一種亞硝化細菌的培養液及制備和培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種典型氨氧化菌（Nitrosomonaseuropaea）的培養液和培養方法，包括培養液配方、細菌活化和培養。本發明是為了解決目前該細菌培養難度大、要求高、培養過程中細菌易污染、增長緩慢等突出問題。本發明中培養液包含細菌增長所需的營養物質、生物緩沖劑和pH指示劑，能夠促進細菌的生長，提高增殖能力和生存能力，并且能夠通過指示劑的顏色變化判斷與調整細菌的生長狀態和活性；在培養過程中，細菌經過活化，進一步提高了細菌的活性和生長速率，極大的縮短了培養周期，并且實現了pH的實時監測和調節，再次提高了細菌的生存能力，提高了培養效率。
【專利說明】一種亞硝化細菌的培養液及制備和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境工程微生物領域，特別涉及一種典型氨氧化細菌(N.europaea)的培養液及培養方法。
【背景技術】
[0002]目前生活污水的脫氮除磷過程主要通過微生物的吸收轉化得以去除，污水中的氨氮先在氨氧化細菌和亞硝化細菌的作用下被順序氧化成no2_和no3_，然后no3_在反硝化細菌的作用下轉化成N2得以去除。
[0003]N.europaea是污水生物脫氮處理系統中典型而又廣泛存在的化能自養型氨氧化細菌，并且對環境變化和污染物的毒性脅迫非常敏感。其氮循環的氧化代謝一般途徑主要包括好氧狀態下氨鹽被順序氧化成羥胺和亞硝酸鹽，同時在缺氧狀態下亞硝酸鹽被還原成NO和N20。因此N.europae是目前用于污水生物脫氮工藝處理性能與溫室氣體排放控制研究的重要模式對象；也是生物脫氮工藝硝化抑制監測生物傳感器研制的重點關注對象。
[0004]目前，由于該菌種對環境變化的高敏感性，純菌種的培養難度大，要求高，往往在培養過程中出現細菌增長緩慢、密度低、活性低、菌種易受雜菌污染等問題，甚至出現長期培養不出的情況。同時，傳統的培養液配方中缺少細菌生長所需的微量礦物元素，或者所含的營養元素濃度比例偏頗，并且其緩沖能力較弱，使得細菌的適應能力、生存能力和繁殖能力受到一定限制。
[0005]因此，隨著該菌種在生物脫氮過程控制與研究中的重要性日益突出，針對目前該菌種培養過程和培養液配方存在的問題，找到一種能使該菌種高效持續增長并提高菌種適應能力的培養方法和培養液配方，對研究該菌種的生理生化特性和生物脫氮過程具有重要意義。
【發明內容】
[0006]技術問題:本發明的目的是克服現有該菌種培養方法的不足，包括該菌種敏感性極高，易受雜菌污染，生長速度緩慢甚至無法富集；本發明公開了一種典型氨氧化菌N.europaea的培養方法和培養液配方，以實現細菌的快速生長,降低該菌種受雜菌污染的幾率，并通過PH的實時監測和調控，依靠pH指示劑顏色變化觀察判斷細菌的活性，同時生物緩沖劑的存在提高了細菌的生存能力。
[0007]技術方案:為達到上述目的，本發明采用的技術方案為:細菌培養過程包括培養液制備、細菌活化和培養，培養液包含細菌生長所需的營養物質、生物緩沖劑和PH指示劑。
[0008]上述培養液的營養物質包括常量元素和微量礦物元素，含有常量元素的物質為:(NH4) 2S04、CaCl2.2H20、K2HPO4，含有微量元素的物質為=MgSO4.7H20、CltlH12FeN2NaO8.3H20、Na2MoO4.2H20、MnSO4.H2O, CoC12.6H20、ZnSO4.7H20。
[0009]上述培養液的生物緩沖劑為C9H2tlN2O4S, pH指示劑為酚紅；本發明的氨氧化細菌的培養液具體配比為:[0010]在1000mL超純水中加入以下材料:
