一種擬枝孢鐮刀菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種擬枝孢鐮刀菌及其應用，所述擬枝孢鐮刀菌命名為擬枝孢鐮刀菌（Fusarium?sporotrichioides）XJ-7，已于2013年5月26日保藏于位于中國武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2013231。所述應用是指該擬枝孢鐮刀菌在降解增塑劑中的應用。本發明的擬枝孢鐮刀菌能用于降解鄰苯二甲酸二辛酯，能在以鄰苯二甲酸二辛酯為唯一碳源和能源的培養基中生長。
【專利說明】—種擬枝孢鐮刀菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物種質資源應用領域，具體涉及一種擬枝孢鐮刀菌及其應用。
【背景技術】
[0002]塑料廣泛應用到人類生活的許多領域，給人們的生活帶來方便的同時，也產生了大量的環境污染。塑料生產時，為了增加其彈性和柔韌性，擴大塑料產品的應用范圍，會將大量的增塑劑添加到在其骨架結構成分如聚乙烯或聚氯乙烯中。
[0003]鄰苯二甲酸二辛酯(DOP，dioctyl phthalate)是最常用的塑料薄膜增塑劑之一。DOP綜合性能良好，混合性能好，增塑效率高,揮發性較低，低溫柔軟性較好，耐熱性和耐候性良好，是工業上最為廣泛使用的通用型增塑劑，與工業上使用的絕大多數合成樹脂和橡膠均有良好的相容性。DOP主要用于聚氯乙烯脂的加工，還可用于環氧樹脂、醋酸樹脂、ABS樹脂及橡膠等高聚物的加工，廣泛用于造漆、染料、分散劑等，在制造人造革、農用薄膜、包裝材料、電纜等許多領域廣泛應用。
[0004]由于塑料難以降解，隨著塑料的大量使用，廢塑料殘體大量存在于環境中，帶來越來越嚴重的環境污染問題。塑料中增塑劑如鄰苯二甲酸二辛酯，是通過分子間作用力與塑料骨架成分結合的，然而這種分子間作用力并不穩定，增塑劑容易通過淋溶、揮發、沉降等過程進入自然環境，可以累積在土壤、沉積物中，也可以通過土壤、水體和大氣等環境介質發生遷移、轉化，擴大污染。
[0005]鄰苯二甲酸酯類物質具有生殖、發育毒性，是環境激素類物質。我國將DOP列為優先監測污染物，而美國國家環保局(USEPA)已將DOP列為優先控制有毒污染物。通過生物富集，DOP對動物具有致癌、致突變、致畸和生殖毒性等作用；對人體具有慢性毒性、引起雌激素效應以及肥胖癥，甚至致癌。因此，為了減少和防止DOP對環境的污染，需要采取一定手段對DOP進行有效處理。
[0006]在環境污染的眾多治理方法中，生物治理越來越受到重視，其優點主要有:處理成本低廉，轉化效率高，二次污染少，條件易于控制。真菌作為可以用于環境污染處理的資源微生物，分布廣泛，種類多樣，適應性好，在生長過程中可以將分泌大量非特異性胞外酶，分解周圍的有機物為自身需要的物質和能量。人們可以根據污染物的特點，篩選有用的真菌菌株，分解特定的環境污染物。
[0007]在鍵刀菌屬中，有報道(SabevHAl, Handley PS, Robson GD..Fungal colonizationof soil-buried plasticized polyvinyl chloride (pPVC) and the impact of incorporatedbiocides.Microbiology.2006; 152 (Pt6): 1731-1739.)爺腐皮鍵刀菌(Fusarium soIani)具有分解鄰苯二甲酸二辛酯的作用，擬枝孢鐮刀菌對增塑劑鄰苯二甲酸二辛酯的降解作用尚未見報道。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一種擬枝孢鐮刀菌，該擬枝孢鐮刀菌對鄰苯二甲酸二辛酯具有較強的降解作用。
[0009]一種擬枝孢鐮刀菌，分類命名為擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotrichioides),株號為XJ-7，已于2013年5月26日保藏于位于中國武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO:M2013231。
[0010]本發明的擬枝孢鐮刀菌分離自在麥田中使用過的破舊地膜，其ITS序列如SEQ IDN0.1所示，主要生物學特征為:在PDA平板上菌落生長迅速，220C生長5天后菌落直徑可達6cm ;氣生菌絲發達，呈白色至淺黃色，在培養基中有淺紅色色素產生，菌絲寬2-4 μ m ;分生孢子梗單生或輪生，不分支 或分支；產孢細胞瓶梗狀，8-30 X 2-4 μ m ;分生孢子大小變化大，有隔膜，隔膜數0-5個；小孢子臘腸狀至紡錘形5-9 X 4-7 μ m ;大孢子鐮刀形，1-5個隔膜，17-28X3.5-5 μ m ;菌絲中或菌絲頂端細胞常出現細胞壁加厚，細胞縮短，形成厚垣孢子。
