Lamp檢測玉米mir162的引物組、試劑盒及方法
【專利摘要】本發明公開了LAMP檢測玉米MIR162的引物組、試劑盒及方法，所述引物由外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP和環引物LB組成，其核苷酸序列見SEQIDNo：1~5。本發明還保護了含有該引物的LAMP試劑盒。本發明的檢測方法具有快速簡便、準確靈敏的特點，在轉基因產品管理和檢驗檢疫工作中具有實際應用價值，尤其適用于基層實驗室和現場檢測的推廣和應用。
【專利說明】LAMP檢測玉米MlR162的引物組、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，涉及轉基因植物品系的檢測方法，具體涉及LAMP檢測玉米MIR162的引物組、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]自1996年轉基因作物投入商業化種植以來，經濟社會效益逐步顯現。根據國際農業生物技術應用服務組織(ISAAA)的研究報告，2012年全球轉基因作物種植面積達到1.7億公頃，較1996年(170萬公頃)增長了 100倍。這些數字反映了全球轉基因生物育種的發展態勢。但是由于轉基因技術可能產生新毒素和過敏原、導致抗性基因的基因漂移等原因，國際社會對轉基因食品的安全性仍有相當大的爭議。包括我國在內的世界許多國家都出臺了轉基因產品管理法規，要求對轉基因產品進行檢測、標識和管理。
[0003]轉基因玉米作為目前世界上最主要的轉基因作物之一，占全世界轉基因作物種植面積的30%以上，僅次于轉基因大豆。自2009年以來，我國進口玉米大幅增長，2012年全年玉米進口 520.74萬噸，同比增長197%，主要進口來源地為美國。然而，我國許可進口的轉基因玉米品系只有13個。根據我國法律法規，必須對入境玉米進行轉基因檢測以排除未批準玉米品系進境。[0004]MIR162是由先正達公司開發的抗鱗翅目昆蟲的轉基因玉米，該品系是通過DNA重組技術，將一種來自蘇云金芽孢桿菌的抗鱗翅類昆蟲的特異性抗蟲基因Vip3A導入玉米基因組中。目前Mirl62玉米已經在美國、加拿大、阿根廷、巴西、日本和俄羅斯等國獲得了種植批準，并通過了加拿大食品檢疫局(CFIA)的安全性審批，但中國農業部并未批準該轉基因玉米品系進口。為防止非法轉基因生物及其產品在國內種植和銷售，對MIR162這種未批準轉基因玉米品系的檢測十分重要。
[0005]轉基因玉米成分的檢測主要采用TaqMan實時熒光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁瑣、耗時長、染料EB有較強毒性、易污染環境等缺點已逐漸被實時熒光PCR檢測方法所取代。TaqMan實時熒光PCR靈敏度高、特異性好，但需要熒光PCR儀，設備和試劑成本昂貴，并不普遍適用于檢驗檢疫一線的基層實驗室和現場檢測。
近年來，環介導等溫基因擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification,以下簡稱LAMP)發展迅速。LAMP是日本榮研化學株式會社于2000年前后開發出的基因擴增技術，具有快速簡便、操作準確、容易普及、安全可靠的優點，不需要特殊的試劑和儀器設備，成本低廉，適用于檢驗檢疫一線的基層實驗室和現場檢測。
[0006]國內發布的轉基因玉米MIR162品系的檢測標準是SN/T 1196-2012，國外發布的轉基因玉米MIR162品系的檢測方法標準是歐盟官方方法“Event-specific method forthe quantification of maize MIR162 by real-time PCR (CRLVL08/08VR) ”，這兩個標準均采用實時熒光PCR方法。
[0007]其他研究包括:(I)鄧婷婷等2012年發表了“轉基因玉米MIR162品系的實時PCR及可視芯片檢測方法研究”(植物檢疫，2012，26(5)，14-18)。(2)Jae_Hwan Kim等2009年發表了利用多重PCR檢測四個轉基因玉米品系(3272、LY038、MIR162和M0N88017)的方法(J.Korean Soc.Appl.Biol.Chem.2009，52(1)，105-107)。(3)路興波等申請了專利“用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物、探針及其應用”(CN201210053592)和“用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物及熒光標記探針及其應用”(CN201210052534)。這些研究全部采用的普通PCR方法和熒光PCR方法。
