耐熱菌類的檢測方法

耐熱菌類的檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種耐熱菌類的檢測方法，所述檢測方法使用序列號3～6、10～11和57～72中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸，或者使用在該堿基序列中使1～3個堿基缺失、置換或者添加而得到并能夠用于耐熱菌類的檢測的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸，對屬于籃狀菌（Talaromyces）屬耐熱菌類進行鑒定。
【專利說明】耐熱菌類的檢測方法
[0001 ] 本申請是申請日為2009年5月28日、申請號為200980126323.2、發明名稱為耐熱菌類的檢測方法的專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種耐熱菌類的檢測方法。
【背景技術】
[0003]耐熱的菌類(真菌類)廣泛分布于自然界，在蔬菜、水果等農作物上繁殖，并污染以這些農作物為原料的飲食品。然而，耐熱的菌類與通常的其他菌類相比具有高的耐熱性。例如即使對酸性飲料進行加熱滅菌處理，耐熱菌類也可以生存、繁殖，從而成為造成發霉的原因。因此，耐熱菌類被作為引起重大事故的重要有害菌而被戒備。
[0004]作為從加熱滅菌處理后的飲食品中檢測出來的污染事故的原因菌的主要的耐熱菌類，已知有屬于絲衣霉(Byssochlamys)屬、籃狀菌(Talaromyces)屬、新薩托菌(Neosartorya)屬、以及半內果菌(Hamigera)屬的耐熱菌類。與形成子囊孢子的其他耐熱菌類相比，屬于上述4個屬的菌類具有非常高的耐熱性，加熱滅菌后的生存可能性也較高。另一方面，上述4個屬之外的耐熱菌類，由于可以在通常的滅菌條件下被殺滅，所以只要不出現滅菌不良等的情況，造成污染事故的可能性是很低的。因此，為了防止飲食品以及這些原材料中的耐熱菌類引起的事故，檢測和鑒別屬于這4個屬的耐熱菌類是特別重要的。 [0005]此外，在調查危害事故發生時的事故原因以及對策上，事故的原因菌的鑒定也是必要的。因此，如果可以鑒別上述4個屬的耐熱菌類的話，就可以更加迅速地檢測和鑒別事故的原因菌。
[0006]另一方面，作為現有的耐熱菌類的檢測和鑒別方法，有將被檢測體在PDA培養基等上培養然后進行檢測和鑒別的方法。但是，此方法直到能夠確認菌落需要大約7天。而且，由于菌種的鑒定是基于菌的特征器官的形態進行的，所以直到能夠確認形態學上的特征又需要大約7天的培養。因此，如果用此方法，耐熱菌類的檢測和鑒別需要約14天。這樣的耐熱菌類的檢測和鑒別需要長時間，這從飲食品的衛生管理、原材料的鮮度保證、流通上的限制等觀點來看，肯定無法得到滿足。因此，需要確立更迅速的耐熱菌類的檢測和鑒別方法。
[0007]作為菌類的迅速的檢測和鑒別方法，已知有利用PCR (聚合酶鏈式反應)法進行的檢測方法(例如，參考專利文獻I~4)。但是，在這些方法中，有難于特異并且迅速檢測特定的耐熱菌類的問題。
[0008]專利文獻1:特表平11-505728號公報
[0009]專利文獻2:特開2006-61152號公報
[0010]專利文獻3:特開2006-304763號公報
[0011]專利文獻4:特開2007-174903號公報
【發明內容】

[0012]本發明的課題在于提供一種特異并且迅速檢測、鑒別作為飲食品污染的主要原因的菌耐熱菌類的方法。
[0013]作為如上所述難于檢測出耐熱菌類的原因之一，可列舉通過利用現有公知引物的PCR法而出現假陽性或者假陰性的結果。
[0014]本發明人等對于克服此問題，并能夠特異檢測和鑒別出特定耐熱菌類的新的DNA區域進行了探索和深入的研究。其結果發現:在耐熱菌類的β_微管蛋白基因或者28SrDNA的D1/D2區域以及ITS區域中，存在著與其他菌類有明顯區別的具有特異的堿基序列的區域(以下，稱其為“可變區”)，以此可變區為靶點，就可以對上述耐熱菌類進行特異且迅速的檢測和鑒別。基于此知識從而完成了本發明。
[0015]根據本發明，提供了以下方法:
[0016]本發明涉及一種屬于籃狀菌(Talaromyces)屬耐熱菌類的檢測方法,其包括下述
2)的工序，
[0017]2)用下述(B-1)或者(B-2)的寡核苷酸作為引物對屬于籃狀菌(Talaromyces)屬的菌類進行鑒定的工序，
[0018](B-1)序列號3~6、10~11和57~72中任一個記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸；
[0019](B-2)在序列號3~6、10~11和57~72中任一個記載的喊基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸。
[0020]此外,本發明涉及一種屬于籃狀菌(Talaromyces)屬耐熱菌類的檢測用寡核苷酸,其特征在于，
[0021]所述檢測用寡核苷酸是序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸，或者是在序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的堿基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸
[0022]另外,本發明涉及一種屬于籃狀菌(Talaromyces)屬耐熱菌類的檢測用試劑盒,其含有選自下述(1-1)或者(1-2)的寡核苷酸中的至少一種作為核酸探針或者核酸引物，
[0023](1-1)序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸；
[0024](1-2)在序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的喊基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測耐熱菌類的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸。
[0025]根據本發明，可以提供一種特異并且迅速地檢測、鑒別作為飲食品污染事故的主要原因菌的耐熱菌類的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1 是煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、費希爾新薩托菌(Neosartoryafischeri var.fischeri),刺抱新薩托菌(Neosartorya fischeri var.spinosa)的 β-微管蛋白基因的堿基序列的一部分的比較圖。
[0027]圖2是表示榛色鉤囊菌(Hamigera avellanea)以及芽枝狀枝孢(Cladosporiumcladosporoides)的β _微管蛋白基因的堿基序列圖。
[0028]圖3是表示實施例1 (A-1)的屬于絲衣霉屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0029]圖4是使用實施例1 (Α-2)的純黃絲衣菌(Byssochlamys fulva)的各菌株的電泳圖。
[0030]圖5是使用實施例1 (A-2)的雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea)的各菌株的電泳圖。
[0031]圖6是實施例1 (B-1)的屬于籃狀菌屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0032]圖7是實施例1 (B-2)的屬于籃狀菌屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0033]圖8是表示實施例1 (B-2)的屬于籃狀菌屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0034]圖9-1是實施例1 (B-3)的電泳圖。
[0035]圖9-2是實施例1 (B-4)的電泳圖。[0036]圖10是使用實施例1 (B-5)的黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的各菌株的電泳圖。
[0037]圖11是使用實施例1 (B-5)的大孢籃狀菌(Talaromyces macrosporus)的各菌株的電泳圖。
[0038]圖12是表示實施例1 (C-1)的屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的鑒別結果的電泳圖。
[0039]圖13是表示實施例1 (C-2)的屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的鑒別結果的電泳圖。
[0040]圖14是表示實施例1 (C-3)的屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的鑒別結果的電泳圖。
[0041]圖15是表示實施例1 (C-3)的屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的鑒別結果的電泳圖。
[0042]圖16是使用實施例1 (C-4)的費希爾新薩托菌(Neosartorya fischeri var.fischeri)的各菌株的電泳圖。
[0043]圖17是使用實施例1 (C-4)的光滑新薩托菌(Neosartorya fischeri var.glabra)的各菌株的電泳圖。
[0044]圖18是使用實施例1 (C-4)的平塚新薩托菌(Neosartorya hiratsukae)的各菌株的電泳圖。
[0045]圖19是使用實施例1 (C-4)的Neosartorya paulistensis的各菌株的電泳圖。
[0046]圖20是使用實施例1 (C-4)的刺抱新薩托菌(Neosartorya fischeri var.spinosa)的各菌株的電泳圖。
[0047]圖21是表示實施例1 (D-1)的屬于半內果菌屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0048]圖22是表示實施例1 (D-2)的屬于半內果菌屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0049]圖23是表示實施例1 (D-3)的屬于半內果菌屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0050]圖24-1是使用實施例1 (D-4)的條紋鉤囊菌(Hamigera striata)的各菌株的電泳圖。[0051]圖24-2是使用實施例1 (D-5)的榛色鉤囊菌(Hamigera avellanea)的各菌株的電泳圖。
[0052]圖25-1是使用實施例1 (D-6)的屬于半內果菌屬以及絲衣霉屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0053]圖25-2是使用實施例1 (D-6)的屬于半內果菌屬以及絲衣霉屬的菌類的鑒別結果的電泳圖。
[0054]圖26是顯示在絲衣霉屬的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的堿基序列中，識別為絲衣霉屬檢 測用引物的堿基序列的位置關系。
[0055]圖27是顯示在新薩托菌屬的β -微管蛋白基因的堿基序列中，識別為新薩托菌屬檢測用引物的堿基序列的位置關系。
[0056]圖28是顯示在煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的β -微管蛋白基因的堿基序列中，識別為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)檢測用引物的堿基序列的位置關系。
[0057]圖29是顯示在半內果菌屬的β -微管蛋白基因的堿基序列中，識別為半內果菌屬檢測用引物的堿基序列的位置關系。
[0058]圖30是顯不在黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的堿基序列中，識別為黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)檢測用引物的堿基序列的位置關系。
[0059]圖31是顯示在沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)的β_微管蛋白基因的堿基序列中，識別為沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)檢測用引物的堿基序列的位
置關系。
[0060]圖32是顯示在藤黃籃狀菌(Talaromyces Iuteus)的β-微管蛋白基因的堿基序列中，識別為藤黃籃狀菌(Talaromyces Iuteus)檢測用引物的堿基序列的位置關系。
[0061]圖33是顯示在黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的堿基序列中，識別為黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)檢測用引物的堿基序列的位置關系。
[0062]圖34是顯示在糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)以及黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的堿基序列中，識別為糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)以及黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)檢測用引物的堿基序列的位置關系。
[0063]圖34-1是顯示在糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)以及黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的堿基序列中，識別為糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)以及黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)檢測用引物的堿基序列的位置關系(續圖34)。
[0064]圖35是表示實施例2中用實時濁度法測定的絲衣霉屬的菌類的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自純黃絲衣菌(Byssochlamysfulva)IFM48421菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，2表示使用來自雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea) IFM51244菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，4表示使用來自藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus) IFM53241菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，6表示使用來自沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii) IFM52262菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，7表示使用來自Neosartorya ficheri IFM46945菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度。
[0065]圖36是表示實施例3中用實時濁度法測定的的新薩托菌屬的β -微管蛋白基因的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自費希爾新薩托菌(Neosartorya ficheri) IFM46945菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，2表示使用來自刺孢新薩托菌(Neosartorya鄧1110%)正146967菌株的基因組0嫩的樣品的檢測靈敏度，3表示使用來自光滑新薩托菌(Neosartorya glabra) IFM46949菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，4表示使用來自平塚新薩托菌(Neosartorya hiratsukae) IFM47036菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，5表示使用來自黃色籃狀菌(Talaromyces flavus) IFM42243菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，6表示使用來自藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus) IFM53242菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，7表示使用來自糙孢籃狀菌(Talaromycestrachyspermus) IFM42247菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，9表示使用來自純黃絲衣菌(Byssochlamys fulva) IFM48421菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，11表示使用來自鏈格孢(Alternaria alternate) IFM41348菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，14表示使用來自尖孢鐮孢(Fusarium oxysporium) IFM50002菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度。
[0066]圖36-1是表示實施例3中用實時濁度法測定的新薩托菌屬以及煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的菌類的β _微管蛋白基因的檢測靈敏度的圖。
[0067]圖37是表示實施例4中用實時濁度法測定的半內果菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自榛色鉤囊菌(Hamigera avellanea) IFM42323菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度,2表示使用來自榛色鉤囊菌(Hamigera avellanea)IFM52241菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，3表示使用來自榛色鉤囊菌(Hamigeraavellanea) IFM52957 菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，4表示使用來自純黃絲衣菌(Byssochlamys fulva) IFM51213菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，5表示使用來自雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea) IFM51245菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，6表示使用來自宛氏擬青霉(Paecilomyces variotii) IFM40913菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，7表示使用來自宛氏擬青霉(Paecilomyces variotii) IFM40915菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度。
[0068]圖38是表示實施例5中用實時池度法測定的煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的β -微管蛋白基因的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)A209菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，2表示使用來自煙曲霉(Aspergillusfumigatus) A213菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，3表示使用來自煙曲霉(Aspergillus fumigatus) A215菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度,6表示使用來自刺孢新薩托菌(Neosartorya spinosa) IFM46967菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度。
[0069]圖39是表示實施例6中用實時池度法測定的黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自黃色籃狀菌(Talaromycesflavus) IFM42243菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，2表示使用來自黃色籃狀菌(Talaromyces flavus) IFM52233菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，6表示使用來自糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus) IFM52252菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，7表示使用來自沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii) IFM52255菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，9表示使用來自純黃絲衣菌(Byssochlamys fulva) IFM48421菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度。
[0070]圖40是表示實施例7中用實時池度法測定的沃特曼籃狀菌(Talaromyceswortmannii)的β _微管蛋白基因的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii) IFM52255菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度,2表示使用來自沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii) IFM52262菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，3表示使用來自黃色籃狀菌(Talaromyces flavus) IFM42243菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，4表示使用來自藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus) IFM53241菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，5表示使用來自糙孢籃狀菌(Talaromycestrachyspermus) IFM42247菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，7表示使用來自雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea) IFM51244菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，8表示使用來自榛色鉤囊菌(Hamigera avellanea) IFM42323菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度。