[0011]硫酸銨1.00 ~1.32g，
[0012]七水合硫酸鎂0.15~0.20g，
[0013]二水合氯化鈣0.01~0.02g,
[0014]磷酸氫二鉀0.07 ~0.09g，
[0015]N-2-輕乙基喊嚷_Ni3_丙橫酸2.00~2.50g,
[0016]SolutionA800 ~1000 μ L,
[0017]SolutionB800 ~1000 μ L，
[0018]SolutionC400 ~500 μ L,
[0019]SolutionD400 ~500 μ L。
[0020]所述的SolutionA 的配方為:稱取 IOOmg 螯合鐵 CltlH12FeN2NaO8.3H20 溶于 IOOmL蒸餾水；
[0021]所述的SolutionB的配方為:先分別稱取IOOmgNa2MoO4.2Η20溶于IOOmL蒸懼水，IOOmgMnSO4.Η20 溶于 IOOmL 蒸餾水，100mgCoCl2.6Η20 溶于 IOOmL 蒸餾水，IOOmgZnSO4.7Η20溶于IOOmL蒸餾水，然后再分別取Na2MoO4.2Η20溶液IOmL, MnSO4.H2O溶液17.2mL，CoCl2.6H20溶液0.4mL, ZnSO4.7H20溶液10mL，用去離子水定容至IOOmL,并存儲于4°C冰箱；
[0022]所述的SolutionC的配方為:稱取500mg酚紅溶于IOOmL去離子水，存儲于常溫、黑暗環境下；
[0023]所述的SolutionD的配方為:稱取0.01997gCuS04.5Η20溶于40ml蒸餾水，存儲于
4°C冰箱。
[0024]本發明的亞硝化細菌的培養液的制備方法為:
[0025]1)按照培養基配方在反應容器中溶解各試劑，在連續攪拌的情況下按順序逐一溶解各成分；
[0026]2 )用 40%KHC03 調節 pH 到 6.9 ± 0.50 ;
[0027]3)將培養液分裝在容器中，進行高壓滅菌，時間30~35min，溫度120~125°C ；
[0028]4)冷卻后室溫密封保存。
[0029]采用本發明亞硝化細菌的培養液進行細菌培養方法，其具體步驟如下:
[0030]1)在無菌操作臺中，將菌種與已滅菌的培養液按1: 15~20的體積比接種到已滅菌的培養瓶中，并保證混合液總體積不超過培養瓶體積的1/3 ；
[0031]2)加入磁力攪拌子，密封后包上錫箔紙，放在磁力攪拌器上避光活化3~5天，通過觀察指示劑顏色的變化判斷菌種的活性，當混合液顏色由紅色變為淡紅到橙黃色時，加入少量已滅菌的飽和NaHCO3使混合液呈紅色，當混合液再次變為黃色時，活化完成，取樣鏡檢；
[0032]3)將活化菌種與培養液按1:20~30的體積比接種到反應器內培養，曝氣使溶解氧控制在1.5~3.0mg/L，監測并控制pH值在7.40~7.50。
[0033]有益效果:本發明公開了一種亞硝化細菌的培養液和培養方法，包括培養液配方、菌種活化和培養。該培養液包含細菌生長的營養元素、生物緩沖劑和指示劑，各成分作用如下:(NH4) 2S04、CaCl2.2H20、K2HPO4和MgSO4.7H20，提供細菌生長所必需的常量元素，其中(NH4) 2S04，是細菌生長的主要氮源和能量來源物質，其作為電子供體，通過氧化反應產生電子，并在好氧呼吸鏈中的傳遞轉移保證了 ATP的產生，為菌種的細胞生長與代謝提供能量；EPPS為生物緩沖劑，用于穩定環境中pH的變化，使細菌在最適pH范圍內快速生長，從而提高細菌的繁殖和生存能力；SolutionA，提供細菌生長所必需的微量金屬元素鐵，并且鐵元素以絡合物的形態存在于水中，減少了與其它物質反應從而沉淀失效的機率，并提高了細菌對鐵元素的吸收利用率和細菌生長能力；SolutionB和SolutionD，提供細菌生長所必需的微量金屬元素，包括鈷、鑰、錳、鋅、銅，能促進部分酶的合成，提高細菌的新陳代謝能力；SolutionC為pH指示劑,通過指示劑顏色的變化指示細菌的生長狀態和活性；培養液中的各營養元素比例合適，共同促進該細菌的快速生長，提高了細菌的繁殖能力和生存能力。