[0008]目前尚未發現將LAMP應用于轉基因玉米MIR162品系檢測的方法和試劑盒。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于提供一種快速簡便、準確靈敏、容易普及、適用基層一線實驗室和現場應用的轉基因玉米MIR162品系檢測方法。
[0010]為實現上述目的，本發明提供一種用于檢測轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測引物組。
[0011]本發明還保護一種用于檢測轉基因玉米品系MIR162的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:含有上述引物組。
[0012]本發明還保護一種用于檢測轉基因玉米品系MIR162的LAMP檢測方法，其特征在于:包括使用所述引物組或者所述試劑盒的步驟。
[0013]所述方法以樣品基因組DNA為模板，利用所述引物組或者所述試劑盒進行等溫擴增，反應結束后用熒光染料SYBR Green I檢測擴增產物，結果判定。
[0014]本發明所采用的技術方案如下:
一種用于轉基因玉米品系MIR162檢測的LAMP檢測引物組，本發明通過分析轉基因玉米品系MIR162基因序列(HI203349)設計，由外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP和環引物LB組成，所述引物的核苷酸堿基序列分別如下所示:
外引物 F3:5，- ACATGTAATGCATGACGTTAT -3，(SEQ ID No:1)
外引物 B3:5，- GCCTTATCTGTTGCCTTCA -3，(SEQ ID No:2)
內引物FIP:
5’ - CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTC -3’ (SEQ ID No:3)
內引物BIP:
5’ - AACTAGGATAAATTATCGCGCGCCGGACGTTTTTAATGTACTGAA -3’ (SEQ ID No:4)
環引物 LB: 5’ - TGTCATCTATGTTACTAGATCCCCG -3，(SEQ ID No:5)
一種用于轉基因玉米品系MIR162檢測的LAMP檢測試劑盒，含有權利要求1所述引物組的試劑盒。
[0015]一種用于轉基因玉米品系MIR162檢測的LAMP檢測方法，包括如下步驟:
(1)根據上述引物的核苷酸序列信息合成外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP和環引物LB，分別配制成濃度為10 Mmol/L的外引物F3溶液、10 Mmol/L的外引物B3溶液，40 Mmol/L的內引物FIP溶液、40 Mmol/L的內引物BIP溶液、40 Mmol/L的環引物LB溶液作為試劑盒，備用；
(2)提取轉基因玉米品系MIR162基因組DNA溶液備用；
(3)等溫擴增反應:以樣品基因組DNA為模板，利用所述的LAMP檢測引物組進行等溫擴增。[0016]所述的等溫擴增反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入:IOXThermoPol 緩沖液 2.5 μL、10 Mmol/L 的外引物 F3 溶液 0.5 μL、10 Mmol/L 的外引物B3溶液0.5 μL、40 Mmol/L的內引物FIP溶液I μL、40 Mmol/L的內引物BIP溶液I μL、40Mmol/L 的環引物 LB 溶液 1 μL、5 mM 甜菜堿 4 μL、10 mM dNTPs 4 μL,100 mmol/L MgSO4 IμL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1 μL、基因組DNA溶液2 μ L、6.5 μ L超純水，混勻后在PCR管蓋內壁加 1000XSYBR Green I 溶液 2 μL。
