一株瓜頂孢霉及其產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物資源利用領(lǐng)域，涉及一株瓜頂孢霉及其產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的應(yīng)用。所述瓜頂孢霉（Acremonium?cucurbitacearum）菌株編號(hào)為AJ014，保藏號(hào)為CGMCC?No.8729。該菌株可通過(guò)液體發(fā)酵生產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)，本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了發(fā)酵配方和發(fā)酵條件。本專利的瓜頂孢霉菌株及其產(chǎn)蒽醌類的發(fā)酵配方和發(fā)酵條件可提供于擴(kuò)大化的工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一株瓜頂孢霉及其產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物資源利用領(lǐng)域，涉及到微生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中蒽醌類天然活性產(chǎn)物生產(chǎn)微生物菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵，具體就是一株瓜頂孢霉及其所產(chǎn)蒽醌類化合物的液體發(fā)酵
培養(yǎng)基配方。
【背景技術(shù)】
[0002]醌類化合物是存在于自然界中一類分子內(nèi)具有不飽和環(huán)二酮結(jié)構(gòu)(醌式結(jié)構(gòu))或容易轉(zhuǎn)變成這類結(jié)構(gòu)的化合物的總稱。按照芳環(huán)的數(shù)目、駢合情況分為四類:苯醌、菲醌、萘醌和蒽醌。蒽醌是醌類化合物中最重要的一類物質(zhì)，具有止瀉、抗菌、利尿、止血、抗癌和抗病毒等多方面的生理活性。目前已發(fā)現(xiàn)的蒽醌化合物近200種，主要分布于高等植物中，其他則主要存在于真菌及地衣中，在動(dòng)物及細(xì)菌中也偶有發(fā)現(xiàn)，在真菌、地衣和動(dòng)物中存在的蒽醌類化合物的結(jié)構(gòu)還常常比較特殊。竹黃中的羥基蒽醌是一種天然色素，由沈云修等(2002)首次分離獲得。之后，國(guó)外仍無(wú)對(duì)竹黃蒽醌的研究，國(guó)內(nèi)的研究也較少，主要是對(duì)其分離純化及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。樓志華等(2006)利用化學(xué)試劑顯色反應(yīng)、紫外光譜和液質(zhì)聯(lián)用等手段初步確定一株竹黃菌(Shiraia bambusicola P.Hennigs) LBR 一 SB6發(fā)酵天然色素為蒽醌類化合物，發(fā)酵配方為2%木糖、0.2%NaN03、0.1%K2HP04、0.05%MgS04.7H20、0.05%KC1、0.001%FeS04.7Η20。張梁等(2006)確定竹黃中的蒽醌化合物為1，5 一二羥基一3 —甲氧基一 7 —甲基蒽醌。同年，江南大學(xué)對(duì)竹黃菌發(fā)酵制備天然蒽醌類色素的方法申請(qǐng)了專利，專利中使用的菌株為竹黃菌Shiraia bambusicola P.Hennigs LBR — SB6,所使用的搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖15~35g/L，馬鈴薯100~250g/L ;搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度24~30°C，轉(zhuǎn)速120~160r/min，培養(yǎng)時(shí)間120~140h ;裝液量為:搖瓶培養(yǎng)基和三角瓶容積之比為3:10，所得產(chǎn)物是天然蒽醌類色素中的1，5 一二羥基一 3 —甲氧基一 7 —甲基蒽醌，為棕紅色固體粉末。Cai等(2008)首次從竹黃的深層發(fā)酵液中分離到了一種抗癌抗菌素，經(jīng)分析證明是蒽醌物質(zhì)。
[0003]目前已經(jīng)公開(kāi)的產(chǎn)蒽醌物質(zhì)的微生物菌株有:(I)竹黃菌(Shiraia bambusicolaP.Hennigs)LBR — SB6(專利CN100509963C)，其搖瓶發(fā)酵使用的培養(yǎng)基組成為:葡萄糖15~35g/L，馬鈴薯100~250g/L ;搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度24~30°C，轉(zhuǎn)速120~160r/min，培養(yǎng)時(shí)間120~140h ;裝液量為:搖瓶培養(yǎng)基和三角瓶容積之比為3:10。所得產(chǎn)物是天然蒽醌類色素中的1，5 —二羥基一 3 —甲氧基一 7 —甲基蒽醌，為棕紅色固體粉末。