[0011]并且，該擬枝孢鐮刀菌還能以鄰苯二甲酸二辛酯為唯一碳源和能源生長。基于該生長特性，本發明還提供了一種所述擬枝孢鐮刀菌的生長培養基，包括碳源，所述碳源為鄰
苯二甲酸二辛酯。
[0012]作為優選，所述鄰苯二甲酸二丁辛酯的濃度為0.2~0.4%，更優選為0.2%。作為進一步優選，所述生長培養基的配方為=K2HPO4.3H209g、KH2P043g、MgSO4.7H200.lg、(NH4)2SO4IgJl^ 15g、鄰苯二甲酸二丁辛酯 2g、水 lOOOmL。
[0013]基于該菌的生長特性，本發明還提供了所述擬枝孢鐮刀菌在降解增塑劑中的應用，具體包括:將擬枝孢鐮刀菌的菌懸液或孢子懸液投加到被增塑劑污染的土壤或水體中。作為優選，所述增塑劑為鄰苯二甲酸二辛酯。
[0014]本發明還提供了一種含有所述擬枝孢鐮刀菌的菌劑，該菌劑可以采用菌絲或孢子制成，優選為采用孢子制成，菌劑中擬枝孢鐮刀菌孢子的濃度為1.0 X IO6~IO8個/mL。
[0015]當需要對鄰苯二甲酸二辛酯進行降解處理時，將該菌劑直接投加或經適當倍數稀釋后投加到被污染土壤或水體中即可。
[0016]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0017]本發明的擬枝孢鐮刀菌能用于降解鄰苯二甲酸二辛酯，該擬枝孢鐮刀菌能在以鄰苯二甲酸二辛酯為唯一碳源和能源的培養基中生長。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1A為XJ-7菌株的分生孢子形態圖；
[0019]圖1B為XJ-7菌株的分生孢子梗和分生孢子形態圖；
[0020]圖1C為XJ-7菌株的另一分生孢子形態圖；
[0021]圖1D為XJ-7菌株的另一分生孢子梗和分生孢子形態圖；
[0022]圖1E為XJ-7菌株的又一分生孢子形態圖；
[0023]圖1F為XJ-7菌株的又一分生孢子梗和分生孢子形態圖；
[0024]圖1G為XJ-7菌株著生分生孢子的分生孢子梗形態圖；
[0025]圖1H為XJ-7菌株在菌絲頂端形成的厚垣孢子形態圖；
[0026]圖1I為XJ-7菌株在菌絲頂端形成的又一厚垣孢子形態圖；
[0027]圖1J為XJ-7菌株在菌絲中段形成的厚垣孢子形態圖；[0028]圖1A ~IJ 中，標尺=IOym;
[0029]圖2Α為XJ-7菌株在PDA培養基上生長7天的菌落形態圖(正面)；
[0030]圖2Β為XJ-7菌株在PDA培養基上生長7天的菌落形態圖(反面)；
[0031]圖3Α為XJ-7菌株在含DOP的基本培養基上生長14天的菌落形態圖；
[0032]圖3Β為XJ-7菌株在不含DOP的基本培養基上生長14天的菌落形態圖。
【具體實施方式】
[0033]實施例1菌株分離
[0034]1、培養基配制
[0035](I)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar, PDA):在馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000mL ;然后進行常規的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121°C下滅菌 20min)。
[0036](2) 2%水瓊脂(WA)培養基:瓊脂粉20g、水1000mL,進行常規的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0037](3)基本培養基=K2HPO4.3Η209δ,ΚΗ2Ρ043δ,MgSO4.7Η200.lg、(NH4)2S04lg、瓊月旨 15g、 水lOOOmL，進行常規的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0038]2、菌株分離
[0039]XJ-7菌株的采集地點是我國新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州昌吉市(東經80。12’13.68’’，北緯120。7’11.28’’)小麥田中使用過的地膜，其分離步驟為:
[0040](I)采集麥田中使用過的破舊地膜，帶回實驗室中，用自來水漂洗干凈，再用無菌水漂洗3次；
[0041](2)處理后的地膜用無菌刀片切成3X3cm2的小塊,置于含50 μ g/mL氨節青霉素和50 μ g/mL鏈霉素的2%水瓊脂(WA)平皿上，25°C暗培養3天；
[0042](3)然后將平板置于無菌操作臺上，置于解剖鏡下檢查，將在地膜上長出的菌絲用挑針接種到直徑為6cm的PDA培養基平板上，繼續培養7天；