細菌通過培養液補充營養物質和能量來源，并通過活化，極大的促進了該菌的生長繁殖能力和細菌活性，縮短了細菌的培養時間，并且該培養方法盡可能的保證了培養過程中的無菌條件，并且在培養時，實現了 PH的實時監測和調節，進一步提高了細菌的生存能力和繁殖能力。【具體實施方式】
[0034]本發明公開了一種亞硝化細菌的培養液和培養方法，具體實施包括培養液配制、細菌活化和培養。
[0035]上述培養液各物質的具體配比為:硫酸銨1.00~1.32g，七水合硫酸鎂0.15~0.20g，二水合氯化鈣0.01~0.02g，磷酸氫二鉀0.07~0.09g，N_2_羥乙基哌嗪_Ni3_丙磺酸(EPPS) 2.00 ~2.50g，SolutionA800 ~1000 μ L，SolutionB800 ~1000 μ L，SolutionC400 ~500 μ L, SolutionD400 ~500 μ L,超純水 1000mL。
[0036]其中:SolutionA:100mg/100mL螯合鐵溶液，儲于4°C冰箱。
[0037]SolutionB:混合溶液,儲于4°C冰箱,含:
[0038]10.0mg/1OOmLNa2MoOi.2H20,
[0039]17.2mg/1OOmLMnSO4.H2O,
[0040]0.4mg/mLCoCl2.6H2O,
[0041]10.0mg/mLZnS04.7H20。
[0042]SolutionC:500mg/100mL酹紅溶液,儲于常溫,黑暗環境下。
[0043]SolutionD:0.01997g/40mLCuS04.5H20 溶液，儲于 4°C冰箱。
[0044]上述培養液制備過程:將各物質按順序依次溶解于水中，此過程中溶液保持在不斷攪拌狀態。
[0045]上述細菌活化和培養過程:
[0046](一 )在無菌操作臺中，將菌種與滅過菌的培養液按1:15~20的體積比接種到滅過菌的培養瓶中，并保證混合液總體積不超過培養瓶體積的1/3。
[0047]( 二)加入磁力攪拌子，密封后包上錫箔紙，放在磁力攪拌器上避光活化3~5天，通過觀察指示劑顏色的變化判斷菌種的活性，當混合液顏色由紅色變為淡紅到橙黃色時，加入少量已滅菌的飽和NaHCO3使混合液呈紅色，當混合液再次變為黃色時，活化完成，取樣鏡檢。
[0048](三)將活化菌種與培養液按1:20~30的體積比接種到反應器內培養，并根據需要控制溶解氧濃度在1.0~3.0mg/L范圍內，實時監測pH并控制pH為7.0~7.5。
[0049]上述細菌為歐洲亞硝化單胞細菌(N.europaea)ο
[0050]實例一:
[0051]培養液配制:準備好體積適當的玻璃容器兩個，250mL培養瓶(耐高溫高壓，已滅菌)兩個，100~1000 μ L移液槍(含滅過菌的槍頭)和1000~5000 μ L移液槍各一個，1000mL的量筒等；用量筒量取1000mL超純水，在上述玻璃容器中，依次稱取以下藥品溶解(待上一藥品完全溶解后再逐次溶解下一個藥品):1.0Og (NH4) 2S04、0.15gMgS04.7H20、0.01gCaCl2.2Η20、0.07gK2HP04、2.0OgC9H20N2O4S (EPPS),并同時通過磁力攪拌器攪拌，然后分別加 A 800 μ LSolutionA、800 μ LSolutionB、400 μ LSolutionC 和 400 μ LSolutionD,所有藥品完全溶解后，用40%KHC03調節pH后為6.90，用錫箔紙包好瓶口后，120°C高溫高壓下滅菌30min,并冷卻至室溫待用。