(2)野生葉點(diǎn)霉菌(專利CN102994581A)，其發(fā)酵使用的培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基。(3)青霉菌SHKl - 27(任虹，顧謙群，崔承彬，海洋來(lái)源?，F(xiàn)青霉菌SHKl — 27生產(chǎn)的蒽醌衍生物及其抗腫瘤活性[J]，中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2007)，發(fā)酵配方為:2%的甘露醇、1%的葡萄糖、2%的麥芽糖、1%的谷氨酸鈉、0.1%的玉米糖漿、0.05%的磷酸二氫鉀、0.003%的七水硫酸鎂、0.3%的酵母膏，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)周期為9d。(4)紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌(陳乙銓,林軍,舒永志等,紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌來(lái)源的蒽醌類代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J]，世界臨床藥物，2013)。(5)尖孢鐮刀菌(崔堂兵，劉清香，尖孢鐮刀菌生產(chǎn)蒽醌色素的液體發(fā)酵條件研究[J]，中國(guó)生物工程雜志，2010):斜面培養(yǎng)及平板培養(yǎng)均采用PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20，pH自然。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20。培養(yǎng)條件為:30°C、200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)6d。
[0004]目前已經(jīng)公開(kāi)的產(chǎn)蒽醌物質(zhì)的植物有:掌葉大黃(楊世海，劉曉峰，果德安等，不同培養(yǎng)基對(duì)掌葉大黃毛狀根克隆系質(zhì)量的影響[J]，中草藥，2006)，使用的培養(yǎng)基配方為:無(wú)機(jī)鹽均為1/2的無(wú)激素WP、N6、MS、B54種培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為lOOr/min，培養(yǎng)周期為40d。紅大戟(趙峰，王素娟，吳秀麗等，紅大戟中的蒽醌類化學(xué)成分[J]，中國(guó)中藥雜志，2011)。蒼耳子(王虹，何桂霞，姚穎，蒼耳子中總蒽醌的含量測(cè)定[J]，中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009)。
[0005]竹黃是分布于我國(guó)和日本的一屬單種真菌，在其分布的我國(guó)長(zhǎng)江以南等諸省是一種民間藥物，主要用于治療虛寒胃痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氣管炎、百日咳、坐骨神經(jīng)痛、跌打損傷、貧血頭痛等病癥?，F(xiàn)代藥物化學(xué)分析表明，竹黃能夠產(chǎn)生多糖、竹紅菌素(茈醌)和蒽醌等代謝物，具有藥用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是從竹黃子實(shí)體的伴生真菌中獲得產(chǎn)蒽醌的微生物菌株，并得到其產(chǎn)蒽醌物質(zhì)最優(yōu)的發(fā)酵配方和發(fā)酵條件。
[0007]本發(fā)明采用的菌株為從竹黃子實(shí)體中分離的一株伴生真菌——瓜頂孢霉(Acremonium cucurbitacearum),菌株編號(hào)為AJ014,于2014年01月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)保藏，分類命名為瓜頂孢霉(Acremonium cucurbitacearum),保藏編號(hào)為CGMCC N0.8729。
[0008]本發(fā)明還公開(kāi)了瓜頂孢霉(Acremonium cucurbitacearum)AJ014在產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了利用本發(fā)明菌株產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的方法，是通過(guò)瓜頂孢霉AJ014液體發(fā)酵生產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)，其中產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的培養(yǎng)基配方為:2%~6%的碳源、0.1%~0.5%氮源、0.1%~0.4%磷酸二氫鉀、0.01%~0.09%硫酸鎂、0.01%~0.05%七水硫酸亞鐵、10 μ g/1OOmL~13 μ g/1OOmL的VBl、pH5.0~7.0,碳源為葡萄糖和D —果糖,氮源為蛋白胨和尿素；其產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的發(fā)酵條件為25°C~30°C,搖床轉(zhuǎn)速為120r/min~210r/min,培養(yǎng)周期為5~10d。最優(yōu)配方為:4%的葡萄糖、0.4%的尿素、0.2%的磷酸二氫鉀、0.05%的硫酸鎂、0.03%的七水硫酸亞鐵、13 μ g/1OOmL的VB1、初始pH為6.5，培養(yǎng)溫度27°C，搖床轉(zhuǎn)速210rpm，培養(yǎng)周期7d。在最優(yōu)發(fā)酵配方和條件下蒽醌類物質(zhì)的產(chǎn)量為4.73g/L。