[0043](4)取5ml無菌水加到步驟(3)的培養皿中，用滅菌的涂布棒輕輕涂布以洗下孢子，吸取ImL孢子液到1.5mL離心管中，取100 μ L孢子液滴在血球計數板上,顯微鏡下計數；
[0044](5)根據計數結果，取100 μ L孢子液加到一個新的1.5mL離心管中，加適量無菌水配成濃度為2000個孢子/mL的孢子液；將IOOmL的2%水瓊脂(WA)培養基融化后，室溫冷卻至5(TC,再加入氯霉素儲備液(34mg/mL)和鏈霉素儲備液(10mg/mL)各100 μ L,混勻后倒平板；在已經倒好的含氯霉素和鏈霉素水瓊脂平板上均勻涂布50 μ L濃度為2000個孢子/mL的孢子液,培養2天；
[0045](6)在倒置顯微鏡下，在步驟(5)獲得的平板上找到單個孢子萌發形成的小菌落，用挑針轉移到新的PDA平板上，25°C培養5天，得到單孢分離的純培養物；通過這種方法分離得到了 230株真菌純培養物；
[0046](7)將分離得到的真菌純培養物分別接種在含有0.2%D0P的基本培養基上培養7天，發現菌株XJ-7生長出菌絲；將菌株XJ-7保存在PDA培養基上。
[0047]3、菌株鑒定[0048](I)形態鑒定
[0049]XJ-7經過單孢分離純化后，接種到PDA培養基上，22°C培養7天。用挑針挑取少量菌體，制成玻片，在顯微鏡下觀察，測量，拍照。分生孢子和分生孢子梗形態如圖1所示，菌落生長狀態如圖2所示。
[0050]其形態特征為:在PDA平板上菌落生長迅速，22°C生長5天后菌落直徑可達6cm ；氣生菌絲發達，呈白色至淺黃色，在培養基中有淺紅色色素產生，菌絲寬2-4 μ m ;分生孢子梗單生或輪生，不分支或分支；產孢細胞瓶梗狀，8-30 X 2-4 μ m;分生孢子大小變化大，有隔膜，隔膜數0-5個；小孢子臘腸狀至紡錘形，5-9X4-7 μ m ;大孢子鐮刀形，1-5個隔膜，17-28 X 3.5-5 μ m ;菌絲中或菌絲頂端細胞常出現細胞壁加厚，細胞縮短，形成厚垣孢子。
[0051](2)分子鑒定
[0052](2.1) DNA 提取
[0053]I)在PDA平板上22°C培養XJ-7菌株7天后，用牙簽刮取平板上的菌絲，放入已滅菌的含有300 μ L提取緩沖液1.5mL離心管中；
[0054]提取緩沖液的配方為:1MKCl，IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA, ρΗ=8.0 ；
[0055]2)將挑取的菌絲用電磨機研碎，然后再加入300 μ L提取緩沖液，劇烈震蕩2min ；
[0056]3) 1000Orpm 離心 IOmin ；
[0057]4)吸取上清液，轉移至另一新的離心管中，棄沉淀；
[0058]5)在上清液中加入等體積的異丙醇(分析純)，輕輕顛倒混勻數次后，12000rpm離心IOmin,沉淀核酸；
[0059]6)輕輕倒去上清液，將含有沉淀的離心管倒置在吸水紙上排干水分；
[0060]7)再加入300 μ L70%乙醇，輕輕顛倒混勻數次后，12000rpm離心2min ；
[0061]8)輕輕倒去上清液，重復步驟(7) 一次；
[0062]9)將離心管倒置在吸水紙上排干水分，置于37°C下15min，使乙醇充分揮發；
[0063]10)用50 μ L ddH20重懸沉淀，得到XJ-7基因組DNA，濃度達到30ng/ μ L。
[0064](2.2)真菌ITS rDNA基因的PCR擴增
[0065]PCR擴增在50 μ L反應體系中進行，體系中含有:上下游引物各2 μ M，dNTPs200 μ M, MgCl2L 5mM, 10 XPCR buffer5 μ L,模版 DNA2 μ L, Taq 酶 2U。
[0066]上游引物ITSl 序列為:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，
[0067]下游引物ITS4 序列為:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0068]PCR擴增反應在朗基MG96G型PCR儀上進行。反應條件:94°C預變性2min，然后35個循環包括:94°C變性30sec，55°C退火40sec，72°C延伸lmin。最后72°C后延伸lOmin。
[0069](2.3) PCR產物的回收純化
[0070]PCR反應結束后，PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用愛思進生物技術公司的DNA凝膠純化試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進行，步驟如下:
[0071] I)將50 μ L PCR產物全部加到1%的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，按5V/CM的電泳條件電泳30min ；