[0071]圖41是表示實施例8中用實時池度法測定的藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)的β_微管蛋白基因的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自藤黃籃狀菌(Talaromycesluteus) IFM53242菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，2表示使用來自藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus) IFM53241菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，5表示使用來自沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii) IFM52262菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，8表示使用來自刺孢新薩托菌(Neosartorya spinosa) IFM46967菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度。[0072]圖42是表示實施例9中用實時池度法檢測的黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)的28SrDNA的ITS區域以及D1/D2區域的檢測靈敏度的圖。I表示使用來自黃色籃狀菌(Talaromyces flavus) IFM42243菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，2表示使用來自黃色籃狀菌(Talaromycesflavus) IFM52233菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，3表示使用來自黃色籃狀菌(Talaromyces flavus) T38菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度,6表示使用來自糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus) IFM42247菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，7表示使用來自糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus) IFM52252菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，9表示使用來自沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii) IFM52255菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，10表示使用來自純黃絲衣菌(Byssochlamys fulva)IFM48421菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，12表示使用來自蕁麻青霉(Penicilliumgriseofulvum) IFM54313菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，13表示使用來自桔青霉(Penicillium citirinum) IFM54314菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，15表示使用來自費希爾新薩托菌(Neosartorya ficheri) IFM46945菌株的基因組DNA的樣品的檢測靈敏度，16表示使用DW作為陰性對照的樣品的檢測靈敏度。本發明的上述以及其他特征和優點，通過參考適當的附圖并從下述記載中更為明確。
【具體實施方式】
[0073]以下，對本發明進行詳細說明。
[0074]本發明是利用含有耐熱菌類的β_微管蛋白基因的部分堿基序列或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的堿基序列，即耐熱菌類的β-微管蛋白基因區域或者28SrDNA的D1/D2區域以及ITS區域中耐熱菌類的各屬的特異的區域或者種特異的區域(可變區)的堿基序列的核酸，進行耐熱菌類的鑒定，對耐熱菌類進行特異地鑒別、檢測的方法。
[0075]根據本發明，可以鑒別、檢測屬于絲衣霉(Byssochlamys)屬的菌類、屬于籃狀菌(Talaromyces)屬的菌類、屬于新薩托菌(Neosartorya)屬的菌類、屬于半內果菌(Hamigera)屬的菌類、以及煙曲霉(Aspergillus fumigatus)等的耐熱菌類。
[0076]更詳細的說，本發明是包括下述I)~4)的鑒定、檢測工序中至少一步的耐熱菌類的檢測方法。
[0077]I)利用含有屬于絲衣霉(Byssochlamys)屬的菌類的β_微管蛋白基因區域以及/或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域中絲衣霉屬特異區域(可變區)的堿基序列的核酸，進行屬于絲衣霉屬的菌類的鑒定，對屬于絲衣霉屬的菌類進行特異地鑒別、檢測的工序。
[0078]2)利用含有屬于籃狀菌(Talaromyces)屬的菌類的β -微管蛋白基因區域以及/或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域中籃狀菌屬特異區域或者種特異區域(可變區)的堿基序列的核酸，進行屬于籃狀菌屬的菌類的鑒定，對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、檢測的工序。
[0079]3)利用含有屬于新薩托菌(Neosartorya)屬的菌類或者煙曲霉(AsperRillusfumigatus)的β_微管蛋白基因區域中新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉特異區域或者種特異區域(可變區)的堿基序列的核酸，進行屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉的鑒定，對屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉進行特異地鑒別、檢測的工序。
[0080]4)利用含有屬于半內果菌(Hamigera)屬的菌類的β _微管蛋白基因區域中半內果菌屬特異區域或者種特異區域(可變區)的堿基序列的核酸，進行屬于半內果菌屬的菌類的鑒定，對屬于半內果菌屬的菌類進行特異地鑒別、檢測的工序。
[0081]本發明的檢測方法，優選包括上述I)~4)的鑒定、檢測工序中的至少2個工序，更優選包括上述I)~4)的鑒定、檢測工序中的至少3個工序，最優選包括上述I)~4)的鑒定、檢測工序中的全部工序。本發明的檢測方法，通過包括數個上述I)~4)的工序，就可以全面檢測出作為飲食品污染的主要原因菌的耐熱菌。
[0082]本發明中的屬于絲衣霉屬的菌類、屬于籃狀菌屬的菌類、屬于新薩托菌屬的菌類、煙曲霉以及屬于半內果菌屬的菌類等的“耐熱菌類”，是指屬于發菌科(Trichocomaceae)的不整子囊菌類(Plectomycetes),是即使在75°C、30分鐘的加熱處理后形成可以生存的子囊孢子的耐熱菌類。作為屬于絲衣霉屬的菌類的例子，可列舉純黃絲衣菌(Byssochlamysfulva),雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea)。作為屬于籃狀菌屬的菌類的例子，可列舉黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus),糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)，沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)，桿抱籃狀菌(Talaromyces bacillisporus)，大抱籃狀菌(Talaromyces macrosporus)。作為屬于新薩托菌屬的菌類的例子，可列舉刺孢新薩托菌(Neosartorya fischeri var.spinosa)(以下稱為 Neosartorya spinosa)，費希爾新薩托菌(Neosartorya fischeri var.fischeri)(以下稱為 Neosartorya fischeri),光滑新薩托菌(Neosartorya fischeri var.glabra)(以下稱為Neosartorya gl abra),平塚新薩托菌(Neosartorya hiratsukae) ,Neosartoryapaulistensis,假費希爾新薩托菌(Neosartorya peudofischeri)。作為屬于半內果菌屬的菌類的例子，可列舉榛色鉤囊菌(Hamigera avellanea),條紋鉤囊菌(Hamigera striata)。
[0083]本發明中的“煙曲霉”是指,與費希爾新薩托菌(Neosartorya fischeri)的無性型(無性世代)在形態學上極其類似但是沒有有性型(有性世代)的半知菌類的一種。
[0084]在本發明中，“可變區”是指，微管蛋白基因中或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS (內轉錄間隔區，internal transcribed spacer)區域中易于積累堿基變異的區域。
[0085]“ β -微管蛋白”是指與α -微管蛋白一起構成真核細胞的微管的蛋白質，“ β -微管蛋白基因”是指編碼β_微管蛋白的基因。另外，“28S rDNA”是指編碼作為向蛋白質轉化場所的核糖體的遺傳信息的DNA。本發明人著眼于β_微管蛋白基因和28S rDNA所共同編碼的蛋白質本身在真菌內普遍存在這一事實。而且，發現:在此基因或者rDNA序列中，由于堿基的變異比較容易積累，且此變異在屬或種的水平上被保存，因此在該基因或者rDNA序列內的特定區域內存在著可以用于與其他屬其他種區別的堿基序列的可能性高的共通點。基于這些知識，對于以上述的耐熱菌類為首的各種真菌類，鑒定?分析β_微管蛋白基因或者28S rDNA的堿基序列，從而得到了本發明中的“可變區”。
[0086]因此，該可變區的堿基序列在真菌的屬或者種之間差別較大，這些菌類的微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的可變區是這些菌類固有的堿基序列，因此可以和其他屬或者其他種的菌類明顯區別。
[0087]本發明的檢測方法中使用的耐熱菌類的β-微管蛋白基因中或者28S rDNA的Dl/D2區域以及ITS區域中的特定區域(可變區)的堿基序列所對應的核酸，是下述(I)或者
(II)的核酸。
[0088](I)含有序列號24~35或者83~86中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的核酸；
[0089](II)含有在序列號24~35或者83~86中任一個所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于鑒定耐熱菌類的堿基序列或者其互補序列的核酸。
[0090]更具體而言，為了檢測屬于絲衣霉屬的菌類而利用下述(A-1)或者(A-1I)的核酸，即屬于絲衣霉屬的菌類的微管蛋白基因中或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域中的特定區域(可變區)的堿基序列所對應的核酸。
[0091](A-1)含有序列號24或者25記載的堿基序列或者其互補序列的核酸；
[0092](A-1I)含有在序列號24或者25記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于絲衣霉屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的核酸。
[0093]發明人鑒定了來自屬于絲衣霉屬的菌類以及與屬于絲衣霉屬的菌類近緣的菌類的各種微管蛋白基因以及28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的堿基序列，進行了在與絲衣霉屬近緣的屬和絲衣霉屬之間、以及絲衣霉屬內的遺傳距離的解析。此外，還進行了所鑒定的各種微管蛋白基因序列以及28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的堿基序列的同源性解析。其結果是，找到了該序列中具有屬于絲衣霉屬的菌類中固有的堿基序列的可變區。在此可變區中，由于屬于絲衣霉屬的菌類具有固有的堿基序列，就可能進行屬于絲衣霉屬的菌類的鑒別、鑒定。[0094]在本發明的檢測方法中，為檢測屬于籃狀菌屬的菌類而利用下述(B-1)或者(B-1I)的核酸，即屬于籃狀菌屬的菌類的β_微管蛋白基因中以及/或者28S rDNA的Dl/D2區域以及ITS區域中的特定區域(可變區)的堿基序列所對應的核酸。
[0095](B-1)含有序列號26~31中任一個記載的堿基序列或者其互補序列的核酸；
[0096](B-1I)含有在序列號26~31中任一個記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的核酸。
[0097]發明人鑒定了來自屬于籃狀菌屬的菌類以及與屬于籃狀菌屬的菌類近緣的菌類的各種微管蛋白基因以及28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的堿基序列，進行了在與籃狀菌屬近緣的屬以及籃狀菌屬之間、以及籃狀菌屬內的遺傳距離的解析。此外，還進行了所鑒定的各種微管蛋白基因序列以及28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的堿基序列的同源性解析。其結果是，找到了該序列中具有屬于籃狀菌屬的菌類的固有的堿基序列的可變區。在此可變區中，由于屬于籃狀菌屬的菌類具有固有的堿基序列，就可能進行屬于籃狀菌屬的菌類的鑒別、鑒定。[0098]在本發明的檢測方法中，為檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉而利用下述(C-1)或者(C-1I)的核酸，即屬于新薩托菌屬的菌類或者煙曲霉的β -微管蛋白基因中的特定區域(可變區)的堿基序列所對應的核酸。
[0099](C-1)含有序列號32~34或者83~86中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的核酸；
[0100](C-1I)含有在序列號32~34或者83~86中任一個所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉的堿基序列或者其互補序列的核酸。
[0101]發明人鑒定了來自屬于新薩托菌屬的菌類、煙曲霉以及與屬于新薩托菌屬的菌類近緣的菌類的各種β-微管蛋白基因的堿基序列，進行了與新薩托菌屬近緣的屬與新薩托菌屬之間、新薩托菌屬內、以及與新薩托菌屬近緣的屬或新薩托菌屬與煙曲霉之間的遺傳距離的解析。此外，還進行了所鑒定的各種β -微管蛋白基因的堿基序列的同源性解析。其結果是，找到了該序列中具有屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉中固有的堿基序列的可變區。在此可變區中，由于屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉具有固有的堿基序列，就可能進行屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的鑒別、鑒定。
[0102]在本發明的檢測方法中，其特征在于:為檢測屬于半內果菌屬的菌類而利用下述(D-1)或者(D-1I)的核酸，即屬于半內果菌屬的菌類的β_微管蛋白基因中的特定區域(可變區)的堿基序列所對應的核酸。
[0103](D-1)含有序列號35記載的堿基序列或者其互補序列的核酸；
[0104](D-1I)含有在序列號35記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于半內果菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的核酸。
[0105]發明人鑒定了來自屬于半內果菌屬的菌類以及與屬于半內果菌屬的菌類近緣的菌類的各種β_微管蛋白基因的堿基序列，進行了在與半內果菌屬近緣的屬和半內果菌屬之間、以及半內果菌屬內的遺傳距離的解析。此外，還進行了所鑒定的各種β_微管蛋白基因序列的同源性解析。其結果是，找到了該序列中具有屬于半內果菌屬的菌類中固有的堿基序列的可變區。在此可變區中，由于屬于半內果菌屬的菌類具有固有的堿基序列，就可能進行屬于半內果菌屬的菌類的鑒別、鑒定。
[0106]本發明以這些可變區以及來自可變區的核酸、寡核苷酸作為靶點。
[0107]本發明的檢測方法中使用的上述(A-1)或者(A-1I)的堿基序列，對應于屬于絲衣霉屬的菌類的β -微管蛋白基因的部分堿基序列或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列。
[0108]序列號24所記載的堿基序列以及其互補序列，是從雪白絲衣菌(Byssochlamysnivea)中分離、鑒定的β _微管蛋白基因的可變區的堿基序列。序列號25所記載的堿基序列以及其互補序列，是純黃絲衣菌(Byssochlamys fulva)中分離、鑒定的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列。該序列是屬于絲衣霉屬的菌類的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于絲衣霉屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號24或者25所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于絲衣霉屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于絲衣霉屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。含有這些堿基序列的核酸，特別適用于檢測雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea)以及純黃絲衣菌(Byssochlamys f ulva)。
[0109]本發明的檢測方法中使用的上述(B-1)或者(B-1I)的堿基序列，對應于屬于籃狀菌屬的菌類的β -微管蛋白基因的部分堿基序列或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列。
[0110]序列號26所記載的堿基序列以及其互補序列，是從黃色籃狀菌(Talaromycesflavus)中分離、鑒定的β_微管蛋白基因的可變區的堿基序列。該序列是屬于籃狀菌屬的菌類的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號26所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。含有這些堿基序列的核酸,特別適用于檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)。
[0111]序列號27所記載的堿基序列以及其互補序列，是從藤黃籃狀菌(Talaromycesluteus)中分離、鑒定的β_微管蛋白基因的可變區的堿基序列。該序列是屬于籃狀菌屬的菌類的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號27所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。含有這些堿基序列的核酸,特別適用于檢測藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus),桿孢籃狀菌(Talaromyces bacillisporus)，沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)。
[0112]序列號28所記載的堿基序列以及其互補序列，是從沃特曼籃狀菌(Talaromyceswortmannii)中分離、鑒定的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列。該序列是屬于籃狀菌屬的菌類的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號28所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。含有這些堿基序列的核酸，特別適用于檢測沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus),大抱籃狀菌(Talaromyces macrosporus)。
[0113]序列號29所記載的堿基序列以及其互補序列，是從沃特曼籃狀菌(Talaromyceswortmannii)中分離、鑒定的β _微管蛋白基因的可變區的堿基序列。該序列是屬于籃狀菌屬的菌類的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號29所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。含有這些堿基序列的核酸，特別適用于檢測沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)。
[0114]序列號30所記載的堿基序列以及其互補序列，是從黃色籃狀菌(Talaromycesflavus)中分離、鑒定的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列。序列號31所記載的堿基序列以及其互補序列,是從糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)中分離、鑒定的28SrDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列。該序列是屬于籃狀菌屬的菌類的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號30或者31所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異地鑒另1J、鑒定。含有 這些堿基序列的核酸，特別適用于檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)。