[0052]細菌活化和培養:在經紫外滅菌30min的無菌操作臺內操作后，在操作臺內，分別取ImL菌液(_80°C冰箱保存)和20mL已滅菌的培養液，接種到已滅菌的培養瓶中，30°C下避光振蕩活化大約4.0d后培養瓶中混合液由紅色變至黃色，加入適量飽和NaHCO3使溶液呈紅色，當菌液二次變黃時，細菌活化完成。在無菌操作臺內，將活化完成的菌液轉至定特制的反應器中，持續進培養液恒流培養，反應器中水力停留時間為2~3d，進出水流量保持恒定，恒定值范圍為900~1000 μ L/min,并不斷曝氣保證溶解氧在1.0~3.0mg/L范圍內；加入攪拌子以保證混合充分，并通過PH自動控制器控制反應瓶內pH為7.40~7.50，進反應器緩沖液為飽和NaH CO3溶液(已滅菌)；2d內細菌快速增長，穩定后采樣鏡檢細菌濃度約為1.69 X IO8~2.47 X IO8個/mL (細菌計數板計數)。
[0053]上述實施步驟中應注意:藥品無污染，藥匙保持清潔，藥品依次完全溶解；無菌操作盡量避免與菌液或培養液的直接接觸，各瓶口需用錫箔紙包實。
[0054]實例二:
[0055]培養液配制:準備好體積適當的玻璃容器兩個，250mL培養瓶(耐高溫高壓，已滅菌)兩個，100~1000 μ L移液槍(含滅過菌的槍頭)和1000~5000 μ L移液槍各一個，1000mL的量筒等；用量筒量取1000mL超純水，在上述玻璃容器中，依次稱取以下藥品溶解(待上一藥品完全溶解后再逐次溶解下一個藥品):1.20g (NH4) 2S04、0.17gMgS04.7H20、0.015gCaCl2.2Η20、0.08gK2HP04、2.25gC9H20N204S (EPPS)，并同時加入磁力攪拌子攪拌，然后分別加 A 900 μ LSolutionA、900 μ LSolutionB、450 μ LSolutionC 和 450 μ LSolutionD,所有藥品完全溶解后，用40%KHC03調節pH后為6.95，用錫箔紙包好瓶口后，120°C高溫下滅菌30min,滅完后冷卻至室溫。
[0056]細菌活化和培養:與實例一中細菌活化和培養步驟一樣，活化完成約3.5d，2d內細菌快速增長，穩定后采樣鏡檢細菌濃度約為1.71 X IO8~2.34X IO8個/mL (細菌計數板計數)。
[0057]上述實施步驟中應注意:藥品無污染，藥匙保持清潔，藥品依次完全溶解；無菌操作盡量避免與菌液或培養液的直接接觸，各瓶口需用錫箔紙包實。
[0058]實例三:
[0059]培養液配制:準備好體積適當的玻璃容器兩個，250mL培養瓶(耐高溫高壓，已滅菌)兩個，100~1000 μ L移液槍(含滅過菌的槍頭)和1000~5000 μ L移液槍各一個，1000mL的量筒等；用量筒量取1000mL超純水，在上述玻璃容器中，依次稱取以下藥品溶解(待上一藥品完全溶解后再逐次溶解下一個藥品):1.32g (NH4) 2S04、0.2gMgS04.7H20、0.02gCaCl2.2Η20、0.09gK2HP04、2.5gC9H20N204S (EPPS)，并同時加入磁力攪拌子攪拌，然后分別加 A 1000 μ LSolutionA、1000 μ LSolutionB、500μ LSolutionC 和 500 μ LSolutionD,所有藥品完全溶解后，用40%KHC03調節pH后為6.93，用錫箔紙包好瓶口后，120°C高溫下滅菌30min,滅完后冷卻至室溫。