[0072]2)電泳結束后，在紫外燈下用刀片切取含目的DNA片段的凝膠，置于2mL離心管中,稱重；
[0073]3)按照Img凝膠加入3mL的DE-A緩沖液的標準，加入DE-A緩沖液到收集凝膠的2mL離心管中，75°C保溫lOmin，期間振蕩數次，至完全融化；
[0074]4)加入0.5倍DE-A體積的DE-B緩沖液，混合均勻；
[0075]5)將DNA制備管放入2mL離心管中，將混合液轉移到DNA制備管中，12000rpm離心lmin,棄上清；
[0076]6)將DNA制備管放回2mL離心管中，加500 μ L緩沖液Wl, 12000rpm離心30s ；
[0077]7)將DNA制備管放回2mL離心管中，加700 μ L緩沖液W2, 12000rpm離心30s ；
[0078]8 )重復步驟(7 ) 一次；
[0079]9)將DNA制備管放回2mL離心管中，12000rpm離心2min。以排干膜上洗滌液；
[0080]10)將DNA制備管放回2mL離心管中，加50 μ L的ddH20, 1000Orpm離心lmin,洗脫DNA置-20°C下保存。
[0081](2.4)基因的測序和序列分析
[0082]經電泳檢測后的已經純化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型自動測序儀進行測序。測序結果經過嚴格核對后，得到如SEQ ID N0.1所示的長度為498bp的DNA片段序列。
[0083]在NCBI網站上，將測得的核苷酸序列用BLAST在GenBank數據庫中查找和比對同源或相似的核苷酸序列 。根據同源序列的數據庫注釋，再結合菌株的形態結構來判斷所研究菌株的種屬。經過BLAST比對，該序列與登錄號為KC254054和FJ614629的序列覆蓋率100%，相似度達到99%。這兩個序列都是來自枝孢鐮刀菌菌(即Fusariumsporotrichioides)的ITS rDNA。這些結果表明分子鑒定與形態鑒定結果相符。
[0084]至此推斷XJ-7菌株為擬枝孢鐮刀菌，對該菌株進行了如下保藏:保藏名稱為:擬枝孢鐮刀菌菌株XJ-7 (Fusarium sporotrichioides),保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學；保藏日期:2013年5月26，保藏號:CCTCC No:M2013231。
[0085]實施例2XJ-7對DOP的降解利用
[0086]在實施例1的基本培養基中加入終濃度0.2%的鄰苯二甲酸二丁辛酯，獲得本實施例的生長培養基。
[0087]在PDA培養基上接種菌株XJ_7，25°C培養7天，從菌落邊緣挑取約3X 3cm2的菌塊，置于含有上述生長培養基的平板中央(直徑9cm)，以不加DOP的基本培養基為對照，置于25°C培養10天，觀察菌株XJ-7的生長情況，觀察結果見圖3。
[0088]由圖3可見，培養10天后，在含有DOP的固體培養基上，菌株XJ-7的氣生菌絲明顯生長，且菌落中央的菌絲明顯比菌落邊緣的濃密；而在不含DOP的基本培養基上，沒有菌株XJ-7生長。表明XJ-7可以降解DOPJf DOP作為唯一碳源和能源加以分解利用，為自身菌絲生長和產孢提供碳素營養。
【權利要求】
1.一種擬枝孢鐮刀菌，其特征在于，命名為擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotrichioides) XJ-7，保藏編號為 CCTCC NO:M2013231。
2.一種如權利要求1所述擬枝孢鐮刀菌的生長培養基，包括碳源，其特征在于，所述碳源為鄰苯二甲酸二丁辛酯。
3.如權利要求2所述的生長培養基，其特征在于，所述鄰苯二甲酸二辛酯的濃度為0.2 ~0.4%。
4.如權利要求2所述的生長培養基，其特征在于，所述鄰苯二甲酸二辛酯的濃度為0.2%。
5.一種含有如權利要求1所述擬枝孢鐮刀菌的菌劑。
6.如權利要求5所述的菌劑，其特征在于，菌劑中擬枝孢鐮刀菌孢子的濃度為1.0X IO6 ~IO8 個/mL。
7.如權利要求1所述擬枝孢鐮刀菌在降解增塑劑中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，包括:將擬枝孢鐮刀菌的菌懸液或孢子懸液投加到被增塑劑污染的土壤或水體中。
9.如權利要求7或8所述的應用，其特征在于，所述增塑劑為鄰苯二甲酸二辛酯。
【文檔編號】C12N1/14GK104004659SQ201410130131
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2014年4月2日
【發明者】王洪凱, 林福呈 申請人:浙江大學