[0115]本發明的檢測方法中使用的上述(C-1)或者(C-1I)的堿基序列，對應于屬于新薩托菌屬的菌類或者煙曲霉的β-微管蛋白基因的部分堿基序列。
[0116]序列號32所記載的堿基序列以及其互補序列，是從光滑新薩托菌(Neosartoryaglabra)中分離、鑒定的β _微管蛋白基因的可變區的堿基序列。序列號83或者84所記載的堿基序列以及其互補序列，是從費希爾新薩托菌(Neosartorya fischeri)中分離、鑒定的β _微管蛋白基因的可變區的部分喊基序列。序列號85或者86所記載的喊基序列以及其互補序列，是從刺孢新薩托菌(Neosartorya spinosa)中分離、鑒定的β-微管蛋白基因的可變區的部分堿基序列。此外，序列號33或者34所記載的堿基序列以及其互補序列，是從煙曲霉中分離、鑒定的β_微管蛋白基因的可變區的堿基序列。該序列是屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號32~34或者83~86中任一個所記載堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉進行特異地鑒別、鑒定。含有這些堿基序列的核酸，特別適用于檢測光滑新薩托菌(Neosartorya glabra),費希爾新薩托菌(Neosartorya fischeri),刺孢新薩托菌(Neosartorya spinosa)，平塚新薩托菌(Neosartorya hiratsukae), Neosartoryapaulistensis,假費希爾新薩托菌(Neosartorya peudofischeri),煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。
[0117]本發明的檢測方法中使用的上述(D-1)或者(D-1I)的堿基序列，對應于屬于半內果菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的部分堿基序列。
[0118]序列號35所記載的堿基序列以及其互補序列，是從榛色鉤囊菌(Hamigeraavellanea)中分離、鑒定的β _微管蛋白基因的可變區的堿基序列。該序列是屬于半內果菌屬的菌類的特異性序列，通過確認被檢測體中是否含有此堿基序列，就可能對屬于半內果菌屬的菌類進行特異地鑒別、鑒定。此外，利用含有在序列號35所記載的堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于半內果菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列的堿基序列，也可以同樣對屬于半內果菌屬的菌類進行特異地鑒另1J、鑒定。含有這些堿基序列的核酸，特別適用于檢測榛色鉤囊菌(Hamigera avellanea),條紋鉤囊菌(Hamigera striata)。
[0119]下面，將上述(A-1)~(D-1I)中任一個堿基序列總稱為“本發明的可變區的堿基序列”。
[0120]作為使用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸來鑒定耐熱菌類的方法，沒有特別限制，可以用基因工程中通常使用的方法如測序法、雜交法、PCR法、LAMP法等進行。
[0121]在本發明的檢測方法中，為了利用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸進行對耐熱菌類的鑒定，優選測定被檢測體的β_微管蛋白基因區域或者28S rDNA的Dl/D2區域以及ITS區域的堿基序列，然后確認在該區域的堿基序列中是否含有上述(A-1)~(D-1I)中任一個堿基序列。
[0122]更為詳細的，利用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸來進行對屬于絲衣霉屬的菌類的鑒定，優選為測定被檢測體的β_微管蛋白基因區域或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的堿基序列，然后確認在該區域的堿基序列中是否含有上述(A-1)或者(A-1I)的堿基序列。即，本發明的檢測方法包含的優選形式是，解析、測定被檢測體所具有的微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的堿基序列，將測定出來的堿基序列與本發明上述的(A-1)或者(A-1I)的β-微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列進行比較，根據其是否一致或者不同來鑒定屬于絲衣霉屬的菌類。
[0123]利用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸來進行對屬于籃狀菌屬的菌類的鑒定，優選為測定被檢測體的β_微管蛋白基因區域或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的堿基序列，然后確認在該區域的堿基序列中是否含有上述(B-1)或者(B-1I)的堿基序列。即，本發明的檢測方法包含的優選形式是，解析、測定被檢測體所具有的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的堿基序列，將測定出來的堿基序列與本發明上述的(B-1)或者(B-1I)的β-微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的可變區的堿基序列進行比較，根據其是否一致或者不同來鑒定屬于籃狀菌屬的菌類。[0124]利用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸來進行對屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉的鑒定，優選為測定被檢測體的β_微管蛋白基因區域的堿基序列，然后確認在該區域的堿基序列中是否含有上述(C-1)或者(C-1I)的堿基序列。即，本發明的檢測方法包含的優選形式是，解析、測定被檢測體所具有的β-微管蛋白基因的堿基序列，將測定出來的堿基序列與本發明上述的(C-1)或者(C-1I)的β-微管蛋白基因的可變區的堿基序列進行比較，根據其是否一致或者不同來鑒定屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉。
[0125]利用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸來進行對屬于半內果菌屬的菌類的鑒定，優選為測定被檢測體的β_微管蛋白基因區域的堿基序列，然后確認在該區域的堿基序列中是否含有上述(D-1)或者(D-1I)的堿基序列。即，本發明的檢測方法包含的優選形式是，解析、測定被檢測體所具有的β_微管蛋白基因的堿基序列，將測定出來的堿基序列與本發明上述的(D-1)或者(D-1I)的β_微管蛋白基因的可變區的堿基序列進行比較，根據其是否一致或者不同來鑒定屬于半內果菌屬的菌類。
[0126]作為堿基序列的解析、測定方法，并沒有特別限定，可以利用通常進行的RNA或者DNA測序的方法。
[0127]具體地,可以列舉Maxam - Gilbert法、Sanger法等的電泳法、質譜法、雜交法等。在Sanger法中，可以列舉用放射性標記法、熒光標記法等來標記引物或者終止子的方法。
[0128]在本發明中，為了利用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸來對耐熱菌類進行檢測、鑒定，可以利用與上述本發明的可變區的堿基序列，即上述(A-1)~(D-1I)中任一個核酸進行雜交，并且作為對耐熱菌類進行特異性檢測的檢測用寡核苷酸而發揮功能的檢測用寡核苷酸。
[0129]更詳細地，為了進行對屬于絲衣霉屬的菌類的檢測、鑒定，可以利用與上述本發明的可變區的堿基序列， 即上述(A-1)或者(A-1I)的核酸雜交，并且作為能夠用于對屬于絲衣霉屬的菌類進行特異性檢測的檢測用寡核苷酸而發揮功能的檢測用寡核苷酸。
[0130]為了進行對屬于籃狀菌屬的菌類的檢測、鑒定，可以利用與上述本發明的可變區的堿基序列，即上述(B-1)或者(B-1I)的核酸雜交，并且作為能夠用于對屬于籃狀菌屬的菌類進行特異性檢測的檢測用寡核苷酸而發揮功能的檢測用寡核苷酸。
[0131]為了進行對屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉的檢測、鑒定，可以利用與上述本發明的可變區的堿基序列，即上述(C-1)或者(C-1I)的核酸雜交，并且作為能夠用于對屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉進行特異性檢測的檢測用寡核苷酸而發揮功能的檢測用寡核苷酸。
[0132]為了進行對屬于半內果菌屬的菌類的檢測、鑒定，可以利用與上述本發明的可變區的堿基序列，即上述(D-1)或者(D-1I)的核酸雜交，并且作為能夠用于對屬于半內果菌屬的菌類進行特異性檢測的檢測用寡核苷酸而發揮功能的檢測用寡核苷酸。
[0133]本發明的檢測用寡核苷酸，只要是能夠用于上述耐熱菌類的檢測即可。即，可以是作為用于耐熱菌類檢測的核酸引物或者核酸探針來使用，或者也可以是在嚴格條件下可以和耐熱菌類的微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的可變區的堿基序列進行雜交的寡核苷酸。另外，這里，作為“嚴格條件”，例如可以列舉 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, Davidff.Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]所記載的方法,例如,在含有6XSSC(I XSSC 的組成:0.15M 氯化鈉，0.015M 檸檬酸鈉，pH7.0),0.5%SDS，5XDenhardt’ s 溶液以及100mg/ml鯡魚精DNA的溶液中與探針一起在65°C保溫8~16小時下進行雜交的條件。[0134]作為本發明上述的檢測用寡核苷酸，優選使用可以與以下區域進行雜交的寡核苷酸，該區域為上述本發明的微管蛋白基因或者28SrDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列中選出的區域，即上述(I)或者(II)的核酸中的區域，且滿足(I)含有上述耐熱菌類的各屬所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值(解鏈溫度:melting temperature)大約在55°C~65°C這4個條件。
[0135]更詳細地，在檢測屬于絲衣霉屬的菌類時，優選使用可以與以下區域進行雜交的寡核苷酸，該區域為上述(A-1)或者(A-1I)的核酸中的區域，且滿足(I)含有屬于絲衣霉屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65 °C這4個條件。
[0136]在檢測屬于籃狀菌屬的菌類時，優選使用可以與以下區域進行雜交的寡核苷酸，該區域為上述(B-1)或者(B-1I)的核酸中的區域，且滿足(I)含有屬于籃狀菌屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65°C這4個條件。
[0137]在檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉時，優選使用可以與以下區域進行雜交的寡核苷酸，該區域為上述(C-1)或者(C-1I)的核酸中的區域，且滿足(I)含有屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65°C這4個條件。
[0138]在檢測屬于半內果菌屬的菌類時，優選使用可以與以下區域進行雜交的寡核苷酸，該區域為上述(D-1)或者(D-1I)的核酸中的區域，且滿足(I)含有屬于半內果菌屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65 °C這4個條件。
[0139]上述(I)中的“含有上述耐熱菌類的各屬所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域”是指，即使在上述本發明的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區中，不同屬之間的堿基序列的保守性特別低(即，耐熱菌類的每個屬的特異性特別高)，10個堿基左右的耐熱菌類所固有的堿基序列連續出現的區域。具體地，“含有屬于絲衣霉屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域”是指，即使在上述本發明的β_微管蛋白基因的可變區中，不同屬之間的堿基序列的保守性特別低(即，屬于絲衣霉屬的菌類的特異性特別高)，10個堿基左右的屬于絲衣霉屬的菌類所固有的堿基序列連續出現的區域。另外，“含有屬于籃狀菌屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域”是指，即使在上述本發明的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區中，不同屬之間的堿基序列的保守性特別低(即，屬于籃狀菌屬的菌類的特異性特別高)，10個堿基左右的屬于籃狀菌屬的菌類所固有的堿基序列連續出現的區域。另外，“含有屬于新薩托菌屬的菌類或者煙曲霉所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域”是指，即使在上述本發明的β_微管蛋白基因的可變區中，不同屬之間的堿基序列的保守性特別低(即，屬于新薩托菌屬的菌類或者煙曲霉的特異性特別高)，10個堿基左右的屬于新薩托菌屬的菌類或者煙曲霉所固有的堿基序列連續出現的區域。另外，“含有屬于半內果菌屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域”是指，即使在上述本發明的β-微管蛋白基因的可變區中，不同屬之間的堿基序列的保守性特別低(即，屬于半內果菌屬的菌類的特異性特別高)，10個堿基左右的屬于半內果菌屬的菌類所固有的堿基序列連續出現的區域。
[0140]此外，上述(3)中的“寡核苷酸的自退火的可能性低”是指，從引物的堿基序列預測引物之間不會互相結合。
[0141]本發明的檢測用寡核苷酸的堿基數目，并沒有特別限定，但優選為13個堿基~30個堿基，更優選為18個堿基~23個堿基。雜交時的寡核苷酸的Tm值，優選為在55°C~65°C的范圍內，更優選為在59°C~62°C的范圍內。寡核苷酸的GC含量，優選為30%~80%，更優選為45%~65%。最優選為55%左右。
[0142]本發明的上述檢測用寡核苷酸，優選為含有序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有相對于序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上同源性的堿基序列的寡核苷酸，并能夠用于耐熱菌類的檢測(具有檢測用寡核苷酸的功能)。能夠用于耐熱菌類的檢測是指，作為和序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列具有70%以上同源性，并作為用于耐熱菌類的檢測的核酸引物或者核酸探針而能夠用于耐熱菌類的檢測的堿基序列，或者也可以是在嚴格條件下，可能與各耐熱菌類的β_微管蛋白基因或者28SrDNA的IT S區域以及D1/D2區域雜交的堿基序列。此外，這里“嚴格條件”是指，例如可以列舉 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, Davidff.Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]所記載的方法,例如,在含有6XSSC(I XSSC 的組成:0.15M 氯化鈉，0.015M 檸檬酸鈉，pH7.0),0.5%SDS，5 X Denhardt ’ s 溶液以及100mg/ml鯡魚精DNA的溶液中與探針一起在65°C下保溫8~16小時下進行雜交的條件。這樣的本發明的寡核苷酸，只要是如上所述的能夠用于耐熱菌類檢測的寡核苷酸，優選為同源性在75%以上，更優選為同源性在80%以上，更優選為同源性在85%以上，更優選為同源性在90%以上，特別優選為同源性在95%以上。此外，關于堿基序列的同源性，是由Lipman-Pearson法(Science, 227, 1435, 1985)等計算的。具體地，可以使用基因信息處理軟件Genetyx-Win (Software開發制)的同源解析(Search homology)程序,將參數Unitsize to compare (ktup)設定為2進行解析而算出來的。
[0143]另外，本發明的檢測用寡核苷酸，只要是能夠用于耐熱菌類檢測的，包括對含有序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸進行堿基缺失、插入或者置換的變異或修飾而成的寡核苷酸。另外，本發明的寡核苷酸可以是對序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列進行堿基的缺失、插入或者置換的變異或修飾而成的堿基序列所表示的寡核苷酸，也可以是作為用于耐熱菌類檢測的引物或者探針而能夠用于檢測耐熱菌類的寡核苷酸，或者是在嚴格條件下，可能與各耐熱菌類的β -微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域雜交的堿基序列所表示的寡核苷酸。另外，這里，“嚴格條件”是指，例如可以列舉 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRDEDITION[Joseph Sambrook, David ff.Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]所記載的方法，例如，可以列舉在含有6 X SSC (I XSSC的組成:0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0),0.5%SDS，5 XDenhardt’ s溶液以及100mg/ml鯡魚精DNA的溶液中與探針一起在65°C下保溫8~16小時下進行的雜交條件。作為如此經過堿基缺失、插入或者置換的變異或者修飾的寡核苷酸，包括在含有序列號從I到23或者36~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸中，經過I個或數個、優選為I到5個、更優選為I到4個、更優選為I到3個、更優選為I到2個、最優選為I個堿基的缺失、插入或者置換的變異或者修飾而成的寡核苷酸。另外，在序列號從I到23或者36~78中任一個所記載的堿基序列中，也可以添加適當的堿基序列。
[0144]在本發明中，在上述檢測用寡核苷酸中，優選為使用含有序列號從I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核 苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。更優選為使用含有序列號從I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0145]此外，在鑒定、檢測耐熱菌類中屬于絲衣霉屬的菌類時，上述的本發明的檢測用寡核苷酸中，優選為使用含有序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。更優選為使用含有序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0146]在鑒定、檢測屬于籃狀菌屬的菌類時，優選為使用含有序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。更優選為使用含有序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0147]在鑒定、檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉時，優選為使用含有序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。更優選為使用含有序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0148]在鑒定、檢測屬于半內果菌屬的菌類時，優選為使用含有序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。更優選為使用含有序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0149]如后所述，在本發明的檢測方法中，上述本發明的檢測用寡核苷酸可以作為核酸探針或者核酸引物而適當地使用。
[0150]上述的檢測用寡核苷酸的鍵合方式，不僅可以是天然核酸中存在的磷酸二酯鍵，還可以是例如磷酰胺鍵、硫代磷酸酯鍵等。
[0151]本發明中所用的寡核苷酸，可以用公認的方法合成。例如可以根據設計的序列進行化學合成，也可以從試劑制造商處購入。具體地，可以用寡核苷酸合成裝置合成。此外，可以使用在合成后用吸附柱、高相液相色譜、或者電泳法純化的產物。另外，對于含有一個或者數個堿基置換、缺失、插入或者添加的堿基序列的寡核苷酸，也可以用公認的方法合成。[0152]在本發明的檢測方法中，為了用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸對耐熱菌類進行鑒定，優選為標記和上述(A-1)~(D-1I)中任一個核酸在嚴格條件下雜交的檢測用寡核苷酸，將得到的檢測用寡核苷酸與從檢測對象物中提取的核酸在嚴謹的條件下雜交，測定經雜交的檢測用寡核苷酸的標記。
[0153]這種情況下，作為與上述(A-1)~(D-1I)中任一個核酸在嚴格條件下雜交的檢測用寡核苷酸，可以使用上述的本發明的檢測用寡核苷酸，優選范圍也同樣。其中，優選為含有序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性的堿基序列的寡核苷酸，并可以用于耐熱菌類檢測的，更優選為使用含有序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者與該堿基序列有70%以上的同源性并可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0154]此外，在耐熱菌類中，在鑒定、檢測屬于絲衣霉屬的菌類時，優選為使用含有序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，更優選為使用含有序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者與該堿基序列有70%以上的同源性并可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0155]在鑒定、檢測屬于籃狀菌屬的菌類時，優選為使用含有序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，更優選為使用含有序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者與該堿基序列有70%以上的同源性并可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號3~11或者57~78中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0156]在鑒定、檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉時，優選為使用含有序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，更優選為使用含有序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者與該堿基序列有70%以上的同源性并可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號12~15、22、23或者40~50中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0157]在鑒定、檢測屬于半內果菌屬的菌類時，優選為使用含有序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有與序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，更優選為使用含有序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者與該堿基序列有70%以上的同源性并可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸，最優選為使用含有序列號16~21或者51~56中任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸。
