin，72°C延伸 lmin，6 個循環;再進行 94°C變性 lmin，55°C復性 50s, 72°C延伸30s，32個循環，最后72°C延伸6min，10°C冷卻IOmin后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應；反應產物在質量比濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化乙錠染色并于凝膠成像。
[0089]3)抗病等位基因P1-ta和P1-b多重PCR體系(體系I)的驗證
[0090]以P1-ta和P1-b抗病等位基因已知的10個水稻品種南粳44、南粳45、武運粳7號、武運粳8號、武運粳21、武粳15、武香粳14、常農粳5號、鹽稻9號和揚粳805的DNA為模板，利用P1-ta與P1-b抗病等位基因標記對其相應的基因位點進行PCR擴增和電泳。多重PCR體系I檢測品種中，南粳44、南粳45等10份材料同時擴增出與含P1-ta和Pi_b抗病等位基因對照品種嘉33相同的兩條特征條帶1042bp和365bp ;而含pi_ta和pi_b感病等位基因對照品種麗江新團黑谷則無相應的目的條帶(圖1)，這表明這些品種都含有抗病等位基因P1-ta和P1-b。
[0091]4)感病等位基因p1-ta與p1-b多重PCR體系(體系II)的驗證[0092]以P1-ta和P1-b感病等位基因已知的10個水稻品種徐稻3號、徐稻4號、徐稻6號、鎮稻88、淮稻5號、淮稻9號、連粳4號、連粳5號、連粳6號和連粳7號的DNA為模板，利用p1-ta與p1-b感病等位基因標記對其相應的基因位點進行PCR擴增和電泳。多重PCR體系II檢測的品種中，徐稻3號、徐稻4號等10份材料，同時擴增出與含p1-ta和p1-b感病等位基因對照品種麗江新團黑谷相同的兩條特異條帶1042bp和803bp ;而含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因對照品種嘉33則未擴增出相應的目的條帶(圖2)，這表明這些品種都含有感病等位基因p1-ta與p1-b。
[0093](4)多重PCR體系在育種中的應用
[0094]利用已建立的多重PCR體系，對自主選育的336份高世代穩定育種品系進行抗病等位基因P1-ta和P1-b以及感病等位基因p1-ta與p1-b的檢測。結果顯示,336份供試材料中，有112個品系在體系I中能同時擴增出與對照嘉33相同的1042bp和365bp兩條抗病等位基因特征條帶，占供試材料的33.33%，說明這些品系均含有抗病等位基因P1-ta和P1-b ；10份材料在體系II中檢測到與對照麗江新團黑谷相同的1042bp和803bp兩條感病等位基因特征條帶，占總數的2.98%，說明這些品系含有感病等位基因p1-ta和p1-b ;有7個品系在體系I和體系II分別擴增出1042bp和803bp的特征條帶，占總數的2.08%,說明這些品系含有抗病等位基因P1-ta和感病等位基因p1-b ；207個品系在體系I和體系II分別擴增出365bp和1042bp的特征條帶，占總數的61.61%，說明這些品系含有感病等位基因p1-ta和抗病等位基因P1-b (圖3、圖4)。從以上分析可以看出，高世代育種品系中聚合2個抗稻瘟病基因的品系比例較少，抗性基因P1-b的分布頻率明顯高于抗性基因P1-ta的分布頻率，這也同時說明通過傳統育種的方法進行抗稻瘟病基因聚合的效率較低(表1)。
[0095]表1.稻瘟病基因P1-ta和P1-b不同基因型在336份粳稻新品系中的分布
[0096]
【權利要求】
1.一種鑒定稻瘟病抗性基因/和的多重PCR方法，其特征在于: 利用PCR反應體系I中， 抗病等位基因朽-h特異性引物:
正向 P1-1a-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
反向 P1-1a-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’ 抗病等位基因特異性引物: 正向序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
反向 /7Z-A-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’ 和PCR反應體系II中， 感病等位基因特異性引物: 正向序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3’ 反向序列:5’ -CTA CCAACAAGTTCATCAAA-3’ 感病等位基因特異性引物: 正向序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’ 反向序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’ 同時擴增水稻品種的基因組DNA，如果體系I所用兩對引物能同時擴增出1，042 bp和365 bp兩條特征條帶，即為含/和/7Z-A基因的純合體；如果體系II所用兩對引物能同時擴增出1，042 bp和803 bp兩條特征條帶，即為含與p1-b基因的純合體；如果體系I和體系II分別擴增出1，042 bp和803 bp的特征條帶，則為含與/7^基因的純合個體；如果體系I和體系II分別擴增出365 bp和1，042 bp，則為含p1-1a與Pi_b基因的純合個體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: (1)水稻植株基因組DNA的提取； (2)將權利要求1所述的稻瘟病抗病等位基因特異性引物與特異性引物加入PCR反應體系I中，同時將權利要求1所述的感病等位基因特異性引物與特異性引物加入PCR反應體系II中，并對水稻種質資源或育種群體植株的DNA進行擴增； (3)PCR反應體系I和II中20 μ L PCR反應體系包括:10 ng/μ L的DNA 2.0 μ L，含 25 mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer 2.0 μ L,2.5 mmol/L 的 dNTP 0.4 μ L,5 U/μ L的Τεφ.5 μ L，ddH20 13.1 μ L和4 pmol/ μ L的引物2.0 μ L:其中體系I中為引物/"1-1a-FJ1-1aUi1-F和各 0.5 μ L,體系 II 中為引物pi-ta-F、pi-b-F和 p1-b-從各 0.5 μ L ； (4)PCR反應體系I和II中的程序包括:95°C預變性3min ;然后94°C變性I min, 55°C復性I min，72°C延伸I min，6個循環；再進行94°C變性I min，55°C復性50 s，72°C延伸.30 8，32個循環，最后721:延伸6 min，10°C冷卻10 min后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應; (5)反應產物在質量比濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化乙錠染色并于凝膠成像。
【文檔編號】C12Q1/68GK103937890SQ201410152098
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】姚姝, 陳濤, 王才林, 劉燕清, 張亞東, 朱鎮, 趙慶勇, 周麗慧, 趙凌, 于新, 趙春芳 申請人:江蘇省農業科學院