[0010]本發(fā)明通過(guò)對(duì)竹黃子實(shí)體進(jìn)行了菌種分離和鑒定，又進(jìn)行了菌種篩選和天然產(chǎn)物的檢測(cè)，從中獲得一株非竹黃菌而是其伴生菌的真菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)生蒽醌類化合物的能力。本專利對(duì)這株經(jīng)形態(tài)和分子鑒定為瓜頂孢霉(Acremonium cucurbitacearum)的產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化研究，獲得了瓜頂孢霉(Acremoniumcucurbitacearum)AJ014生產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)的發(fā)酵工藝流程。本專利的瓜頂孢霉菌株及其產(chǎn)蒽醌類的發(fā)酵配方和發(fā)酵條件可提供于擴(kuò)大化的工業(yè)生產(chǎn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1產(chǎn)蒽醌物質(zhì)菌株的分離
[0012](I)組織分離法
[0013]采用組織分離法對(duì)菌種進(jìn)行分離，即選取較新鮮的竹黃子座，先用75%乙醇對(duì)其進(jìn)行表面消毒，再用已滅菌的刀片將子實(shí)體切割成約0.4mm X 0.4mm X 0.4mm~0.6mmX0.6mmX0.6mm的小塊，于75%的酒精中消毒2min，然后轉(zhuǎn)入1%的升汞溶液消毒2min,再以無(wú)菌水沖洗4~5次,置于已倒有菌種分離培養(yǎng)基的平皿上,每個(gè)平皿中放入3~4個(gè)組織塊，在27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。
[0014]觀察的結(jié)果為:培養(yǎng)Id后，在培養(yǎng)基表面以及組織塊表面觀察不到菌絲；培養(yǎng)2d后，培養(yǎng)基上以及大部分組織塊的表面已可見(jiàn)白色菌絲；培養(yǎng)3d后，菌種已適合轉(zhuǎn)移純化；培養(yǎng)時(shí)間如進(jìn)一步延長(zhǎng)，培養(yǎng)5d后菌落逐漸擴(kuò)大，多成棉絮狀。該方法分離的部分菌株，其生長(zhǎng)較為迅速，影響到其他生長(zhǎng)緩慢的菌株的生長(zhǎng)，因此獲得的菌株數(shù)量較少。共分離菌株
11株，命名為 AJ001 — AJOlI。
[0015](2)孢子分離法
[0016]慢慢刮去子座表面紅色的擬薄壁組織，直至黃色基質(zhì)出現(xiàn)，再用刀片小心刮取黃色基質(zhì)，轉(zhuǎn)移到裝有無(wú)菌水的試管中震蕩均勻，然后依次制成IO-1UO-2UO-3UO-4UO-
5、10 —6、10 —7七個(gè) 濃度梯度的孢子懸液，用移液槍分別吸取0.2mL懸液加入已倒有各類菌種分離培養(yǎng)基的平皿上，用涂布棒涂布均勻后，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果如下:培養(yǎng)2d后，在培養(yǎng)基表面觀察不到菌絲；培養(yǎng)3~4d后，在少量的組織粉末邊緣會(huì)出現(xiàn)小的白色菌落；培養(yǎng)5d左右，菌落直徑變大，已適合轉(zhuǎn)移純化；若培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),菌落逐漸擴(kuò)大，多為棉絮狀。該方法可能由于組織粉末經(jīng)涂布較為分散，獲得菌株較多，菌株分離率在兩種分離方法中是最高的，平均一塊培養(yǎng)基上可以分離得到4~5株菌株。共分離菌株117株，命名為AJ012 - AJ128。其中三株菌產(chǎn)生色素，產(chǎn)色素的菌株編號(hào)是AJ014、AJ085和AJ121。
[0017]實(shí)施例2AJ014菌株的獲得
[0018](I)直觀篩選