[0158]這些檢測用寡核苷酸可以作為核酸探針使用。核酸探針可以通過用標記物標記上述寡核苷酸而制備。上述標記物沒有特別的限定，可以使用放射性物質、酶、熒光物質、發光物質、抗原、半抗原、酶底物、不溶性載體等通常的標記物。標記方法，既可以是末端標記，也可以是在序列的途中標記，此外，也可以是在糖、磷酸基、堿基部分上的標記。上述核酸探針與耐熱菌類的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的可變區的一部分進行特異性雜交，因此可以迅速并簡便地檢測出被檢測體中的耐熱菌類。所涉及的標記的檢測方法，可以列舉例如在用放射性同位素對核酸探針進行標記時放射自顯影等，用熒光物質標記時用熒光顯微鏡等，用化學發光物質標記時使用感光膠卷解析或者使用CCD照相機的數碼解析等。
[0159]用通常的方 法將經過這樣標記化的本發明的檢測用寡核苷酸與從檢測對象物中提取的核酸在嚴格條件下雜交之后，可以通過測定經雜交的檢測用寡核苷酸的標記來檢測耐熱菌類。這里，作為嚴格條件，可以列舉上述的條件。此外，作為測定經過與核酸雜交的核酸探針的標記的方法，可以使用通常的方法(FISH法、點雜交(dot blot)法、DNA雜交(southern blot)法、RNA 雜交(northern blot)法等)。
[0160]另外，本發明中所用的檢測用寡核苷酸，可以和固相載體結合而作為捕捉探針使用。此時，可以通過聯合捕捉探針和標記核酸探針來進行夾心雜交(sandwich assay),也可以對目標核酸進行標記并捕捉。
[0161]舉一個本發明的檢測用寡核苷酸用于核酸探針時的檢測方法的例子。
[0162]例如在檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉時，可以標記下述(I)~(W)的寡核苷酸并作為核酸探針。如下所述的由下述(I)~(O)的寡核苷酸所組成的核酸探針與屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的β_微管蛋白基因的可變區的一部分特異性雜交，因此可以迅速且簡便地檢測出屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉。此外，由下述(V)以及/或者(w)的寡核苷酸組成的核酸探針，雖然可以與煙曲霉的β_微管蛋白基因的可變區的一部分特異性雜交，但是不能和屬于新薩托菌屬的菌類的DNA以及RNA雜交。因此，通過確認這些寡核苷酸是否進行雜交，就可以迅速且簡便地鑒別被檢測體的菌類是屬于新薩托菌屬的菌類還是煙曲霉。
[0163]在本發明的檢測方法中，為了使用含有上述本發明的可變區的堿基序列的核酸對耐熱菌類進行鑒定，其優選形式是對由上述(A-1)~(D-1I)中任一個核酸中的一部分或者全部區域組成的核酸進行基因擴增，確認是否存在擴增產物。此時，上述本發明的檢測用寡核苷酸，可以作為核酸引物以及核酸引物對使用，優選范圍也同樣。其中，優選為可以與下述區域進行雜交的寡核苷酸作為核酸引物使用，其中，該區域為上述(I)或者(II)的核酸中的區域，并且滿足(I)含有上述耐熱菌類的各屬所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值(解鏈溫度:melting temperature)大約在55°C~65°C這4個條件。進一步，優選為含有序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有相對于序列號I~23或者36~78中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性的堿基序列的寡核苷酸，并且能夠用于耐熱菌類檢測的作為核酸引物使用，更優選為含有序列號I~23或者36~78任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，最優選為含有序列號I~23或者36~78任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用。
[0164]更詳細地，在鑒定、檢測屬于絲衣霉屬的菌類時，優選為對由上述(A-1)或者(A-1I)的核酸中的一部分或者全部區域組成的核酸進行基因擴增，確認是否存在擴增產物。此時，優選為可以與下述區域進行雜交的寡核苷酸作為核酸引物使用，其中，該區域為上述(A-1)或者(A-1I)的核酸中的區域，并且滿足(I)含有屬于絲衣霉屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65°C這4個條件。其中，優選為含有序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有相對于序列號1、2或者36~39中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，更優選為含有序列號1、2或者36~39任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，最優選為含有序列號1、2或者36~39任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用。
[0165]在鑒定、檢測屬于籃狀菌屬的菌類時，優選為對由上述(B-1)或者(B-1I)的核酸中的一部分或者全部區域組成的核酸進行基因擴增，確認是否存在擴增產物。此時，優選為可以與下述區域進行雜交的寡核苷酸作為核酸引物，其中，該區域為上述(B-1)或者(B-1I)的核酸中的區域，并且滿足(I)含有屬于籃狀菌屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65°C這4個條件。其中，優選為含有序列號3~11或者57~78任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有相對于序列號3~11或者57~78任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，更優選為含有序列號3~11或者57~78任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸,或者相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，最優選為含有序列號3~11或者57~78任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用。
[0166]在鑒定、檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉時，優選為對由上述(C-1)或者(C-1I)的核酸中的一部分或者全部區域組成的核酸進行基因擴增，確認是否存在擴增產物。此時，優選為可以與下述區域進行雜交的寡核苷酸作為核酸引物使用，其中，該區域為上述(C-1)或者(C-1I)的核酸中的區域，并且滿足(I)含有屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65°C這4個條件。其中，優選為含有序列號12~15、22、23或者40~50任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有相對于序列號12~15、22、23或者40~50任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，更優選為含有序列號12~15、22,23或者40~50任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，最優選為含有序列號12~15、22、23或者40~50任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用。
[0167]在鑒定、檢測屬于半內果菌屬的菌類時，優選為對由上述(D-1)或者(D-1I)的核酸中的一部分或者全部區域組成的核酸進行基因擴增，確認是否存在擴增產物。此時，優選為可以與下述區域進行雜交的寡核苷酸作為核酸引物使用，其中，該區域為上述(D-1)或者(D-1I)的核酸中的區域，并且滿足(I)含有屬于半內果菌屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續出現的區域，(2)寡核苷酸的GC含量大約在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大約在55°C~65°C這4個條件。其中，優選為含有序列號16~21或者51~56任一個所記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，或者含有相對于序列號16~21或者51~56任一個所記載的堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，更優選為含有序列號16~21或者51~56任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用，最優選為含有序列號16~21或者51~56任一個所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物使用。
[0168]作為含有本發明的可變區的堿基序列的核酸的擴增方法，沒有特別限制，可以使用 PCR (Polymerase Chain Reaction)法、LCR (Ligase Chain Reaction)法、SDA (StrandDisplacement Amplification)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification)法、RCA (Rolling-circle amplification) 法、LAMP (Loop mediated isothermalamplification)法等通常的方法。但是，本發明中，從迅速性以及簡便性的觀點來看，優選使用如后所述的PCR法或者LAMP法。
[0169]本發明的核酸引物，既可以將上述的本發明的檢測用寡核苷酸直接作為核酸引物使用，也可以用標記物將上述寡核苷酸標記后作為核酸引物使用。標記物以及標記方法的例子，可以列舉與核酸探針時同樣的例子。
[0170]本發明的檢測方法中，上述(A-1)~(D-1I)中任一個核酸的擴增反應，優選為用聚合酶鏈反應(PCR)法進行。[0171]以下，對使用PCR法的本發明的檢測方法進行詳細的說明。
[0172]利用PCR法對屬于絲衣霉屬的菌類進行鑒定、檢測時，優選為使用下述(a)~(b)的寡核苷酸作為核酸引物，更優選為使用下述(al)~(bl)的寡核苷酸作為核酸引物，最優選為使用含有序列號I以及2所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物。此外，優選為使用下述(a)以及(b)的寡核苷酸作為核酸引物對，更優選為使用下述(al)以及(bl)的寡核苷酸作為核酸引物對，最優選為使用含有序列號I以及2所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物對。
[0173](a)含有序列號I所記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列有70%以上同源性且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0174](b)含有序列號2所記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列有70%以上同源性且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0175](al)含有序列號I所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列有70%以上同源性且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0176](bl)含有序列號2所記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列有70%以上同源性且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。[0177]上述(a)以及(b)的寡核苷酸是可以和屬于絲衣霉屬的菌類的β_微管蛋白基因的可變區特異地雜交的寡核苷酸。因此，通過使用上述的寡核苷酸，就可以特異地迅速且簡便地檢測出上述屬于絲衣霉屬的菌類。
[0178]序列號I以及序列號2所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸是與存在于β -微管蛋白基因區域并屬于絲衣霉屬的菌類的特異的堿基序列，即可變區的一部分互補的寡核苷酸。含有序列號I以及序列號2所記載的堿基序列的寡核苷酸，可以和屬于絲衣霉屬的菌類的DNA以及RNA的一部分進行特異地雜交。
[0179]以雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea)為例,對屬于絲衣霉屬的菌類的β_微管蛋白基因的可變區的進行詳細地說明。如上所述，Byssochlamys nivea的β_微管蛋白基因的部分堿基序列用序列號24表示。其中，本發明人發現，屬于絲衣霉屬的菌類的β_微管蛋白基因的部分堿基序列的從第20位到第175位的區域在真菌的屬之間，堿基序列的保守性特別低，是具有屬固有的堿基序列的區域。
[0180]上述(a)以及(b)的寡核苷酸是序列號24所記載的堿基序列中，分別對應于第33位到第52位、第159位到第178位的區域。因此，通過將上述寡核苷酸與屬于絲衣霉屬的菌類的β_微管蛋白基因進行雜交，就可以特異地檢測出屬于絲衣霉屬的菌類。
[0181]在利用PCR法進行屬于籃狀菌屬的菌類的鑒定、檢測時，優選為使用下述(C)~(k)中任一個寡核苷酸作為核酸引物，更優選為使用下述(Cl)~(kl)中任一個寡核苷酸作為核酸引物，最優選為使用含有序列號3~11所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物。此外，優選為使用下述(c)以及(d)的寡核苷酸對、下述(e)以及(f)的寡核苷酸對、下述(g)以及(h)的寡核苷酸對、下述(i)以及(h)的寡核苷酸對、或者下述(j)以及(k)的寡核苷酸對作為核酸引物對，更優選為使用下述(Cl)以及(dl)的寡核苷酸對、下述(el)以及(fl)的寡核苷酸對、下述(gl)以及(hi)的寡核苷酸對、下述(il)以及(hi)的寡核苷酸對、或者下述(jl)以及(kl)的寡核苷酸對作為核酸引物對，最優選為使用含有序列號3以及序列號4記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號5以及序列號6記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號7以及序列號8記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號9以及序列號8記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號10以及序列號11記載的堿基序列的寡核苷酸對作為核酸引物對。
[0182]此外，從檢測特異性以及檢測靈敏度的角度來看，優選為使用下述(i)以及(h)所示的寡核苷酸對、或者下述(j)以及(k)所示的寡核苷酸對作為核酸引物對，優選為使用下述(il)以及(hi)所示的寡核苷酸對、或者下述(jl)以及(kl)所示的寡核苷酸對作為核酸引物對，最優選為使用序列號9以及序列號8所記載的堿基序列表示的寡核苷酸對、或者序列號10以及序列號11所記載的堿基序列表示的寡核苷酸對作為核酸引物對。
[0183](c)含有序列號3中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0184](d)含有序列號4中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0185](e)含有序列號5中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0186](f)含有序列號6中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0187](g)含有序列號7中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0188](h)含有序列號8中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0189](i)含有序列號9中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0190](j)含有序列號10中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0191](k)含有序列號11中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0192](Cl)含有序列號3中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0193](dl)含有序列 號4中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；[0194](el)含有序列號5中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0195](fl)含有序列號6中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0196](gl)含有序列號7中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0197](hi)含有序列號8中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0198](il)含有序列號9中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0199]( jl)含有序列號10中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0200](kl)含有序列號11中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。
[0201]通過利用上述(C)以及(d)的寡核苷酸對，可以特異地檢測出黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)。此外，通過利用上述(e)以及(f)的寡核苷酸對或 者上述(j)以及(k)的寡核苷酸對，可以特異地檢測出藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus),沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),桿孢籃狀菌(Talaromyces bacillisporus)。另外，通過利用上述(g)以及(h)的寡核苷酸對，可以特異地檢測出黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),沃特曼籃狀菌(Talaromyceswortmannii)，糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)，大抱籃狀菌(Talaromycesmacrosporus)。另外，通過利用上述(i)以及(h)的寡核苷酸對,可以特異地檢測出黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus),大抱籃狀菌(Talaromyces macrosporus)。
[0202]上述(C)~(k)的寡核苷酸是與屬于籃狀菌屬的菌類的β_微管蛋白基因或者28SrDNA的D1/D2區域以及ITS區域的可變區特異性雜交的寡核苷酸。因此，通過利用上述寡核苷酸對，可以特異地迅速并且簡便地檢測出上述屬于籃狀菌屬的菌類。
[0203]序列號3以及序列號4所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸，是與存在于β -微管蛋白基因區域，屬于籃狀菌屬的菌類內的黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)特異的堿基序列，即可變區的一部分互補的寡核苷酸。序列號5~6以及序列號10~11所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸,是與存在于β_微管蛋白基因區域，屬于籃狀菌屬的菌類內的藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus),沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),桿抱籃狀菌(Talaromyces bacillisporus)特異的喊基序列，即可變區的一部分互補的寡核苷酸。序列號7~8以及序列號9所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸，是與存在于28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域，屬于籃狀菌屬的菌類內的黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),糙抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus),大抱籃狀菌(Talaromyces macrosporus)特異的堿基序列，即可變區的一部分互補的寡核苷酸。因此，含有序列號3~11中所記載的堿基序列的寡核苷酸，可以和屬于籃狀菌屬的菌類的DNA以及RNA的一部分特異性地雜交。[0204]對屬于籃狀菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的可變區域以黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)和藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)為例進行詳細說明。如上所述，黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的β _微管蛋白基因的部分堿基序列用序列號26表示,藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)的β _微管蛋白基因的部分堿基序列用序列號27表示。其中，本發明人發現,黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的部分堿基序列的可變區在從第10位到第40位的區域，以及從第70位到第100位的區域是與黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)有特別高的保守性的序列，與其他真菌沒有類似序列的區域。另外，本發明人發現，藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)的β _微管蛋白基因的部分堿基序列的可變區在從第120位到第160位的區域以及從第295位到第325位的區域是與在基因上近緣的藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus),沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),桿抱籃狀菌(Talaromyces bacillisporus)有特別高的保守性的序列，與其他真菌沒有類似序列的區域。
