一種含海藻糖的牛胚胎體外培養液及培養方法
【專利摘要】本發明提供了一種含海藻糖的牛胚胎體外培養液及培養方法，所述牛胚胎體外培養液組成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL，血清白蛋白5～10mg/mL，溶劑為SOF培養液。本發明將海藻糖和大豆甙元組合應用于牛胚胎體外，相比于單獨使用海藻糖或者大豆甙元，可以顯著顯著提高體外胚胎的發育率，其經濟成本較低，便于在生產中推廣應用。
【專利說明】一種含海藻糖的牛胚胎體外培養液及培養方法
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種含海藻糖的牛胚胎體外培養液，以及利用所述牛胚胎體外培養液進行牛胚胎體外培養的方法。
(二)【背景技術】
[0002]隨著現代繁殖生物技術的發展及胚胎體外生產技術的逐步完善，利用體外受精技術生產體外胚胎呈現出潛在的廣闊應用前景。家畜胚胎體外生產尤其是體細胞核移植是快速擴大優秀種群數量的有效途徑。雖然通過體外受精技術已經獲得了活的后代，但體外受精后的早期胚胎體外發育率較低，限制了胚胎體外生產在實踐中的推廣應用。
[0003]體內早期胚胎的發育在避光、低氧氣濃度(約7%)的雌性生殖道內完成，并且有輸卵管和子宮分泌的粘液保護。但胚胎的體外培養在約含20%氧氣的培養箱中完成，這種高濃度氧氣將對體外培養的胚胎產生顯著的氧化應激。并且體外胚胎脫離了母體的保護，不僅會受到氧化應激的損傷，還面臨日光或燈光刺激、滲透壓變化等因素的影響。這些不利因素直接導致了目前體外胚胎的早期發育率顯著低于體內胚胎，已成為體外受精等胚胎體外生產技術推廣應用的一個瓶頸。
[0004]海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成的非還原性雙糖，化學性質穩定，對熱、酸都不敏感，并具有獨特的生物學特性、對生物抗脫水的保護作用、抗冷凍保護作用和抗高滲保護作用，在各種惡劣環境下，海藻糖表現出對物種的生物膜、蛋白質和核酸等生物大分子良好的保護作用。對于海藻糖的研究已有文獻報道。CN103450288A、CN103146779A、CN102965412A、CN102337313A、CN101831474A、CN1807465A 等多種專利申請公開了海藻糖的合成或純化方法。CNlOl 181279A、CN1302812C、CN100571707C、CN101443344A等多種專利公開了海藻糖在醫藥領域的用途。而CN101513221A、CN103250880A等多種專利公開了海藻糖用作動物飼料添加劑的用途。但到目前為止，尚未見有關海藻糖用于家畜繁殖【技術領域】，特別是用于胚胎體外培養的報道。
(三)
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種含海藻糖的牛胚胎體外培養液及培養方法，本申請發明人就海藻糖用于牛胚胎體外培養進行了長時間的研究，從而完成了本發明，該培養液具有緩解體外環境對早期胚胎的多種應激損傷，提高卵母細胞體外受精后胚胎發育率的功能。
[0006]本發明采用的技術方案是:
[0007]一種含海藻糖的牛胚胎體外培養液，所述牛胚胎體外培養液組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆式元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL,鏈霉素100 μ g/mL,血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養液。
[0008]所述海藻糖已有多種制取方法，屬于已知工藝和成熟技術，并已有商品出售，較為成熟的生產和銷售廠家有河南華諾海藻生物工程有限公司、武漢富瑞斯凱材料供應有限公司、廈門美拉德食品配料有限公司、Sigma公司等。本發明中所用海藻糖購自Sigma公司，純度大于98%。
[0009]所述大豆式兀已有多種制取方法,屬于已知工藝和成熟技術，并已有商品出售，較為成熟的生產和銷售廠家有西安融升生物科技有限公司、成都新基科技有限公司、Sigma公司等，本發明中所用大豆甙元購自Sigma公司。由于大豆甙元不溶于水，因此通常先用少量有機溶劑如DMSO溶解之后再進行培養基的配制。
[0010]優選的，所述培養液組成如下:
[0011]
【權利要求】
1.一種含海藻糖的牛胚胎體外培養液，其特征在于所述牛胚胎體外培養液組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆式元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL,鏈霉素100 μ g/mL,血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養液。
2.如權利要求1所述的牛胚胎體外培養液，其特征在于所述培養液組成如下:
3.利用權利要求1所述牛胚胎體外培養液進行牛胚胎體外培養的方法，所述方法包括:將受精后的早期牛胚胎用SOF培養液反復沖洗后，放入所述含海藻糖的牛胚胎體外培養液中，于38~39°C、5%C02的環境內，進行胚胎體外培養。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述早期牛胚胎由牛卵母細胞經體外成熟培養、體外受精獲得。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下: (O配制牛卵母細胞體外成熟培養液，組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL，大豆甙元0.1~10 μ g/mL,青霉素100IU/mL，鏈霉素100 μ g/mL,血清體積百分含量8%~20%，溶劑為M199培養液； (2)將牛卵母細胞體外成熟培養液在一次性塑料培養皿上形成體積為50~100μ L的培養小滴，置38~39°C環境中預熱1~3小時，牛卵母細胞經沖洗后放入預熱后的培養小滴，在38~39°C、5%C02的環境內培養20~24小時； (3)用受精培養液在一次性塑料培養皿上形成體積為50~100yL的受精小滴，置38~39°C環境中預熱1~3小時，將儲存在液氮罐中的凍精解凍，然后與步驟(2)培養后的牛卵母細胞一同放入受精小滴，在38~39°C、5%C02的環境內培養15~18小時，進行受精，得到受精后的早期胚胎； (4)配制牛胚胎體外培養液，組成如下:海藻糖0.1~1.0mg/mL,大豆甙元0.1~10μ g/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100 μ g/mL，血清白蛋白5~10mg/mL，溶劑為SOF培養液； (5)用步驟(4)牛胚胎體外培養液在一次性塑料培養皿上形成體積為50~100μ L的培養小滴，置38~39°C環境中預熱1~3小時，將受精后的早期胚胎沖洗后，放入培養小滴中，在38~39°C、5%C02的環境內培養。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)所述受精培養液為含5~lOmg/mL肝素的BO液、或者Tyrode’ s改良液。
【文檔編號】C12N5/073GK103881965SQ201410130173
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2014年4月2日
【發明者】王爭光, 李正操, 俞頌東 申請人:浙江大學