[0019]天然存在的醌類化合物因母核上多有酚羥基等助色基團(tuán)的引入，顏色呈黃、橙、棕紅色以至紫紅色等。在菌株篩選的初期，最直觀的判斷方法是觀察菌株是否在培養(yǎng)基中產(chǎn)生色素。對(duì)于實(shí)施例1中已分離的菌株，針對(duì)性地篩選具有產(chǎn)生色素能力的菌株，接入新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿，27°C培養(yǎng)，產(chǎn)色素的菌株反復(fù)純化，去除雜菌，然后接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，27°C培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿斜面后，4°C保藏。其中一個(gè)菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上生長(zhǎng)旺盛，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲顏色逐漸由白變黃，呈淺黃色至橙黃色，在菌落中間的一些菌絲表面出現(xiàn)一些紫紅色小液滴狀物質(zhì)，該菌株的代號(hào)是AJ014。
[0020](2)發(fā)酵成分篩選
[0021]對(duì)獲得的具有產(chǎn)生色素能力的AJ014、AJ085和AJ121菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，針對(duì)其各自發(fā)酵成分進(jìn)行進(jìn)一步篩選，通過(guò)顯色反應(yīng)以檢測(cè)發(fā)酵液中是否含有醌類化合物。
[0022]發(fā)酵液中產(chǎn)蒽醌物質(zhì)的測(cè)定方法是:配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)液，250mL三角瓶中裝液100mL。用接種針挑取少許活化后的菌絲接種。于27°C、150r/min下培養(yǎng)6~7天后，過(guò)濾菌絲，收集發(fā)酵液。將所得發(fā)酵液減壓濃縮至20mL，加入等體積的氯仿，多次萃取后，將有機(jī)相合并后，60°C水浴蒸干氯仿，得到少量發(fā)酵液粗品。依據(jù)文獻(xiàn)(李嘉容主編.天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2000)辨識(shí)蒽醌類化合物的顯色反應(yīng)。
[0023]①堿性顯色反應(yīng)
[0024]羥基醌類在堿性溶液中發(fā)生顏色改變，多呈橙、紅、紫紅以及藍(lán)色。
[0025]具體步驟:取2mL發(fā)酵液粗品的氯仿溶液，加入等量的l%NaOH溶液，搖勻，觀察有機(jī)相與水相的顏色變化；加入少量30%過(guò)氧化氫溶液，在沸水浴中加熱5min，觀察水相顏色變化；加入稀鹽酸溶液，觀察顏色變化；加入10%Na0H，再觀察顏色變化。
[0026]②醋酸鎂顯色反應(yīng)
[0027]取ImL發(fā)酵液粗品的乙醇溶液，加入少量0.5%醋酸鎂的甲醇溶液，搖勻，觀察顏色變化。顯色結(jié)果如下表1:
[0028]表1瓜頂孢霉AJO14菌株發(fā)酵產(chǎn)物顯色結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一株瓜頂孢霉(Acremonium cucurbitacearum),該菌株編號(hào)為AJ014,分離自竹黃子實(shí)體，菌株專利保藏號(hào)為CGMCC N0.8729。
2.權(quán)利要求1所述的瓜頂孢霉AJ014在產(chǎn)蒽醌類化合物中的應(yīng)用。
3.一種利用權(quán)利要求1所述的瓜頂孢霉AJ014生產(chǎn)蒽醌類化合物的生產(chǎn)方法，其特征在于，通過(guò)瓜頂孢霉AJ014液體發(fā)酵生產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)，其中產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)培養(yǎng)基配方為:2%~6%的碳源、0.1%~0.5%氮源、0.1%~0.4%磷酸二氫鉀、0.01%~0.09%硫酸鎂、0.01% ~0.05% 七水硫酸亞鐵、10μ g/100mL ~13μ g/100mL 的 VBl、pH5.0 ~7.0，碳源為葡萄糖和D—果糖,氮源為蛋白胨和尿素；發(fā)酵條件為25~30°C,搖床轉(zhuǎn)速為120r/min~210r/min，培養(yǎng)周期為5~10d。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述瓜頂孢霉AJ014產(chǎn)蒽醌類物質(zhì)培養(yǎng)基配方為:4%的葡萄糖、0.4%的尿素、0.2%的磷酸二氫鉀、0.05%的硫酸鎂、0.03%的七水硫酸亞鐵、13 μ g/1OOmL的VBl、pH為6.5，培養(yǎng)溫度27°C，搖床轉(zhuǎn)速210rpm，培養(yǎng)周期7d。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103897989SQ201410144833
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】陳雙林, 黃珍, 閆淑珍 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)