[0017]其中上述10XThermoPol 緩沖液為:0.1 mol/L KCl,0.2 mol/L pH 8.8的 Tris- HC1，0.1 mol/L (NH4)2SO4, 20 mmol/L MgSO4和 1% Triton X-1OO0
[0018]所述的等溫擴增反應條件為:63°C恒溫反應90 min。
[0019]反應結束后采用顯色法檢測擴增產物，顯色法使用的顯色劑為熒光染料SYBRGreen I。采用混合PCR產物和1000XSYBR Green I溶液的方式顯色。所述的判定結果是根據反應混合物變綠色作為檢出轉基因玉米品系MIR162的結論，反之，保持SYBR Green I的橙色不變，結果為未檢出轉基因玉米品系MIR162。
[0020]本發明的創新特征是:
本發明將LAMP檢測技術應用于轉基因玉米MIR162品系的檢測，針對MIR162的品系特異性基因，應用特異引物組，在恒溫條件和簡易的設備中，僅用一個半小時左右即可有效地完成檢測任務，結果判定簡單。檢測時間短、檢測成本低是本檢測方法的特點，尤其適用于基層一線實驗室和現場檢測，可以作為實時熒光PCR方法的有益補充。
[0021]本發明的有益效果為:本發明研制的轉基因玉米MIR162品系LAMP檢測引物組、LAMP檢測試劑盒和檢測方法，適用于轉基因玉米MIR162品系的檢測，檢測靈敏度為0.5%，方法快速準確、特異性好，在轉基因產品管理和檢驗檢疫實際工作中具有廣闊的應用價值與市場前景，尤其適用于基層一線實驗室和現場檢測的推廣和應用。
[0022]本發明的創新點，不在LAMP技術本身，而在于研究開發者通過何種手段，將LAMP技術轉變為可以用來檢測轉基因玉米MIR162的檢測診斷方法。目前，國內外的研究者，均以建立快速、準確的檢測診斷手段為目標。一項快速、準確的檢測診斷手段的研發和建立需要研究者的不斷探索和努力，也能夠創造巨大的社會價值和經濟價值。所以本發明是以LAMP技術為基本原理，在此基礎上開發創造出其他研究者未能實現的，多條新的引物，從而實現了 LAMP方法檢測轉基因玉米MIR162。如果沒有發明人創造性的開發出特殊的引物，LAMP技術只能是一個概念，不能發揮任何價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是本發明LAMP檢測MIR162和其他13種植物物種的實驗結果圖。
[0024]圖2是本發明LAMP檢測14種轉基因玉米品系和非轉基因玉米的實驗結果圖。
[0025]圖3是本發明轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測方法靈敏度實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0027]本發明中轉基因玉米標準品Bt 176、BtlU M0N810、GA21、NK603、M0N863、1507、3272、MIR604、59122、98140和轉基因大豆標準品GTS40-3-2購自IRMM (歐洲標準物質研究所)；轉基因玉米標準品MIR162、M0N89034、M0N88017和轉基因油菜GT73購自AOCS (美國油類化學家學會);轉基因水稻BT63和科豐6號來自中國檢驗檢疫科學研究院；其他植物樣品均為非轉基因樣品，購自市場。IOXThermoPol緩沖液、dNTPs和MgSO4購自New EnglandBiolabs公司'Bst DNA聚合酶購自Fermentas公司；甜菜喊(Betaine)購自Sigma公司；10000 X SYBR Green I 染料購自 Invitrogen 公司，使用時 10 倍稀釋成 1000 X SYBR GreenI溶液。
[0028]實施例1:玉米樣品的檢測
1.引物設計與合成:
根據轉基因玉米品系MIR162基因序列(Genbank序列號HI203349)，設計LAMP引物組，LAMP引物組由外引物F3、內引物FIP、內引物BIP、外引物B3、環引物LF、環引物LB組成，各引物的具體序列如下:
外引物 F3:5，- ACATGTAATGCATGACGTTAT -3，SEQ ID No:1
外引物 B3:5，- GCCTTATCTGTTGCCTTCA -3，SEQ ID No:2
內引物FIP:
5’ - CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTC -3’ SEQ ID No:3
內引物BIP:
5’ - AACTAGGATAAATTATCGCGCGCCGGACGTTTTTAATGTACTGAA -3’ SEQ ID No:4
環引物 LB:5’ - TGTCATCTATGTTACTAGATCCCCG -3’SEQ ID No:5
上述引物由TAKARA公司合成。分別配制成濃度為10 Mmol/L的外引物F3溶液、10Mmol/L的外引物B3溶液，40 Mmol/L的內引物FIP溶液、40 Mmol/L的內引物BIP溶液、40Mmol/L的環引物LB溶液作為試劑盒，備用。
[0029]基因組DNA的提取:
DNA提取方法參見《分子克隆實驗指南第三版》(薩姆布魯克D.W拉塞爾著.科學出版社2002 [美]J.黃培堂等譯)。材料為轉基因玉米標準品MIR162。
[0030]等溫擴增:
3.1等溫擴增的反應體系和反應條件
以上述提取的基因組DNA為模板，進行等溫擴增反應。
[0031]等溫擴增反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入:10 X ThermoPol緩沖液2.5 μL、10 Mmol/L的外引物F3溶液0.5 μL、10 Mmol/L的外引物Β3溶液0.5 μL,40 Mmol/L的內引物FIP溶液I μL、40 Mmol/L的內引物BIP溶液I μL、40 Mmol/L的環引物 LB 溶液 I μL、5 mM甜菜堿4 μL,ΙΟ mM dNTPs 4 μL,ΙΟΟ mmol/L MgSO4 I μL,8\]/μL BstDNA聚合酶I μL、基因組DNA溶液2 μ L (上述步驟2提取)、6.5 μ L超純水，混勻后在PCR管蓋內壁加1000XSYBR Green I溶液2 μL。
[0032]其中上述IOXTh ermoPol 緩沖液為:0.1 mol/L KCl,0.2 mol/L pH 8.8的 Tris- HC1，0.1 mol/L (NH4)2SO4, 20 mmol/L MgSO4和 1% Triton X-1OO0[0033]將樣品管放入PTC-200 PCR儀(美國Bio-Rad公司)，設置反應條件為:63°C恒溫反應90 min。
[0034]等溫擴增產物的顯色檢測
擴增混合物與PCR管蓋上的熒光染料SYBR Green I顛倒混勻，肉眼觀察反應結果。
[0035]轉基因玉米MIR162品系采用上述LAMP檢測引物組擴增的產物與熒光染料混合后呈綠色，根據顯色后呈綠色還是成橙色來判斷是否含有轉基因玉米MIR162品系。呈綠色表明檢出轉基因玉米MIR162品系成分，呈橙色表明未檢出轉基因玉米MIR162品系成分。
[0036]實施例2:用于轉基因玉米MIR162品系檢測的LAMP方法的特異性確定
取其他植物物種的種子或果實13份、不同轉基因玉米品系標準品14份，非轉基因玉米1份，按上述方法分別提取基因組DNA，并進行LAMP等溫擴增，熒光染料SYBR Green I顯色法檢測結果。結果顯示只有轉基因玉米MIR162品系特異性產生綠色，檢測結果如圖1和圖2所示。
[0037]所用引物組和方法見實施例1。
[0038]圖1是應用本發明的引物組和檢測方法檢測MIR162和其他13種植物物種的實驗結果圖；管I 一 14依次為轉基因玉米MIR162(10%，即轉基因玉米MIR162質量和總的玉米質量的比值，或稱為質量百分比，以下同)、非轉基因大豆、大米、土豆、豌豆、綠豆、小麥、胡蘿卜種子、番茄、木瓜、轉基因水稻BT63、科豐6號、轉基因大豆GTS40-3-2和轉基因油菜GT73。從圖中可以看出，只有轉基因玉米MIR162呈綠色(管1)，其他樣品均為橙色。
[0039]圖2是應用本發明的引物組和檢測方法檢測14種轉基因玉米品系和非轉基因玉米的實驗結果圖；其中，管I 一 15依次為轉基因玉米MIR162(10%)、轉基因玉米59122(10%)、轉基因玉米Btll (10%)、轉基因玉米NK603 (10%)、轉基因玉米Bt_176 (5%)、轉基因玉米M0N810 (5%)、轉基因玉米M0N89034 (100%)、轉基因玉米1507 (10%)、轉基因玉米MIR604 (10%)、轉基因玉米M0N88017 (10%)、轉基因玉米98140 (10%)、轉基因玉米3272(100%)、轉基因玉米GA21 (10%)、轉基因玉米M0N863 (10%)和非轉基因玉米。從結果可以看出，只有轉基因玉米MIR162呈綠色(管I )，其他樣品均呈橙色。
