一種使用磁珠從血清或血漿樣品中分離游離核酸的方法
【專利摘要】本發明涉及一種使用磁珠從血清或血漿樣品中分離游離核酸的方法，屬于核酸純化領域。首先向在無核酸酶離心管中加入血清/血漿樣本、裂解緩沖液、蛋白酶K和磁珠懸浮液，充分混勻后進行裂解，并使核酸吸附到磁珠表面，在外加磁場的作用下進行純化，經過漂洗步驟去除蛋白、多糖和鹽等雜質，最后加入無核酸酶的水洗脫，得到游離核酸溶液。本發明方法具有簡單快速、穩定高效和價格便宜的特點，所純化游離核酸完整、純度高，可直接用于后續實驗。
【專利說明】—種使用磁珠從血清或血漿樣品中分離游離核酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種使用磁珠從血清或血漿樣品中分離游離核酸的方法，屬于核酸純化領域。
【背景技術】
[0002]早在1948年，Mandel等就發現了外周血中有游離核酸，但在當時因核酸是否是遺傳物質還沒有被定論而沒有引起人們的關注。隨著研究的深入，科學家們意識到，游離核酸不僅可以應用于胎兒性別、RHD血型、Y染色體連鎖的遺傳疾病的診斷與預防，還可以應用于檢測腫瘤、癌癥的發生以及骨髓移植后嵌合狀態的研究。1989年，Stroun等研究表明，游離核酸中部分基因具有腫瘤組織基因的類似特征；幾年后，Vasioukhin等于血漿游離核酸中發現了突變的N-ras，進一步為兩者相關性提供了依據。至此，游離核酸開始被用作一種預測腫瘤發生的新型生物標記。近幾年，除腫瘤外的其他疾病也出現了游離核酸的報道，如急性(心腦血管疾病)或惡性疾病(系統性免疫疾病)、需機械通氣危重癥、中風、脊髓小腦性共濟失調、心肌梗塞、急性登革熱病等。游離核酸對產前診斷同樣具有重要意義。Lo等認為，在免疫學上胚胎對于母體類似于腫瘤對于機體，可能在母體血漿中存在游離的胎兒DNA。1997年，他們通過實時PCR從一孕男胎婦女血液游離DNA擴增出胎兒Y染色體特異序列，首次證明孕婦外周血中存在胎兒游離DNA，為非創傷產前診斷開辟了一條新途徑。隨后在1998年，他們發現胎兒游離核酸在妊娠早期便存在于孕婦血液中，且胎兒游離核酸濃度隨孕周的延長而增加。同年，他們建立方法，檢測孕中期RhD陰性孕婦外周血中是否存在RhD基因，從而揭開了利用母體血漿中游離胎兒DNA進行產前診斷研究的序幕。此外，游離核酸還可用于三體綜合征、地中海貧血癥、連鎖遺傳性疾病和早產的產前診斷。
[0003]目前提取核酸的的方法主要有苯酚-氯仿抽提法，硅膜離心柱吸附法和磁珠吸附法。苯酚-氯仿抽提法發展的較早，使用比較廣泛，主要原理是基于DNA在不同溶劑中溶解行為不同來達到分離純化DNA目的，其優點在于提取DNA產率較高，成本低廉，主要缺點是費時費力，提取DNA純度不高，大量使用有毒溶劑，難以實現自動操作。目前市面商品化核酸提取試劑盒大多采用硅膜離心吸附柱方法，該方法簡單快速，能有效的去除樣本中的各種PCR抑制物，獲得較純的DNA，但是對于游離核酸提取效率低，且成本較高，同時需要高速離心，不適合臨床常規使用和高通量操作。磁珠法提取核酸是近幾年才發展起來的核酸提取方法。其主要原理是在磁珠(主要為鐵氧體)表面通過共聚合和表面修飾等引入活性基團，這些活性基團有-C00H，-NH2, -OH, -C0H, -SH, -S03等，利用磁珠表面的這些活性基團，以共價鍵的形 式偶聯在磁珠的表面，制備成具有磁性的親和吸附劑，然后與生物樣品共同孵育后，目標分子能夠迅速被磁珠捕獲，可以在磁場作用下從液相中沉降下來，經過簡單的洗滌，分離得到表面結合有目標分子的磁珠復合物，通過改變洗滌條件可以將目標分子從磁珠上洗脫下來。其操作簡便、快速，獲得的核酸純度高，產量達，對血漿游離核酸提取效率最高，相對丟失率最小，重復性好，尤其適合游離核酸的提取。此外，目前已有很多公司生產出配套磁珠法提取核酸的自動化系統，極大地提高了樣品處理的通量，易于高通量的篩選，同時也提高了提取操作的可重復性。而已商品化的磁珠法游離核酸提取試劑盒操作復雜，需要先在56°C條件下用蛋白酶K和裂解緩沖液消化樣本，然后冷卻至室溫后加入無水乙醇混勻，室溫放置5分鐘后加入磁珠懸浮液進行混勻，經過一系列漂洗步驟后置于室溫晾干10-15分鐘。步驟的繁瑣性導致其自動化操作程度低，儀器普適性差，同時也無法保證核酸提取的重復性。此外很多磁珠法游離核酸提取試劑盒對于血清或血漿樣品游離核酸提取效率低，這就導致了其在提取過程中需要更多的起始樣本量或者額外添加Carrier RNA或糖原才能滿足后續檢測的要求，不僅增加了成本，而且增加了臨床應用的難度。因此迫切需要開發簡單快速、穩定高效和價格便宜的納米磁珠法游離核酸提取試劑盒。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提出一種使用磁珠從血清或血漿樣品中分離游離核酸的方法，同時將血清或血漿樣本、裂解緩沖液、蛋白酶K和磁珠懸浮液混合后進行室溫孵育，以簡化核酸的提取步驟，并避免普通磁珠法核酸提取中需要高溫孵育帶來的不便。
[0005]本發明提出的使用磁珠從血清或血漿樣品中分離游離核酸的方法，包括以下各步驟:
[0006](I)在盛有1.5毫升無核酸酶的離心管中加入200微升血清/血漿樣本和300微升裂解緩沖液，得到混合液；