[0060]細菌活化和 培養:與實例一中細菌活化步驟一樣，活化完成約3.5d ;活化完成后，將活化菌液轉移至已滅菌的培養瓶(500mL)中，并加入200mL培養液，置于30°C恒溫振蕩器中避光培養，2d內細菌快速增長，穩定后采樣鏡檢細菌濃度約為1.77 X IO8~2.22 X IO8個/mL (細菌計數板計數)。
[0061]上述實施步驟中應注意:藥品無污染，藥匙保持清潔，藥品依次完全溶解；無菌操作盡量避免與菌液或培養液的直接接觸，各瓶口需用錫箔紙包實。
【權利要求】
1.一種亞硝化細菌的培養液，其特征在于該培養液具體配比為: 在1000mL超純水中加入以下材料: 硫酸銨1.00~1.32g， 七水合硫酸鎂0.15~0.20g， 二水合氯化鈣0.01~0.02g, 磷酸氫二鉀0.07~0.09g, N-2-羥乙基哌嗪-N13-丙磺酸(EPPS) 2.00~2.52g,
Solut1onA800 ~1000 μ L:
Solut1onB800 ~1000 μ L,
Solut1onC400 ~500 μ L，
Solut1onD400 ~500 μ L, 所述的Solut1onA的配方為:稱取1OOmg螯合鐵CltlH12FeN2NaO8.3H20溶于1OOmL蒸餾水； 所述的Solut1onB的配方為:先分別稱取1OOmgNa2MoO4.2H20溶于1OOmL蒸懼水,1OOmgMnSO4.Η20 溶于 1OOmL 蒸餾水，100mgCoCl2.6Η20 溶于 1OOmL 蒸餾水，1OOmgZnSO4.7Η20溶于1OOmL蒸餾水，然后再分別取Na2MoO4.2Η20溶液1OmL, MnSO4.H2O溶液17.2mL，CoCl2.6H20溶液0.4mL, ZnSO4.7H20溶液10mL，用去離子水定容至1OOmL,并存儲于4°C冰箱； 所述的Solut1onC的配方為:稱取500mg酚紅溶于1OOmL去離子水，存儲于常溫、黑暗環境下； 所述的Solut1onD的配方為:稱取0.01997gCuS04.5Η20溶于40ml蒸餾水，存儲于4°C冰箱。
2.一種如權利要求1所述的亞硝化細菌的培養液的制備方法，其特征在于: 1)按照培養基配方在反應容器中溶解各試劑，在連續攪拌的情況下按順序逐一溶解各成分；
2)用40%KHC03 調節 pH 到 6.90±0.50 ； 3)將培養液分裝在容器中，進行高壓滅菌，時間30~35m1n，溫度120~125°C； 4)冷卻后室溫密封保存。
3.一種采用權利要求1所述的亞硝化細菌的培養液進行細菌培養方法，其特征在于其具體步驟如下； 1)在無菌操作臺中，將菌種與滅過菌的培養液按1: 15~20的體積比接種到滅過菌的培養瓶中，并保證混合液總體積不超過培養瓶體積的1/3 ； 2)加入磁力攪拌子，密封后包上錫箔紙，放在磁力攪拌器上避光活化3~5天，通過觀察指示劑顏色的變化判斷菌種的活性，當混合液顏色由紅色變為淡紅到橙黃色時，加入少量已滅菌的飽和NaHCO3使混合液呈紅色，當混合液再次變為黃色時，活化完成，取樣鏡檢； 3)將活化菌種與培養液按1:20~30的體積比接種到反應器內培養，曝氣使溶解氧控制在1.5~3.0mg/L，監測并控制pH值在7.40~7.50。
【文檔編號】C12R1/01GK103898026SQ201410141638
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】余冉, 吳俊康, 陳良輝, 劉美婷 申請人:東南大學