[0205]上述(C)以及(d)的寡核苷酸，在序列號26所記載的堿基序列中，分別對應于從第15位到第34位、從第76位到第98位的可變區。上述(e)以及(f)和上述(j)以及(k)的寡核苷酸，在序列號第27所記載的堿基序列中，分別對應于從第133位到第153位、從第304位到第325位的可變區。因此，通過將上述寡核苷酸與屬于籃狀菌屬的菌類的β_微管蛋白基因進行雜交，就可以檢測出屬于籃狀菌屬的菌類。
[0206]對屬于籃狀菌屬的菌類的28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的可變區域以沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)為例進行詳細說明。如上所述，沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii) 的28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的部分喊基序列用序列號28表示。其中，本發明人發現屬于籃狀菌屬的菌類的28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的部分堿基序列的從第300位到第350位，以及從第450位到第510位的區域是與沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)，糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)，黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),大孢籃狀菌(Talaromyces macrosporus)有特別高的保守性的序列，與其他真菌沒有類似序列的區域。
[0207]上述(g)、(h)以及(i)的寡核苷酸，在序列號28所記載的堿基序列中，分別對應于從第326位到第345位、從第460位到第478位的可變區。因此，通過將上述寡核苷酸與屬于籃狀菌屬的菌類的28SrDNA的D1/D2區域以及ITS區域雜交，就可以檢測出屬于籃狀菌屬的菌類。
[0208]在用PCR法對屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉進行鑒定、檢測時，優選為使用下述(I)~(O)以及(V)~(W)的寡核苷酸作為核酸引物，更優選為使用下述(11)~(ol)以及(vl)~(wl)的寡核苷酸作為核酸引物,最優選為使用含有序列號12~15以及22~23所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物。此外，優選為使用下述(I)以及(m)的寡核苷酸對、下述(η)以及(ο)的寡核苷酸對、或者下述(V)以及(w)的寡核苷酸對作為核酸引物對，更優選為使用下述(11)以及(ml)的寡核苷酸對、下述(nl)以及(ol)的寡核苷酸對、或者下述(vl)以及(《1)的寡核苷酸對作為核酸引物對，最優選為使用含有序列號12以及序列號13記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號14以及序列號15記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號22以及序列號23記載的堿基序列的寡核苷酸對作為核酸引物對。
[0209]其中，為了檢測出屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉，優選為利用下述(I)以及(m)的寡核苷酸對或者下述(η)以及(ο)的寡核苷酸對作為核酸引物對，更優選為利用下述(11)以及(ml)的寡核苷酸對或者下述(nl)以及(ol)的寡核苷酸對作為核酸引物對，最優選為利用含有序列號12以及序列號13記載的堿基序列的寡核苷酸對和含有序列號14以及序列號15記載的堿基序列的寡核苷酸對作為核酸引物對。特別是，在檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉時，從檢測特異性以及檢測靈敏度的角度來看，優選為使用下述的(η)以及(ο)所表示的寡核苷酸對為核酸引物對，更優選為使用下述的(nl)以及(ol)所表示的寡核苷酸對為核酸引物對，最優選為使用含有序列號14以及序列號15記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對為核酸引物對。 [0210]此外，為了檢測出煙曲霉，優選為使用下述的(V)以及(W)所表示的寡核苷酸對為核酸引物對，更優選為使用下述的(Vl)以及(《1)所表示的寡核苷酸對為核酸引物對，最優選為使用含有序列號22以及序列號23記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對為核酸引物對。
[0211](I)含有序列號12中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0212](m)含有序列號13中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0213](η)含有序列號14中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0214](ο)含有序列號15中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0215](V)含有序列號22中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0216](w)含有序列號23中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0217](11)含有序列號12中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0218](ml)含有序列號13中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0219](nl)含有序列號14中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0220](ol)含有序列號15中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0221](Vl)含有序列號22中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0222](Wl)含有序列號23中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。
[0223]上述(I)以及(m)的寡核苷酸對和上述(η)以及(O)的寡核苷酸對，特別適用于檢測費希爾新薩托菌(Neosartorya f ischeri),刺孢新薩托菌(Neosartorya spinosa),光滑新薩托菌(Neosartorya glabra),平塚新薩托菌(Neosartorya hiratsukae) ,Neosartoryapaulistensis,假費希爾新薩托菌(Neosartorya peudofischeri)等屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉。此外，上述(V)以及(W)的寡核苷酸對，適用于檢測煙曲霉。
[0224]上述(I)~(O)的寡核苷酸是與屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的β_微管蛋白基因的可變區特異地雜交的寡核苷酸。因此，通過利用上述(I)~(O)的寡核苷酸，就可以特異地迅速并且簡便地檢測出上述屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉。
[0225]序列號12~15記載的堿基序列所表示的寡核苷酸，是與存在于β -微管蛋白基因區域，費希爾新薩托菌(Neosartorya fischeri),刺抱新薩托菌(Neosartorya spinosa),光滑新薩托菌(Neosartorya glabra),平塚新薩托菌(Neosartorya hiratsukae),Neosartorya paulistensis,假費希爾新薩托菌(Neosartorya peudof ischeri)等屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的特異性堿基序列，即可變區的一部分互補的寡核苷酸。這些寡核苷酸，可以和屬于 新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的DNA以及RNA的一部分進行特定地雜父。
[0226]對屬于新薩托菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的可變區域以光滑新薩托菌(Neosartorya glabra)為例進行詳細說明。如上所述，光滑新薩托菌(Neosartoryaglabra)的β _微管蛋白基因的部分堿基序列用序列號32表示。其中，本發明人發現，屬于新薩托菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的部分堿基序列的從第I位到第110位的區域、從第140位到第210位的區域、以及從第350位到第380位的區域在真菌之間堿基序列的保守性特別低，具有取決于屬間所固有的堿基序列。此外，煙曲霉的β_微管蛋白基因的部分堿基序列用序列號33表示。其中，本發明人發現，煙曲霉的β_微管蛋白基因的部分堿基序列的從第I位到第110位的區域、從第140位到第210位的區域、以及從第350位到第380位的區域在真菌之間喊基序列的保守性特別低，具有取決于種間固有的喊基序列。
[0227]上述(I)以及(m)的寡核苷酸，在序列號32記載的堿基序列中，分別對應于從第84位到第103位、從第169位到第188位的區域，在序列號33記載的堿基序列中，分別對應于從第83位到第102位、從第166位到第186位的區域。上述(η)以及(ο)的寡核苷酸，在序列號32記載的堿基序列中，分別對應于從第144位到第163位、從第358位到第377位的區域，在序列號33記載的堿基序列中，分別對應于從第141位到第160位、從第356位到第376位的區域。因此，通過將上述寡核苷酸與屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的β_微管蛋白基因雜交，就可以特異地檢測出屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉。
[0228]上述(V)以及(W)的寡核苷酸是與煙曲霉的微管蛋白基因的可變區特異地雜交的寡核苷酸。
[0229]序列號22以及序列號23記載的堿基序列所表示的寡核苷酸，是與存在于β -微管蛋白基因區域，煙曲霉的特異的堿基序列，即可變區的一部分互補的寡核苷酸。因此，含有序列號22~23記載的堿基序列的寡核苷酸，可以和煙曲霉的DNA以及RNA的一部分進行特定的雜交，但是不能和屬于新薩托菌屬的菌類的DNA以及RNA進行雜交。
[0230]對于煙曲霉的β -微管蛋白基因的其他的可變區進行說明。本發明人發現序列號33中記載的煙曲霉的β_微管蛋白基因的部分堿基序列的從第20位到第50位的區域、以及從第200位到第230位的區域在真菌，特別是屬于新薩托菌屬的菌類之間的堿基序列的保守性很低。
[0231]上述(V)以及(W)的寡核苷酸，在序列號33記載的堿基序列中，分別與從第23位到第44位、從第200位到第222位的區域對應。上述寡核苷酸可以和煙曲霉的β-微管蛋白基因進行雜交，但是不能和屬于新薩托菌屬的菌類的DNA以及RNA雜交。基于圖1對此進行詳細說明。圖1是序列號33以及83~86所記載的煙曲霉，費希爾新薩托菌(Neosartoryafischeri)以及刺孢新薩托菌(Neosartorya spinosa)的β _微管蛋白基因的堿基序列的一部分的比較圖。如圖1所示，將煙曲霉的β_微管蛋白基因中序列號22以及23的寡核苷酸所識別的區域，和此區域相對應的屬于新薩托菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的區域進行比較，就可以明白堿基序列的同源性與其他區域相比非常低。因此，通過利用上述(V)以及(w)的寡核苷酸，就可以識別被檢測體中含有的菌類是屬于新薩托菌屬的菌類還是煙曲霉。[0232]例如，將上述(I)以及(m)的寡核苷酸對或者上述(η)以及(O)的寡核苷酸對作為核酸引物使用進行核酸擴增處理，通過確認擴增，就可以檢測出屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉。為了檢測出食品事故中特別造成問題的屬于新薩托菌屬的菌類，對通過利用上述方法檢測出這些菌的試樣，再將上述(V)以及(W)的寡核苷酸對用作核酸引物進行核酸擴增處理，通過確認擴增，就可以檢測出是屬于新薩托菌屬的菌類還是煙曲霉。
[0233]此外，在本發明中，在用上述(I)~(O)的寡核苷酸的檢測方法呈陽性反應的試樣中，可以通過利用屬于新薩托菌屬的菌類和煙曲霉的可以生長溫度帶的不同，或者通過利用上述(V)以及/或者(W)的寡核苷酸，對該試樣中含有的菌種進行識別、檢測。
[0234]屬于新薩托菌屬的菌類的可以生長溫度的上限約為45°C。相對于此，煙曲霉在50°C以上也可以生長。利用可以生長溫度帶的不同，例如通過進行以下的操作就可以進行菌種檢測。但是，本發明并不限定于此。
[0235]對于用本發明的上述(I)~(O)的寡核苷酸的檢測方法呈陽性反應的試樣，從單菌落將菌絲體接種到PDA培養基或者PDB培養基(馬鈴薯葡萄糖液體培養基)，在48~52°C進行培養。培養I~2天后，確認菌絲體的伸長。接著，根據上述可以生長溫度帶的不同，被確認為增殖的情況可以鑒定為煙曲霉，不能被確認增殖的情況可以鑒定為屬于新薩托菌屬的菌類。此外，增殖的確認方法并沒有特別限制，可以列舉通過實體顯微鏡確認菌絲體的伸長、液體培養基中菌絲體的伸長、菌塊的形成、分生孢子的形成。
[0236]在利用PCR法進行屬于半內果菌屬的菌類的鑒定、檢測時，優選為使用下述(P)~(U)的寡核苷酸作為核酸引物，更優選為使用下述(pi)~(ul)的寡核苷酸作為核酸引物，最優選為使用含有序列號16~21所記載的堿基序列的寡核苷酸作為核酸引物。此外，優選為使用下述(P)以及(q)的寡核苷酸對、下述(r)以及(S)的寡核苷酸對、或者下述(t)以及U)的寡核苷酸對作為核酸引物對，更優選為使用下述(pi)以及(ql)的寡核苷酸對、下述(rl)以及(Si)的寡核苷酸對、或者下述(tl)以及(ul)的寡核苷酸對作為核酸引物對，最優選為使用含有序列號16以及序列號17記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號18以及序列號19記載的堿基序列的寡核苷酸對、含有序列號20以及序列號21記載的堿基序列的寡核苷酸對作為核酸引物對。
[0237]特別地，從檢測特異性的角度來看，優選為使用下述的(r)以及(S)所表示的寡核苷酸對、或者下述的(t)以及(U)所表示的寡核苷酸對作為核酸引物對，更優選為使用下述的(rl)以及(Si)所表示的寡核苷酸對、或者下述的(tl)以及(ul)所表示的寡核苷酸對作為核酸引物對，最優選為使用序列號18以及序列號19記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對、或者序列號20以及序列號21記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對為核酸引物對。從檢測靈敏度的角度來看，優選為使用下述的(t)以及(U)所表示的寡核苷酸對作為核酸引物對，更優選為使用下述的(tl)以及(ul)所表示的寡核苷酸對作為核酸引物對，最優選為使用序列號20以及序列號21記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對為核酸引物對。
[0238](P)含有序列號16中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0239](q)含有序列號17中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0240](r)含有序列號18中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0241](s)含有序列號19中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0242](t)含有序列號20中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0243](u)含有序列號21中記載的堿基序列或者其互補序列，或者與該堿基序列或者其互補序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0244](pi)含有序列號16中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0245](ql)含有序列號17中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0246](rl)含有序列號18中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0247](Si)含有序列號19中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0248](tl)含有序列 號20中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸；
[0249](Ul)含有序列號21中記載的堿基序列的寡核苷酸，或者含有與該堿基序列具有70%以上的同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列的寡核苷酸。
[0250]通過使用上述(P)以及(q)所表示的寡核苷酸對、上述(r)以及(S)所表示的寡核苷酸對、以及上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸對，就可以特異地檢測出榛色鉤囊菌(Hamigera avel Ianea)，條紋鉤囊菌(Hamigera striata)。
[0251]上述(P)~(U)的寡核苷酸，是與屬于半內果菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的可變區進行特異性雜交的寡核苷酸。因此，通過使用上述的寡核苷酸，就可以特異地迅速并且簡便地檢測出上述屬于半內果菌屬的菌類。
[0252]序列號16~21記載的堿基序列所表示的寡核苷酸，是與存在于β -微管蛋白基因區域，屬于半內果菌屬的菌類內的特異的堿基序列，即可變區的一部分互補的寡核苷酸。因此，含有序列號16~21所記載的堿基序列的寡核苷酸，可以與屬于半內果菌屬的菌類的DNA以及RNA的一部分進行特異性雜交。
[0253]以屬于半內果菌屬的菌類的β -微管蛋白基因的可變區的榛色鉤囊菌(HamigeraavelIanea)為例進行詳細地說明。如上所述榛色鉤囊菌(Hamigera avelIanea)的β-微管蛋白基因的部分堿基序列用序列號35表示。其中，本發明人發現，屬于半內果菌屬的菌類的β -微管蛋白基因的部分堿基序列的從第350位到第480位的區域、從第I位到第25位的區域、以及從第180位 到第200位的區域，在真菌的屬之間堿基序列的保守性特別低，具有取決于屬間固有的喊基序列。
[0254]上述(P)以及(q)的寡核苷酸，在序列號35所記載的堿基序列中，分別對應于從第358位到第377位、從第440位到第459位的區域。上述(r)以及(s)的寡核苷酸，在序列號35所記載的堿基序列中，分別對應于從第2位到第22位、從第181位到第200位的區域。另外，上述(t)以及(U)的寡核苷酸，在序列號35所記載的堿基序列中，分別對應于從第172位到第191位、從第397位到第416位的區域。因此，通過將上述的寡核苷酸與屬于半內果菌屬的菌類的β_微管蛋白基因進行雜交，就可以特異地檢測出屬于半內果菌屬的菌類。
[0255]此外，如圖2所示,與榛色鉤囊菌(Hamigera avel Ianea)的β_微管蛋白基因的從第358位到第377位以及從第440位到第459位的區域同源性高的區域在芽枝狀枝孢(Cladosporium cladosporioides)等的屬于枝抱霉(Cladosporium)屬的菌類的 β -微管蛋白基因中也存在。但是，與榛色鉤囊菌(Hamigera avelIanea)的β_微管蛋白基因的從第181位到第200位的區域同源性高的區域在屬于枝孢霉屬的菌的β_微管蛋白基因中不存在。因此，通過使用上述(P)~(U)的寡核苷酸的組合，就可以檢測出屬于半內果菌屬的菌類和屬于枝孢霉屬的菌類。
[0256]即，上述(s)、(t)、以及(U)的寡核苷酸，可以和屬于半內果菌屬的菌類的微管蛋白基因的可變區雜交，但是不能和屬于枝孢霉屬的菌類的β_微管蛋白基因的可變區雜交。因此，例如在用上述(P)以及(q)的寡核苷酸的檢測方法中呈陽性反應的試樣，通過利用上述(r)以及(S)的寡核苷酸以及/或者上述(t)以及(U)的寡核苷酸就可以鑒別該試樣中所含的菌種是屬于半內果菌屬還是屬于枝孢霉屬。
[0257]此外，“屬于枝孢霉屬的菌類”是絲狀半知菌類，不形成耐熱性高的子囊孢子。而且，廣泛分布于居住環境或者食品加工廠等地，由于合成黑色素，是黑色污染的原因菌。屬于枝孢霉屬的菌類的例子，可以列舉芽枝狀枝孢(Cladosporium cladosporioides),球孢枝抱(Cladosporium sphaerospermum)。