[0040]從圖1和2的結果可以看出，其他植物物種、其他轉基因玉米品系和非轉基因玉米均呈橙色，沒有發生特異性擴增。實驗結果表明建立的LAMP方法具有良好的特異性，可用于轉基因玉米MIR162品系的檢測。
[0041]實施例3:用于轉基因玉米MIR162品系檢測的LAMP方法的靈敏度確定
將轉基因玉米品系MIR162標準品與非轉基因玉米種子混合，配制成轉基因玉米品系MIR162相對百分含量(w/w)為100%、10 %、5 %、1%、0.5 %、0.I %、0 %的玉米種子樣品，按上述實施例方法分別提取基因組DNA，再進行等溫擴增，顯色法檢測結果。檢測結果如圖3所示。圖3是本發明轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測方法靈敏度試驗結果圖。管I 一 7依次為轉基因玉米品系MIR162含量分別為100%、10 %、5 %、1%、0.5 %、0.1 %、0 %的玉米種子樣品的LAMP檢測結果。
[0042]所用引物組和方法見實施例1。
[0043]實驗結果顯示:轉基因玉米MIR162含量為100%、10%、5%、1%和0.5%的樣品均呈綠色，0.1 %和O %的樣品呈橙色，說明建立的LAMP方法可從轉基因玉米MIR162含量為0.5%的樣品中成功檢測出轉基因玉米MIR162，具有較高的靈敏度，符合檢測的要求。[0044]盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的范圍內 可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【權利要求】
1.一種用于檢測轉基因玉米MIR162品系的LAMP引物組，所述引物由外引物F3、外弓丨物B3、內引物FIP、內引物BIP和環引物LB組成，所述引物的堿基序列分別為SEQ ID No:I~5。
2.一種用于檢測轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:含有權利要求I所述引物組。
3.一種用于檢測轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測方法，其特征在于:包括使用權利要求I所述引物組或者權利要求2所述試劑盒的步驟。
4.權利要求3所述檢測轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測方法，其特征在于，以樣品基因組DNA為模板，利用權利要求1所述引物組或者權利要求2所述試劑盒進行等溫擴增，反應結束后用熒光染料SYBR Green I顯色，結果判定。
5.權利要求4所述檢測轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增中的反應體系為25 yL，即在0.2 mL的PCR反應管中加入:10 X ThermoPol緩沖液2.5 μL、10 Mmol/L 的外引物F3 溶液 0.5 μL、10 Mmol/L 的外引物 Β3 溶液 0.5 μL、40 Mmol/L的內引物FIP溶液I μL、40 Mmol/L的內引物BIP溶液I μL、40 Mmol/L的環引物LB溶液 I μL、5 mM 甜菜堿 4 μL,ΙΟ mM dNTPs 4 μL,ΙΟΟ mmol/L MgSO4 I μL,8\]/μL Bst DNA 聚合酶I PL、基因組DNA溶液2 yL、6.5 μ L超純水，混勻后在PCR管蓋內壁加1000 X SYBRGreen I溶液2 μL ;等溫擴增反應條件為:63°C恒溫反應90 min。
6.權利要求3所述檢測轉基因玉米MIR162品系的LAMP檢測方法，其特征在于，所述結果判定是熒光染料SYBR Green I顯色后擴增產物呈綠色即作為檢出轉基因玉米品系MIR162。`
【文檔編號】C12N15/11GK103866042SQ201410140022
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】陳雙雅, 王嘉鶴, 劉棠, 彭小莉, 許秋貝, 張永祥 申請人:陳雙雅