[0007](2)向離心管的混合液中加入20微升蛋白酶K和15微升充分搖勻的磁珠懸浮液，充分混勻，室溫下用移液器吹吸或上下顛倒混勻10分鐘；
[0008](3)將上述離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，使磁珠完全吸附于離心管壁，吸棄上清；
[0009](4)將步驟(3)的離心管從磁力架上取下，加入500-600微升第一漂洗緩沖液，用移液器吹吸或渦旋振蕩混勻，再將離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，吸棄上清；
[0010](5)將步驟(4)的離心管從磁力架上取下，加入500-600微升第二漂洗緩沖液，用移液器吹吸或渦旋振蕩混勻，再將離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，吸棄上清；
[0011](6)將步驟(5)的離心管置于磁力架上，并保證磁珠完全吸附于離心管壁，緩慢加入500-600微升第三漂洗緩沖液，磁吸附I分鐘，吸棄上清；
[0012](7)將步驟(6)中的離心管從磁力架上取下，加入50-100微升洗脫緩沖液，用移液器吹吸混勻，56°C孵育5分鐘，晃動離心管，使核酸充分洗脫；
[0013](8)將步驟(7)的離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，使磁珠吸附于離心管壁，將洗脫液轉移至干凈的離心管中，洗脫液即為分離的游離核酸。
[0014]上述方法中，所述的裂解緩沖液的各組分含量為:
[0015]
【權利要求】
1.一種使用磁珠從血清或血漿樣品中分離游離核酸的方法，其特征在于該方法包括以下各步驟: (1)在盛有1.5毫升無核酸酶的尚心管中加入200微升血清/血衆樣本和300微升裂解緩沖液，得到混合液； (2)向離心管的混合液中加入20微升蛋白酶K和15微升充分搖勻的磁珠懸浮液，充分混勻，室溫下用移液器吹吸或上下顛倒混勻10分鐘； (3)將上述離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，使磁珠完全吸附于離心管壁，吸棄上清； (4)將步驟(3)的離心管從磁力架上取下，加入500-600微升第一漂洗緩沖液，用移液器吹吸或渦旋振蕩混勻，再將離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，吸棄上清； (5)將步驟(4)的離心管從磁力架上取下，加入500-600微升第二漂洗緩沖液，用移液器吹吸或渦旋振蕩混勻，再將離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，吸棄上清； (6)將步驟(5)的離心管置于磁力架上，緩慢加入500-600微升第三漂洗緩沖液，磁吸附I分鐘，吸棄上清； (7)將步驟(6)中的離心管從磁力架上取下，加入50-100微升洗脫緩沖液，用移液器吹吸混勻，56°C孵育5分鐘，晃動離心管，使核酸充分洗脫； (8)將步驟(7)的離心管置于磁力架上，磁吸附I分鐘，使磁珠吸附于離心管壁，將洗脫液轉移至干凈的離心管中，洗脫液即為分離的游離核酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的裂解緩沖液的各組分含量為:
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的磁珠懸浮液中的磁珠為:內核層由磁性四氧化三鐵顆粒構成，內核層外包被了四乙氧基硅烷。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第一漂洗緩沖液的各組分含量為:鹽酸胍346.5克 IM三羥甲基氨基甲烷，pH值為8.06毫升無水乙醇400毫升 將上述各組分稱重或量取后混合，加去離子水，使混合液體積為1000毫升。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第二漂洗緩沖液的各組分含量為:IM三羥甲基氨基甲烷，pH值為7.52毫升無水乙醇800毫升 將上述各組分稱重后混合，加去離子水，使混合液體積為1000毫升。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第三漂洗緩沖液的組成為:3M乙酸鈉，pH值為6.0, 3.3毫升，加去尚子水，使體積為1000毫升。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的洗脫緩沖液的組成為:1M三羥甲基氨基甲燒，pH值為7.5,10毫升，加去尚子水，使體積為1000毫升。
【文檔編號】C12N15/10GK103952397SQ201410151876
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月16日 優先權日:2014年4月16日
【發明者】韓典霖, 俞萍, 李曉晨, 孫克非 申請人:天根生化科技（北京）有限公司