[0258]PCR反應的條件，只要能夠將目標DNA片段擴增至能夠檢出的程度，就沒有特別的限制。作為PCR的反應條件的優選的一個例子，在檢測屬于絲衣霉屬的菌類時，例如，使雙鏈DNA變成單鏈DNA的熱變性反應在95~98°C進行10~60秒，引物對與單鏈DNA雜交的退火反應在59~61°C進行約60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反應在約72°C進行約60秒，這些構成的一個循環進行約30~35次。在檢測屬于籃狀菌屬的菌類時，使雙鏈DNA變成單鏈DNA的熱變性反應在95~97°C進行10~60秒，引物對與單鏈DNA雜交的退火反應在55~61°C進行約60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反應在約72°C進行約60秒，這些構成的一個循環進行約30~35次。在用上述的(I)以及(m)的寡核苷酸或者上述的(η)以及(ο)的寡核苷酸對屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉進行檢測時，例如，使雙鏈DNA變成單鏈DNA的熱變性反應在95~98°C進行10~60秒，引物對與單鏈DNA雜交的退火反應在59~61°C進行約60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反應在約72°C進行約60秒，這些構成的一個循環進行約30~35次。在用上述的(V)以及(w)的寡核苷酸對檢測是屬于新薩托菌屬的菌類還是煙曲霉時，使雙鏈DNA變成單鏈DNA的熱變性反應在95~98°C進行10~60秒，引物對與單鏈DNA雜交的退火反應在59~61°C進行約60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反應在約72°C進行約60秒，這些構成的一個循環進行約30~35次。在用上述的(P)以及(q)的寡核苷酸對屬于半內果菌屬的菌類進行檢測時，例如，使雙鏈DNA變成單鏈DNA的熱變性反應在95~98°C進行10~60秒，引物對與單鏈DNA雜交的退火反應在59~63°C進行約60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反應在約72°C進行約60秒，這些構成的一個循環進行約30~35次。在用上述的(r)以及(s)的寡核苷酸或者上述的(t)以及(U)的寡核苷酸對屬于半內果菌屬的菌類進行檢測時，例如，使雙鏈DNA變成單鏈DNA的熱變性反應在95~98°C進行10~60秒，引物對與單鏈DNA雜交的退火反應在59~63°C進行約60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反應在約72°C進行約60秒，這些構成的一個循環進行約30~35次。
[0259]在本發明中，基因片段的擴增的確認可以用通常的方法進行。例如可以列舉在基因擴增反應時將結合有放射性物質等標記的核苷酸加入的方法，將PCR反應產物進行電泳以確認是否具有與經擴增的基因產物的大小相對應的條帶的方法，解讀PCR反應產物的堿基序列的方法，在經擴增的DNA雙鏈之間加入熒光物質使其發光的方法等，但本發明并不限定于這些方法。在本發明中，優選為基因擴增處理后進行電泳，以確認是否具有與經擴增的基因的大小相對應的條帶的方法。
[0260]序列號24所記載的堿基序列中，從第33位到第178位的堿基數為146個堿基。因此，在被檢測體中含有屬于絲衣霉屬的菌類時，用上述(a)以及(b)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出屬于絲衣霉屬的菌類的特異的約150bp的DNA片段的擴增。通過此操作，就可以檢測、鑒別屬于絲衣霉屬的菌類。
[0261]序列號26所記載的堿基序列中，從第15位到第98位的堿基數是83個堿基，序列號27所記載的堿基序列中從第133位到第325位的堿基數是192個堿基。此外，序列號28所記載的堿基序列中，從第326位到第478位的堿基數是152個堿基。因此，在被檢測體中含有屬于黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及/或者糙孢籃狀菌(Talaromycestrachyspermus)時,用上述(C)以及(d)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應,將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約SObp的DNA片段的擴增。另外，在被檢測體中含有藤黃籃狀菌(Talaromyces Iuteus),沃特曼籃狀菌(Talaromyceswortmannii)以及/或者桿孢籃狀菌(Talaromyces baciIIisporus)時，用上述(e)以及CO的寡核苷酸對或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約200bp的DNA片段的擴增。此外，在被檢測體中含有大孢籃狀菌(Talaromyces macrosporus),沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及 / 或者糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)時,用上述(g)以及(h)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約150bp的DNA片段的擴增。在被檢測體中含有大孢籃狀菌(Talaromyces macrosporus),黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及 / 或者糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)時，用上述(i )以及(h)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約150bp的DNA片段的擴增。通過此操作，就可以檢測、鑒別屬于籃狀菌屬的菌類。此外，在被檢測體中含有沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)時，同時用上述(e)以及(f)的寡核苷酸對或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸對，以及上述(g)以及(h)的寡核苷酸對，就可以確認出約200bp和約150bp的2條條帶。
[0262]被檢測體中含有屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉時，用上述(I)以及(m)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約IOObp的DNA片段的擴增。另外，用上述(η )以及(ο)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約200bp的DNA片段的擴增。通過此操作，就可以檢測、鑒別屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉。
[0263]另外，被檢測體中含有煙曲霉時，用上述(V)以及(W)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約200bp的DNA片段的擴增。但是，在含有屬于新薩托菌屬的菌類時，即使用上述(V)以及(w)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，也確認不了 DNA片段的擴增。因此，利用上述(V)以及(w)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，就可以唯一地檢測出煙曲霉。
[0264]有關基因擴增的確認，在用上述(P)以及(q)所表示的寡核苷酸對時，在序列號35所記載的堿基序列中，從第358位到第459位的堿基數是約100個堿基。因此，被檢測體中含有屬于半內果菌屬的菌類時，用上述(P)以及(q)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出這些菌類的特異的約IOObp的DNA片段的擴增。
[0265]在序列號35所記載的堿基序列中，從第2位到第200位的堿基數是約200個堿基。此外，用上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸對時，在序列號35所記載的堿基序列中，從第172位到第416位的堿基數是245個堿基。因此，在被檢測體中含有屬于半內果菌屬的菌類時，用上述(r)以及(s)的寡核苷酸對或者上述(t)以及(U)的寡核苷酸對作為引物組合進行PCR反應，將得到的PCR反應產物進行電泳，就可以確認出此菌類的特異的約200bp或者約240bp的DNA片段的擴增。通過此操作，就可以檢測、鑒別屬于半內果菌屬的菌類。
[0266]在本發明的檢測方法中，優選形式為同時使用:利用上述(c)以及(d)的寡核苷酸對、上述(g)以及(h)的寡核苷酸對、或者上述(i)以及(h)的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(e)以及(f)的寡核苷酸對或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸對的檢測方法，來進行屬于籃狀菌屬的菌類的檢測。通過組合使用多個寡核苷酸對，可以全面的檢測出屬于籃狀菌屬的菌類。其中，更優選為組合使用:利用上述(Cl)以及(dl)的寡核苷酸對、上述(gl)以及(hi)的寡核苷酸對、或者上述(il)以及(hi)的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(el)以及(fl)的寡核苷酸對或者上述(jl)以及(kl)的寡核苷酸對的檢測方法。最優選為組合使用:利用序列號3以及4記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對、序列號7以及8記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對、或者序列號9以及8記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和序列號5以及6記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對、或者序列號10以及11記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法。
[0267]具體地，如上所述通過利用(C)以及(d)的寡核苷酸對，就可以特異地檢測出黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)。另外，通過利用(e)以及(f)、或者(j)以及(k)的寡核苷酸對，就可以特異地檢測出沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),藤黃籃狀菌(Talaromyces Iuteus),桿孢籃狀菌(Talaromyces bacillisporus)。此外,通過利用(g)以及(h)的寡核苷酸對,就可以特異地檢測出黃色籃狀菌(Talaromyces flavus),糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus),沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)，大抱籃狀菌(Talaromyces macrosporus)。另外，通過利用(i)以及(h)的寡核苷酸對,就可以特異地檢測出黃色籃狀菌(Talaromycesflavus),糖抱籃狀 菌(Talaromyces trachyspermus),大抱籃狀菌(Talaromycesmacrosporus)。因此,通過組合使用:上述(c)以及(d)的寡核苷酸對、上述(g)以及(h)的寡核苷酸對、或者上述(i)以及(h)的寡核苷酸對；和上述(e)以及(f)的寡核苷酸對或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸，就可以全面檢測出食品事故中特別引起問題的屬于籃狀菌屬的菌類。
[0268]特別是，從檢測靈敏度的角度，優選為組合使用:利用上述(i)以及(h)的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(j)以及(k)的寡核苷酸對的檢測方法，更優選為組合使用:利用上述(il)以及(hi)的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(jl)以及(kl)的寡核苷酸對的檢測方法，最優選為組合使用:利用序列號9以及8記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和利用序列號10以及11記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法。
[0269]另外，在本發明中，“同時使用進行基因擴增處理工序”是指，將2組寡核苷酸對混合，混合后作為引物添加到I個反應體系中進行上述的基因擴增處理工序。通過同時使用2組寡核苷酸對，可以更加迅速并且全面的檢測出屬于籃狀菌屬的菌類。2組寡核苷酸對的混合比例沒有特別限定，優選為1:1~1:2。
[0270]在本發明的檢測方法中，組合使用:利用上述(I)以及(m)所表示的寡核苷酸對以及/或者上述(η)以及(O)所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(V)以及(W)所表示的寡核苷酸對的檢測方法也是一種優選形式。如上所述，由于利用上述(I)以及(m)所表示的寡核苷酸對、上述(η)以及(ο)所表示的寡核苷酸對的檢測方法可以檢測出屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉，利用上述(V)以及(w)所表示的寡核苷酸對的檢測方法可以檢測出煙曲霉，通過組合這些方法就可以鑒別出從被檢測體中檢測的菌類是屬于新薩托菌屬的菌類還是煙曲霉。其中，更優選為組合使用:利用上述(11)以及(ml)所表示的寡核苷酸對以及/或者上述(nl)以及(ol)所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和上述(Vl)以及(wl)所表示的寡核苷酸對的檢測方法，最優選為組合使用:利用序列號12以及13記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對以及/或者序列號14以及15記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和序列號22以及23記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法。
[0271]特別是，從檢測靈敏度的角度，優選為組合使用:利用上述(η)以及(O)的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(V)以及(W)的寡核苷酸對的檢測方法，更優選為組合使用:利用上述(nl)以及(ol)的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(Vl)以及(wl)的寡核苷酸對的檢測方法，最優選為組合使用:利用序列號14以及15記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和利用序列號22以及23記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法。
[0272]在本發明的檢測方法中，組合使用:利用上述(P)以及(q)所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(r)以及(s)所表示的寡核苷酸對或者利用上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸對的檢測方法也是一種優選形式。通過這些方法的組合可以從被檢測體中特異地檢測出僅屬于半內果菌屬的菌類。即，通過組合這些方法就可以鑒別出從被檢測體中檢測的菌類是屬于半內果菌屬還是屬于枝孢霉屬。由于屬于半內果菌屬的菌類不產生真菌毒素(霉菌毒素)，根據檢測出屬于兩個屬中的哪個就可能預測真菌毒素的危險性。此外，兩個屬的耐熱性不同，通過檢測出屬的不同，可以預測出菌體的混入是否在加熱前，從而就可以用于進行重新進行滅菌工序或者確認容器的密封性等的原因調查。其中，更優選為組合使用:利用上述(Pl)以及(ql)的寡核苷酸對的檢測方法；和利用上述(rl)以及(Si)的寡核苷酸對或者上述(tl)以及(ul)所表示的寡核苷酸對的檢測方法，最優選為組合使用:利用序列號16以及17記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法；和利用序列號18以及19記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對或者序列號20以及其21記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法。
[0273]特別是，從檢測靈敏度的角度，優選為組合使用:利用上述(P)以及(q)的寡核苷酸對的檢測方法；與利用上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸對的檢測方法，更優選為組合使用:利用上述(Pl)以及(ql)的寡核苷酸對的檢測方法與利用上述(tl)以及(Ul)所表示的寡核苷酸對的檢測方法，最優選為組合使用:利用序列號16以及17記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法；與利用序列號20以及21記載的堿基序列所表示的寡核苷酸對的檢測方法。
[0274]此外，在本發明的檢測方法中，上述(A-1)~(D-1I)中任一個核酸的一部分或者全部的擴增用LAMP (Loop mediated isothermal amplification)法進行也是一種優選形式。
[0275]使用LAMP法，由于不需要周期的溫度變化控制，可以在恒溫下進行互補鏈合成反應。因此，有簡便且迅速檢測出檢測體中所含有的特定菌類的優點。
[0276]以下，對于使用LAMP法的本發明的檢測方法進行詳細說明。
[0277]LAMP法是不需要周期溫度變化控制的環介導等溫擴增法(國際公開第00/28082號小冊子)，使引物的3’端在作為模板的核苷酸處退火，成為互補鏈合成的起點，同時將退火的引物與此時形成的環組合，從而就可能在等溫下進行互補鏈合成反應。在該LAMP法中，至少需要4個識別作為模板的核酸的6個堿基序列區域的引物。這些引物，由于通常被設計成其3’端在作為模板的核酸處退火，通過堿基序列的互補結合而使得校正機理反復起作用，從而可以進行高靈敏度且高特異性的核酸擴增反應。
[0278]LAMP法所用的引物識別的6個堿基序列區域，從作為模板的核苷酸的5’端順次叫做F3、F2、F1，從3’端順次叫做B3c、B2c、Blc，此外，F1、F2、F3的互補堿基序列分別叫做Flc, F2c、F3c，Blc、B2c、B3c的互補堿基序列分別叫做B1、B2、B3。
[0279]上述6個堿基序列區域，具體而言，可以用以下方法選擇，但是本發明并不限于此。
[0280]首先，用作為檢測對象的菌種的堿基序列進行比對(alignment)。為了比對，例如，可以使用Clustal X等的軟件。接著，基于得到的比對信息，用Primer Explorer V4(榮研化學株式會社社制)等軟件選擇上述6個堿基序列區域，設計LAMP法的引物。[0281]LAMP法所用的引物設計，首先，從要擴增的區域(目的區域)的堿基序列中選定上述6個堿基序列區域，之后，設計下述的內引物F以及B和外引物F以及B。
[0282]LAMP法所用的“內引物”是指，識別目的堿基序列上特定核苷酸序列區域，且在3’端具有提供合成起點的堿基序列，同時在5’端具有相對于以此引物為起點的核酸合成反應產物的任意區域互補的堿基序列的寡核苷酸。其中，含有在3’端具有上述F2區域并且在5’端具有上述Flc區域的喊基序列的引物叫做內引物F (以下，叫做FIP),含有在3’端具有上述B2區域并且在5’端具有上述Blc區域的堿基序列的引物叫做內引物B (以下，叫做BIP)。此內引物，在F2區域和Flc區域之間，或者在B2區域和Blc區域之間，也可以含有堿基數O~50的任一長度的任意堿基序列。
[0283]另一方面“外引物”是指，具有識別目的堿基序列上的【“某個特定核苷酸序列區域”(例如上述F2區域或者B2區域)的5’末端存在的某個特定的核苷酸堿基序列】且提供合成起點的堿基序列的寡核苷酸，可以列舉含有從F3區域選出的堿基序列的引物以及含有從B3區域選出的堿基序列的引物。此處，含有從F3區域選出的堿基序列的引物叫做外引物F (以下，叫做F3引物)，含有從B3區域選出的堿基序列的引物叫做外引物B (以下，叫做B3引物)。
[0284]這里，各個引物中的F是表示，與目標堿基序列的反義鏈互補結合，并提供合成起點的引物的意思，各個引物中的B是表示，與目標堿基序列的正義鏈互補結合，并提供合成起點的引物的意思。
[0285]LAMP法中的核酸的擴增，優選為除內引物以及外引物之外，還可以使用環狀引物(loop primer)(以下，稱為LF，LB)。環狀引物是指，在用LAMP法擴增的產物的同一條鏈上的互補序列互相退火形成環狀時，在其3’端含有與這個環內的序列互補的堿基序列的引物(關于構成雙鏈的各條鏈的每一個)。即，具有與啞鈴結構的5’端的環狀結構的單鏈部分的堿基序列互補的堿基序列的引物。用此引物，由于增加了核酸合成的起點，就可以縮短反應時間和提高檢測靈敏度(國際公開第02/24902號小冊子)。
[0286]環狀引物的堿基序列，與上述啞鈴結構的5’端的環狀結構的單鏈部分的堿基序列互補的話，可以從目的區域的堿基序列或者其互補鏈中選擇，也可以從其他堿基序列中選擇。此外，環狀引物可以是I種，也可以是2種。[0287]如果利用上述至少4種以上的引物，擴增目的區域的DNA片段的話，就可能特異地且高效地擴增該DNA片段至可能檢測出的量。因此，通過確認擴增產物的有無，就可以檢測出特定的菌種。
[0288]在通過用LAMP法的本發明的檢測方法來檢測耐熱菌類時，作為檢測用寡核苷酸，在從耐熱菌類的β -微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區的堿基序列所選出的目的區域的5’端，作為堿基序列區域選擇F3、F2以及F1，從上述目的區域的3’端，作為堿基序列區域選擇B3c、B2c以及Blc，并且將上述B3c、B2c以及Blc的互補堿基序列分別作為B3、B2以及BI，將上述F3、F2以及Fl的互補堿基序列分別作為F3c、F2c以及Flc時，優選為由與下述(i)~(vi)中任一個相當的堿基序列所組成的寡核苷酸。
[0289](i)3’端有上述B2區域，5’端有上述Blc區域的堿基序列；
[0290](ii)含有上述B3區域的喊基序列；
[0291](iii)3’端有上述F2區域，5’端有上述Flc區域的堿基序列；
[0292]( iv)含有上述F3區域的喊基序列；
[0293](V)具有與上述BI區域和上述B2區域之間的部分互補的序列的堿基序列；
[0294](Vi)具有與上述Fl區域和上述F2區域之間的部分互補的序列的堿基序列。
[0295]上述寡核苷酸，不僅可以作為LAMP法所用的引物，而且還可以作為PCR法的引物、核酸檢測用探 針等使用。
[0296]本發明可以使用的引物優選為15堿基以上，更優選為20個堿基以上。此外，各引物可以是單一的堿基序列的寡核苷酸，也可以是多個堿基序列的寡核苷酸的混合物。
[0297]本發明中，在用LAMP法檢測耐熱菌類時，上述的耐熱菌類的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2區域以及ITS區域的可變區，即將上述(A-1)~(D-1I)中任一個核酸的一部分或者全部作為目的區域，擴增含有該需要的DNA片段，然后確認擴增產物的有無。
[0298]通過LAMP法擴增的區域，優選為含有序列號25記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第400~600位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號32記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第10~250位以及/或者第350~559位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號34記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第10~250位以及/或者第350~559位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號35記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第300~550位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號26記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第200~450位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號29記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第150~420位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號27記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第150~450位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號30記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第250~550位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，含有序列號31記載的堿基序列的一部分也就是含有該堿基序列的第250~550位的堿基序列的全部或者一部分的堿基序列，或者含有在這些堿基序列中使一個或者數個堿基缺失、置換或者添加而得到而成的堿基序列。
[0299]接著，對用LAMP法檢測上述各個耐熱菌類時優選使用的引物以及引物組合進行說明。[0300]為了設計特異檢測屬于絲衣霉屬的菌類的引物，優選為在序列號25記載的堿基序列之中，從序列表的堿基號400~600所包含的范圍中選定上述6個堿基序列區域。具體地，優選為使用由含有序列號36記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號37記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號38記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號39記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及含有這些引物的引物組合，更優選為使用以下的引物組合。
[0301]用于檢測屬于絲衣霉屬的菌類的引物組合(LBl引物組合)
[0302]LB1F3 引物:CGGTCCTCGAGCGTATGG (序列號 36)
[0303]LB1B3 引物:CCGTTACTGGGGCAATCC (序列號 37)
[0304]LBlFIP 引物:AGTTAGGTGACCGTGAGGTCGTCTTTGTCACGCGCTCTGG (序列號 38)
[0305]LBlBIP 引物:GGATCAGGTAGGGATACCCGCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGC (序列號 39)
[0306]在圖26 中，表示了在絲衣霉屬的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的堿基序列中，識別為上述引物的堿基序列的位置關系。
[0307]通過使用這些引物以及引物組合，就可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增屬于絲衣霉屬的菌類的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時，可以判斷檢測體中存在屬于絲衣霉屬的菌類。
[0308]為了設計特異檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的引物，在序列號32以及序列號34記載的堿基序列之中，優選為分別從序列表的堿基號350~559以及序列表的堿基號10~250所包含的范圍里選定上述6個堿基序列區域。具體地，優選為使用由含有序列號40記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、由含有序列號41記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、由含有序列號42記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、由含有序列號43記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、以及含有這些引物的引物組合，更優選為使用以下的引物組合。
[0309]用于檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的引物組合(LNl引物組合)
[0310]LN1F3 引物:GGCAACATCTCACGATCTGA (序列號 40)
[0311]LN1B3 引物:CCCTCAGTGTAGTGACCCTT (序列號 41)
[0312]LNlFIP 引物:ATGGTACCAGGCTCGAGATCGATACTAGGCCAACGGTGACA (序列號 42)
[0313]LNlBIP 引物:GTCCCTTCGGCGAGCTCTTCGTTGTTACCAGCACCAGACT (序列號 43)
[0314]為了檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉，優選為除上述引物以外使用環狀引物。作為環狀引物，優選為使用以下的引物。此外，上述引物組合，更優選為含有序列號44以及序列號45記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物。
[0315]用于檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的環狀引物(LNl環狀引物)
[0316]LNlLF 環狀引物:ACGGCACGAGGAACATACT (序列號 44)
[0317]LNlLB 環狀引物:CGATAACTTCGTCTTCGGCC (序列號 45)
[0318]在圖27中，表示了在與光滑新薩托菌(Neosartorya glabra)同屬于新薩托菌屬的費希爾新薩托菌(Neosartorya fischeri)的β _微管蛋白基因的堿基序列中，識別為上述引物的堿基序列的位置關系。
[0319]利用這些引物以及引物組合，可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的微管蛋白基因的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時，可以判斷檢測體中存在屬于新薩托菌屬的菌類以及/或者煙曲霉。
[0320]為了檢測出煙曲霉，除了上述引物組合之外，優選為使用由含有序列號46記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、由含有序列號47記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、由含有序列號48記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、由含有序列號49記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物、以及含有這些引物的引物組合，最優選為使用以下的引物組
口 ο
[0321]用于檢測煙曲霉的引物組合(LAf2引物組合)
[0322]LAf2F3 引物:GCCGCTTTCTGGTATGTCT (序列號 46)
[0323]LAf 2B3 引物:CGCTTCTTCCTTGTTTTCCG (序列號 47)
[0324]LAf2FIP 引物:CCATGACAGTGAGGCTGAACCCCGGGTGATTGGGATCTCTCA (序列號 48)
[0325]LAf2BIP 引物:ACCATCTCTGGTGAGCATGGCTTTCCGCCGCTTTCTCAA (序列號 49)
[0326]為了檢測出煙曲霉，優選為除上述引物以外使用環狀引物。作為環狀引物，優選為使用以下的引物。此外，上述引物組合，更優選為由含有序列號50記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物。
[0327]用于檢測煙曲霉的環狀引物(LAf2環狀引物) [0328]LAf2LB 環狀引物:AGTAAGTTCGACCTATATCCTCCC (序列號 50)
[0329]在圖28中，表示了煙曲霉的β -微管蛋白基因的堿基序列中，識別為上述引物的堿基序列的位置關系。通過使用這些引物以及引物組合，可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增煙曲霉的β_微管蛋白基因的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時，可以判斷檢測體中存在煙曲霉。
[0330]此外，在用上述引物組合時，雖然可以特異地檢測出煙曲霉，但是不能檢測出屬于新薩托菌屬的菌類。因此，通過組合使用上述用于檢測屬于新薩托菌屬的菌類以及煙曲霉的引物組合(LNl引物組合)以及用于檢測煙曲霉的引物組合(LAf2引物組合)，就可以鑒別新薩托菌屬的菌類和煙曲霉。
[0331]為了設計特異檢測屬于半內果菌屬的菌類的引物，在序列號35記載的堿基序列之中，優選為從序列表的堿基號300~550所包含的范圍里選定上述6個堿基序列區域。具體地，優選為使用由含有序列號51記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號52記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號53記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號54記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及含有這些引物的引物組合，更優選為使用以下的引物組合。
[0332]用于檢測屬于半內果菌屬的菌類的引物組合(LH2引物組合)
[0333]LH2F3 引物:GGATCCGAATACGACGTGTC (序列號 51)
[0334]LH2B3 引物:CCCTCAGTGTAGTGACCCTT (序列號 52)
[0335]LH2FIP 引物:CATGGTGCCAGGCTCGAGATCCAGGCCAGCGGTAACAAG (序列號 53)
[0336]LH2BIP 引物:CCGGTCCTTTTGGCCAGCTCTGTTACCGGCACCAGACT (序列號 54)
[0337]為了檢測出屬于半內果菌屬的菌類，優選為除上述引物以外使用環狀引物。作為環狀引物，優選為使用以下的引物。此外，上述引物組合，更優選為由含有序列號55以及序列號56記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物。
[0338]用于檢測屬于半內果菌屬的菌類的環狀引物(LH2環狀引物)[0339]LH2LF 環狀引物:ACGGCACGGGGGACATA (序列號 55)
[0340]LH2LB 環狀引物:TTCCGCCCAGACAACTTCG (序列號 56)
[0341]在圖29中，表示了屬于半內果菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的堿基序列中，識別為上述引物的堿基序列的位置關系。
[0342]通過使用這些引物以及引物組合，可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增屬于半內果菌屬的菌類的β_微管蛋白基因的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時，可以判斷檢測體中存在屬于半內果菌屬的菌類。
[0343]為了設計特異檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的引物,優選為在序列號26記載的堿基序列之中，從序列表的堿基號200~450所包含的范圍里選定上述6個堿基序列區域。具體地，優選為使用由含有序列號57記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號58記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號59記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號60記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及含有這些引物的引物組合，更優選為使用以下的引物組合。
[0344]用于檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的引物組合(LTf2引物組合)
[0345]LTf2F3 引物:CCAGTTGGAGCGTATGAACG (序列號 57)
[0346]LTf2B3 引物:CCCAGTTGTTACCAGCACCG (序列號 58)
[0347]LTf2FIP 引物:TTGTTGCCGGAGGCCTACACTTTACTTCAACGAGGTGCGT (序列號 59)
[0348]LTf2BIP 引物:CGACTTGGAGCCCGGTACCAAAAGTTGTCGGGACGGAAGA (序列號 60)
[0349]為了檢測出黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)，優選為除上述引物以外使用環狀引物。作為環狀引物，優選為使用以下的引物。此外，上述引物組合，更優選為由含有序列號61記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物。
[0350]用于檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的環狀引物(LTf2環狀引物)
[0351]LTf2LB 環狀引物:GCTGGTCCCTTTGGTCAGC (序列號 61)
[0352]在圖30中，表不了黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的堿基序列中，識別為上述引物的喊基序列的位置關系。
[0353]通過使用這些引物以及引物組合，可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)的β _微管蛋白基因的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時，可以判斷檢測體中存在黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)。
[0354]為了設計特異檢測沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)的引物,優選為在序列號29記載的堿基序列之中，從序列表的堿基號150~420所包含的范圍里選定上述6個堿基序列區域。具體地，優選為使用由含有序列號62記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號63記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號64記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號65記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及含有這些引物的引物組合，更優選為使用以下的引物組合。
[0355]用于檢測沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)的引物組合(LTw4_3引物組合)
[0356]LTw4F3 引物:TGGCTCCGGAATGTGAGTT (序列號 62)
[0357]LTw3B3 引物:CAAATCGACGAGGACGGC (序列號 63) [0358]LTw4FIP 引物:CGCTCCAACTGGAGGTCGGAAAAITTCGACATCCCACCCT (序列號 64)[0359]LTw3BIP 引物:GGAATCTGCCCCGCGACATTCCGGGGGACGTACTTGTTG (序列號 65)
[0360]為了檢測出沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii),優選為除上述引物以外使用環狀引物。作為環狀引物，優選為使用以下的引物。此外，上述引物組合更優選為由含有序列號66以及序列號67記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物。
[0361]用于檢測沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)的環狀引物(LTw4_3環狀引物)
[0362]LTw4LF 環狀引物:GGTGCCATTGTAACTGGAAATGA (序列號 66)
[0363]LTw3LB 環狀引物:ACTCATATCGTATAGGCTAGCGG (序列號 67)
[0364]在圖31中，表示了沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)的β_微管蛋白基因的喊基序列中，識別為上述引物的喊基序列的位置關系。
[0365]通過使用這些引物以及引物組合，可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)的β -微管蛋白基因的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時,可以判斷檢測體中存在沃特曼籃狀菌(Talaromyces wortmannii)。
[0366]為了設計特異檢測藤黃籃狀菌(Talaromyces Iuteus)的引物,優選為在序列號27記載的堿基序列之中，從序列表的堿基號150~450所包含的范圍里選定上述6個堿基序列區域。具體地，優選為使用由含有序列號68記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號69記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號70記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號71記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及含有這些引物的引物組合，更優選為使用以下的引物組合。
[0367]用于檢測藤黃籃狀菌(Talaromyces Iuteus)的引物組合(LTl I引物組合)
[0368]LT11F3 引物:CGAATCACCACTGATGGGAA (序列號 68)
[0369]LTl 1B3 引物:GAAGAGCTGACCGAAAGGAC (序列號 69)
[0370]LT11FIP 引物:TTCGTGCTGTCGGTCGGTAATGTTCCGACCTCCAGTTAGAGC (序列號了0)
[0371]LT11BIP 引物:TAGGCTAGCGGCAACAAGTACGATAGTACCGGGCTCCAGATC (序列號 71)
[0372]為了檢測出藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)，優選為除上述引物以外使用環狀引物。作為環狀引物，優選為使用以下的引物。此外，上述引物組合，更優選為由含有序列號72記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物。
[0373]用于檢測藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)的環狀弓丨物(LTlI環狀引物)
[0374]LTllLF 環狀引物:ACCTCGTTGAAATAGACGTTCA (序列號 72)
[0375]在圖32中，表示了藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)的β-微管蛋白基因的堿基序列中，識別為上述引物的喊基序列的位置關系。
[0376]通過使用這些引物以及引物組合，可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)的β _微管蛋白基因的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時，可以判斷檢測體中存在藤黃籃狀菌(Talaromyces luteus)。
[0377]為了設計特異檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及糙孢籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)的引物,優選為在序列號30以及序列號31記載的堿基序列之中，從序列表的堿基號250~550所包含的范圍里選定上述6個堿基序列區域。具體地，優選為使用由含有序列號73記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號74記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號75記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及由含有序列號76記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物，以及含有這些引物的引物組合，更優選為使用以下的引物組合。
[0378]用于檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及糙孢籃狀菌(Talaromycestrachyspermus)的引物組合(LTl引物組合)
[0379]LT1F3 引物:GCGTCATTTCTGCCCTCAA (序列號 73)
[0380]LT1B3 引物:AGTTCAGCGGGTAACTCCT (序列號 74)
[0381]LTlFIP 引物:TACGCTCGAGGACCAGACGGCGGCTTGTGTGTTGGGTG (序列號 75)
[0382]LTlBIP 引物:TCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGATCCGAGGTCAACC (序列號 76)
[0383]為了檢測出黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及糙孢籃狀菌(Talaromycestrachyspermus)，優選為除上述引物以外使用環狀引物。作為環狀引物，優選為使用以下的引物。此外，上述引物組合更優選為由含有序列號77以及序列號78記載的堿基序列的寡核苷酸組成的引物。
[0384]用于檢測黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及糙孢籃狀菌(Talaromycestrachyspermus)的環狀引物(LTl環狀引物)
[0385]LTlLF 環狀引物:GCTGCCTTTTGGGCAGGTC (序列號 77)
[0386]LTlLB 環狀引 物:TGGTCACACCACTATATTTTACCAC (序列號 78)
[0387]在圖33、圖34以及圖34-1中，表示了黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及糙抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)的28S rDNA的ITS區域以及D1/D2區域的喊基序列中，識別為上述引物的堿基序列的位置關系。
[0388]通過使用這些引物以及引物組合，可以用LAMP法特異地迅速且高靈敏度地擴增黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及糖抱籃狀菌(Talaromyces trachyspermus)的 28SrDNA的ITS區域以及D1/D2區域的可變區。因此，在確認了該DNA片段的擴增時，可以判斷檢測體中存在黃色籃狀菌(Talaromyces flavus)以及/或者糙孢籃狀菌(Talaromycestrachyspermus)。
[0389]構成上述引物組合的各個外引物，不僅在LAMP法中，在PCR法中也可以使用。在PCR法中，使用上述引物，以被檢測體的微管蛋白基或者28S rDNA的ITS區域以及Dl/D2區域為模板用耐熱DNA聚合酶進行PCR，就可以擴增作為目的的DNA片段。
[0390]核酸擴增反應所用的酶，只要是通常所用的并沒有特別限制，優選為具有鏈置換活性的模板依存性核酸合成酶。作為這樣的酶，可以列舉Bst DNA聚合酶(大片段(largefragment))、Bca (exo_) DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，優選為BstDNA聚合酶(大片段)。本發明中可以用的酶可以是從病毒或者細菌等純化而成，也可以是利用基因重組技術制造而成。另外，這些酶也可以是片段化或者氨基酸置換等改變而成。
[0391 ] 利用LAMP法進行擴增反應時的溫度沒有特別限制，優選在60~65°C。
[0392]利用LAMP法擴增的核酸片段的確認可以用通常的方法進行。例如，利用特異性識別經擴增的堿基序列的標記寡核苷酸作為探針進行雜交，用熒光嵌入染料法(特開2001-242169號公報)檢測，或者，也可以將反應結束后的反應液直接在瓊脂糖凝膠上進行電泳以檢測其條帶。在瓊脂糖凝膠電泳中，LAMP法擴增產物，其堿基長度不同的眾多條帶呈階梯(梯子)狀被檢測出來。
[0393]此外，在LAMP法中由于核酸的合成造成底物被大量消耗，作為副產物的焦磷酸離子與共存的鎂離子反應生成焦磷酸鎂。焦磷酸鎂一旦生成，反應液就會出現直到肉眼可以確認程度的白色渾濁。以此白色渾濁為指標，用可以對反應結束后或者反應中的濁度上升進行實時的光學觀測的測定儀器就可以進行檢測。例如，用分光光度計確認400nm的吸光度的變化，就可以檢測出核酸的擴增反應(國際公開第01/83817號小冊子)。
[0394]根據用LAMP法的本發明的檢測方法,在約60~120分鐘的短時間內可以進行從檢測體的制備工序到菌類的檢測工序。
[0395]接著，具體說明本發明的耐熱菌類的檢測方法的一個實施方式，然而本發明并不限定于此。
[0396]I)事故原因菌解析
[0397]作為具有由耐熱菌類引起污染事故可能性的飲食品，可以列舉由于含有糖類或蛋白質而不能在強烈的條件下滅菌的飲食品。這樣的飲食品，可以列舉以果實、果汁等農產品或者以乳等畜產品為原料等的飲食品。
[0398]從引起事故過的飲料等檢測出來的菌絲中回收DNA。之后，用上述的本發明的寡核苷酸作為核酸引物進行PCR反應或者LAMP法等的基因擴增處理。
[0399]用PCR法進行基因擴增時，作為絲衣霉屬檢測用引物對，使用上述(a)以及(b)的寡核苷酸對；作為籃狀菌屬檢測用引物，使用上述(C)以及(d)的寡核苷酸對、上述(e)以及Cf)的寡核苷酸對、上述(g)以及(h)的寡核苷酸對、上述(i)以及(h)的寡核苷酸對、以及上述(j)以及(k)的寡核苷酸對中的任意一對以上；作為新薩托菌屬以及煙曲霉檢測用引物，使用上述(I)以及 (m)的寡核苷酸對以及上述(η)以及(ο)的寡核苷酸對中的任意一對以上；作為半內果菌屬檢測用引物，使用上述(P)以及(q)的寡核苷酸對、上述(r)以及(S)的寡核苷酸對、以及上述(t)以及(U)的寡核苷酸對中的任意一對以上。
[0400]用LAMP法進行基因擴增時，作為絲衣霉屬檢測用引物，使用序列號36~39記載的堿基序列所表示的寡核苷酸組合；作為籃狀菌屬檢測用引物，使用序列號57~61記載的堿基序列所表示的寡核苷酸組合、序列號62~67記載的堿基序列所表示的寡核苷酸組合、序列號68~72記載的堿基序列所表示的寡核苷酸組合、序列號73~78記載的堿基序列所表示的寡核苷酸組合之中任意一組以上；作為新薩托菌屬以及煙曲霉檢測用引物，使用序列號40~45記載的堿基序列所表示的寡核苷酸組合；作為半內果菌屬檢測用引物，使用序列號51~56記載的堿基序列所表不的寡核苷酸組合。
[0401]通過使用這些引物對，可以分別檢測出上述4個屬的耐熱菌類的各個屬。另外，通過適當組合使用各屬的檢測用引物，可以全面的檢測出上述4屬中多個屬的菌種。本發明的引物是各屬特異性的，所以可以全面的檢測出上述4個屬的耐熱菌類，并且從使用的引物的種類，還可能在屬水平上進行鑒定(在耐熱菌類的上述4個屬內的檢測)。
[0402]用上述引物進行基因擴增處理后，用PCR法時進行電泳以確認反應產物的有無，用LAMP法時通過測定反應液的濁度以確認反應產物的有無。與此同時，收集的菌體的一部分接種到添加氯霉素PDA上，于50°C培養。
[0403]在屬于新薩托菌屬的菌類檢測用引物以外的引物的PCR基因擴增產物得到確認的情況，以及/或者屬于新薩托菌屬的菌類檢測引物的基因擴增產物得到確認并且在50°C菌絲沒有生長，或者在用新薩托菌和煙曲霉檢測用引物的PCR反應或者LAMP反應中反應產物沒有得到確認的情況下，認為是“耐熱菌類陽性”(檢測出屬于新薩托菌屬的菌類)。[0404]作為一個例子，對于組合使用上述(a)以及(b)所示的寡核苷酸對、上述(t)以及(U)所示的寡核苷酸對、上述(η)以及(ο)所示的寡核苷酸對、上述(i)以及(h)所示的寡核苷酸對、上述(j )以及(k)所示的寡核苷酸對，通過PCR法進行基因擴增處理進行詳細說明。在使用屬于新薩托菌屬的菌類檢測用引物(上述(η)以及(O)所示的寡核苷酸對)的體系中確認了反應產物的情況下，確認在50°C經培養的菌絲的生長，從而確認屬于新薩托菌或者屬于煙曲霉。或者，使用以新薩托菌和煙曲霉的檢測用寡核苷酸作為核酸引物進行檢測。例如，用上述(V)以及(W)的寡核苷酸作為引物進行PCR反應，在確認了約200bp的反應產物的情況下判定為煙曲霉，在確認沒有反應產物的情況下，判定為屬于新薩托菌屬的菌類呈陽性。
[0405]在使用屬于絲衣霉屬的菌類檢測用引物(上述(a)以及(b)所示的寡核苷酸對)的體系中確認了反應產物的情況下，判定為屬于絲衣霉屬的菌類呈陽性。
[0406]在使用屬于半內果菌屬的菌類檢測用引物(上述(t)以及(U)所示的寡核苷酸對)的體系中確認了反應產物的情況下，判定為屬于半內果菌屬的菌類呈陽性。
[0407]在使用屬于籃狀菌屬的菌類檢測用引物(上述(j)以及(k)所示的寡核苷酸對以及/或者上述(i)以及(h)所示的寡核苷酸對)的體系中確認了反應產物的情況下，判定為屬于籃狀菌屬的菌類呈陽性。
[0408]由于耐熱菌類在熱滅菌條件下也可以生存，所以從原料以及工序耐熱菌類混入的可能性非常高。因此，在耐熱菌類呈陽性的情況下，必須仔細檢查原料以及制造環境的清潔度。相反，在耐熱菌類呈陰性的情況下，原因是滅菌不充分或者滅菌后的混入，必須重新進行滅菌工序或者進行容器的密封性確認(原因調查)。
[0409]2)原料的微生物檢查
[0410]通常的原料的菌類檢查，需要一般菌類(被檢測體不進行熱激處理)和耐熱菌類(被檢測體進行熱激處理)2個實驗。然而，根據本發明，不需要對被檢測體進行熱激處理。即，只進行一般菌類的檢查，在確認菌絲的情況下可以用此菌絲用上述I)的方法進行判斷是否為耐熱菌類。在過去的方法中，通常耐熱菌類的檢測需要7天左右，但是根據本發明，在通常3天左右的菌絲確認之后，可能在2天之內檢測出來，也可能提前于2天檢測出來。此外，在過去的方法中，耐熱菌類檢測出來后菌種的鑒定還需要約7天時間，而本發明的方法，可以在檢測出來的同時進行屬水平上的鑒定。
[0411]在本發明的耐熱菌類的檢測方法中，被檢測體沒有特別限制，可以使用飲食品自身、飲食品的原材料、分離的菌體、培養的菌體等。
[0412]作為從被檢測體中制備DNA方法，只要能夠得到足夠于進行耐熱菌類的檢測的純度和量的DNA，就沒有特別限制，可以用通常的方法進行。可以使用從被檢測體的RNA逆轉錄得到的DNA。此外，也可以使用沒有純化的狀態，也可以使用經過進一步分離、提取、濃縮、純化等前處理。例如，可以進行苯酚和氯仿的提取來純化，用市售的純化試劑盒來純化，提高核酸的純度后使用。
[0413]據本發明的耐熱菌類的檢測方法，可以在約5~12小時的短時間內進行從被檢測體的制備工序到菌類的檢測工序。
[0414] 本發明的耐熱菌類檢測試劑盒是含有上述本發明的檢測用寡核苷酸作為核酸探針或者核酸引物的試劑盒。具體地，本發明的耐熱菌類檢測試劑盒含有從可以和上述(I)或者(II)的核酸進行雜交并且作為特異地檢測出耐熱菌類的檢測用寡核苷酸而發揮功能的寡核苷酸中選出的至少一種作為核酸探針或者核酸引物。特別是，優選為從含有序列號I~23或者36~78中任一個記載的堿基序列或者其互補序列的寡核苷酸，以及含有與該堿基序列或者其互補序列有70%以上同源性并且可以作為檢測用寡核苷酸的堿基序列的寡核苷酸中選出的至少一種作為核酸探針或者核酸引物。此試劑盒可以用于檢測耐熱菌類。本發明的試劑盒，除了上述核酸探針或者核酸引物以外，根據目的，也可以含有標記檢測物質、緩沖液、核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶等)、酶底物(dNTP，rNTP等)等菌類檢測中常用的物質。
[0415]例如，用LAMP法的耐熱菌類檢測用試劑盒，優選為含有作為上述的引物、環狀引物所必要的各種寡核苷酸，成為核酸合成底物的4種dNTP (dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，具有鏈置換活性的模板依存性核酸合成酶等DNA聚合酶，以及作為提供給酶反應適合條件的緩沖液，作為輔助因子的鹽類(鎂鹽或者錳鹽等)，穩定酶或者模板的保護劑，進一步根據需要還含有檢測反應產物所必要的試劑類。在此試劑盒中，也可以含有為了確認利用本發明檢測用寡核苷酸對的基因擴增反應正常進行的陽性對照(positive control).作為陽性對照，例如，可以列舉含有本發明的檢測用寡核苷酸所擴增的區域的DNA。
[0416]實施例
[0417]以下，基于實施例詳細說明本發明，但是本發明不受它們限制。
[0418]實施例1
[0419](A-1)屬于絲衣霉屬的菌類的檢測、識別
[0420]1.β微管蛋白部分長度的堿基序列的確定 [0421]通過下述方法確定絲衣霉屬各種的β_微管蛋白基因的堿基序列。使用Gen i ^ ? (Takara Bio (株)社生產)，從用馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基在30°C、暗處培養7天的絲衣霉屬菌體，提取DNA。作為目的部位的PCR擴增，使用PuReTaqTM Ready-To-Go PCR Beads (GE Health Care UK LTD 生產)，作為引物使用 Bt2a(5，-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3，:序列號 79)、Bt2b(5，-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3，:序列號 80) (Glass and Donaldson,Appl Environ Microbiol61:1323 — 1330,1995)。擴增條件為β微管蛋白部分長度的變性溫度為95°C，退火溫度為59°C，延伸溫度為72°C，實施 35 次循環。PCR 產物使用 Auto SegTM G — 50 (Amersham Pharmacia Biotech 社生產)進行純化。PCR 產物使用 BigDye terminator Ver.1.1(商品名:Applied Biosystems 社生產)標記，以 ABI PRISM3130Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社生產)實施電泳。在從電泳時的熒光信號來確定堿基序列時，使用軟件“ATGC Ver.4" (Genetyx社生產)。
[0422]基于利用測序法確定的雪白絲衣菌(Byssochlamys nivea)和各種菌類的公知的β-微管蛋白基因的堿基序列信息，使用DNA解析軟件(商品名:DNAsis pro,日立軟件社生產)進行比對解析，確定含有屬于絲衣霉屬的菌類的特異性堿基序列的β -微管蛋白基因中的特定區域(序列號24)。
[0423]2.屬于絲衣霉屬的菌類的檢測和屬水平的鑒定
[0424](I)引物的設計
[0425]上述得到的屬于絲衣霉屬的菌類的特異性堿基序列區域中，從在’末端屬于絲衣霉屬的菌類的特異性特別高的區域，進行滿足如下4個條件的部分區域的研究:1)屬固有的堿基序列在數堿基前后存在，2) GC含量大概為30%~80%，3)自退火的可能性低，4) Tm值大概為55~65°C左右。基于該堿基序列設計一組引物對，使用從各種菌體提取的DNA作為模板，利用PCR反應研究絲衣霉屬檢測和屬鑒定的有效性。即，進行的研究為:在以絲衣霉屬DNA作為模板的反應中，確認約150bp的DNA擴增反應，在以其它霉菌的基因組DNA作為模板的反應中，不能確認擴增產物。根據該結果，確認絲衣霉屬的完全檢出，即能夠進行絲衣霉屬的屬水平的鑒定。確認了有效性的引物對為由以序列號I和2記載的堿基序列表示的寡核苷酸構成的引物對。另外，使用的引物是委托Sigma Aldrich Japan公司合成(脫鹽純化品，0.02 μ mo I等級)而購入的。
[0426](2)被檢測體的制備
[0427]作為在經設計的引物的有效性的評價中使用的真菌類，即絲衣霉屬、其它的耐熱霉菌和一般霉菌，使用表1和表2中記載的菌。對這些菌類，購入千葉大學醫學部真菌醫學研究中心所保管并利用IFM序號管理的菌類而使用。
[0428]在最適條件下培養各菌體。培養條件為:使用馬鈴薯葡萄糖培養基(商品名:〃一 > - 7馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，榮研化學株式會社生產)，以指定溫度，即一般霉菌為25°C、耐熱霉菌和煙曲霉為30°C，培養7天。
[0429]表1
[0430]
【權利要求】
1.一種屬于籃狀菌(Talaromyces)屬耐熱菌類的檢測方法,其包括下述2)的工序， 2)用下述(B-1)或者(B-2)的寡核苷酸作為引物對屬于籃狀菌(Talaromyces)屬的菌類進行鑒定的工序， (B-1)序列號3~6、10~11和57~72中任一個記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸； (B-2)在序列號3~6、10~11和57~72中任一個記載的堿基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸。
2.如權利要求1所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 為了進行鑒定，標記從所述(B-1)~(B-2)中選出的至少一種寡核苷酸，使得到的寡核苷酸與從檢測對象物中提取的核酸進行雜交，測定經雜交的寡核苷酸的標記。
3.如權利要求1所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 包括下述2-1)的工序: 2-1)用下述(B-3 )或者(B-4 )的寡核苷酸作為引物通過聚合酶鏈反應(PCR)法對屬于籃狀菌(Talaromyces)屬的菌類進行鑒定的工序， (B-3)序列號3~6、10~11中任一個記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸； (B-4)在序列號3~6、10~11中任一個記載的堿基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸。
4.如權利要求1所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 包括下述2-2)的工序: 2-2)用下述(B-5)或者(B-6)的寡核苷酸作為引物通過環介導等溫擴增(LAMP)法對屬于籃狀菌(Talaromyces)屬的菌類進行鑒定的工序， (B-5)序列號57~72中任一個記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸；(B-6)在序列號57~72中任一個記載的堿基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測屬于籃狀菌屬的菌類的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸。
5.如權利要求1所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 為了進行鑒定，使用所述(B-1)~(B-2)的寡核苷酸中的至少一種來進行基因擴增，并確認有無擴增產物。
6.如權利要求5所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 采用聚合酶鏈反應(PCR)法進行所述擴增反應。
7.如權利要求5所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 采用環介導等溫擴增(LAMP)法進行所述擴增反應。
8.如權利要求6所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 在所述2)的工序中，使用下述(B-7)的至少一種寡核苷酸對: (B-7)由序列號3所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸和序列號4所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸構成的寡核苷酸對、由序列號5所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸和序列號6所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸構成的寡核苷酸對、或者 由序列號10所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸和序列號11所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸構成的寡核苷酸對。
9.如權利要求7所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 在所述2)的工序中，使用下述(B-8)的寡核苷酸中的至少一種: (B-8)序列號57~72中任一個所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸。
10.如權利要求9所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 在所述2)的工序中，使用下述(B-9)~(B-1l)中的至少一種的寡核苷酸組合: (B-9)寡核苷酸組合，其包含:序列號57所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸、序列號58所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸、序列號59所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸、以及序列號60所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸； (B-10)寡核苷酸組合，其包含:序列號62所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸、序列號63所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸、序列號64所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸、以及序列號65所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸； (B-1l)寡核苷酸組合，其包含:序列號68所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸、序列號69所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸、序列號70所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸、以及序列號71所記載的堿基序列所表示的寡核苷酸。
11.如權利要求10所述的耐熱菌類的檢測方法，其特征在于， 所述(B-9)~(B-1l)的寡核苷酸組合是下述(B-9’)~(Β-11')的寡核苷酸組合:(B-9’)寡核苷酸組合，其在所述(B-9)中，進一步包含:序列號61所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸； (B-10’)寡核苷酸組合，其在所述(B-10)中，進一步包含:序列號66所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸和/或序列號67所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸； (B-11’)寡核苷酸組合，其在所述(B-1l)中，進一步包含:序列號72所記載的堿基序列所表不的寡核苷酸。
12.一種屬于籃狀菌(Talaromyces)屬耐熱菌類的檢測用寡核苷酸,其特征在于， 所述檢測用寡核苷酸是序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸，或者是在序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的堿基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且可以作為檢測用寡核苷酸使用的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸。
13.—種屬于籃狀菌(Talaromyces)屬耐熱菌類的檢測用試劑盒,其含有選自下述(1-1)或者(1-2)的寡核苷酸中的至少一種作為核酸探針或者核酸引物， (1-1)序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸； (1-2)在序列號3~6、10~11和57~72中任一個所記載的堿基序列中使I~3個堿基缺失、置換或者添加而得到并且能夠用于檢測耐熱菌類的堿基序列或者其互補序列所表示的寡核苷酸。
【文檔編號】C12Q1/04GK103923990SQ201410140749
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2009年5月28日 優先權日:2008年5月28日
【發明者】細谷幸一, 中山素一, 德田一, 矢口貴志, 弘佑介 申請人:花王株式會社