重組桿狀病毒及其應用的制作方法

重組桿狀病毒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供整合了編碼γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及編碼DT-黃遞酶（NQO1）的基因的重組桿狀病毒。
【專利說明】重組桿狀病毒及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及重組桿狀病毒及含所述病毒的重組型維生素K依賴性蛋白質的制造用試劑盒。另外，本發明也涉及感染了重組桿狀病毒的宿主細胞。再者，本發明也涉及重組型維生素K依賴性蛋白質的制造方法。

【背景技術】
[0002]維生素K是擔負各種維生素K依賴性蛋白質的翻譯后修飾的Y-谷氨酰羧化酶(GGCX)的輔因子。在維生素K的存在下，GGCX將各種維生素K依賴性蛋白質的指定的谷氨酸殘基羧基化，轉變為Y-羧基谷氨酸(Gla)。已知此Y-谷氨酰羧基化對于維生素K依賴性蛋白質的生物學功能(例如，血液凝固、骨代謝、信號傳遞等)極其重要。例如，作為維生素K依賴性蛋白質之一的血液凝固第II因子(凝血酶原)或第X因子通過Y-谷氨酰羧基化，能夠向作為凝固反應的場所的細胞膜的磷脂結合，由此可接受由于其他因子開始的活化反應。
[0003]第II因子或如第X因子這樣的維生素K依賴性凝血因子主要用人或牛的血漿作為原料進行制備，由此存在混入感染性物質或制品的批間有差異的問題。因此，近年研究一開發了通過利用哺乳動物細胞的基因重組技術制造維生素K依賴性凝血因子的方法。
[0004]但是，已知通過利用哺乳動物細胞的表達系統得到的維生素K依賴性凝血因子完全不被Y-谷氨酰羧基化。由于活化不被Y-谷氨酰羧基化的凝血因子通常是困難的，因此從產業上利用的觀點來看，期望重組維生素K依賴性凝血因子在用表達蛋白質的系統得到的階段就被充分地Y-谷氨酰羧基化。因此開發了，在利用哺乳動物細胞的表達系統中，通過共表達維生素K依賴性蛋白質和GGCX來得到Y -谷氨酰羧基化蛋白質的方法(參照W02005/038019)。
[0005]另一方面，在維生素K依賴性蛋白質的Y-谷氨酰羧基化中，除了 GGCX之外，已知維生素K環氧化物還原酶(VKOR)和DT-黃遞酶(NAD (P)H依賴性醌氧化物還原酶I ;也被稱為 NOQl)也相關(參見 Tie J-K.等人，Blood, vol.117，ρ.2967-2974 (2011))。其中，與
Y-谷氨酰羧基化直接相關的酶是GGCX，VKOR及NQOl是與維生素K的再循環相關的酶，近年也開發了在利用哺乳動物細胞的表達系統中，通過共表達維生素K依賴性蛋白質、GGCX及VKOR來得到Y -谷氨酰羧基化蛋白質的方法(參照W02006/067116)。
[0006]發明概述
[0007]由于上述的方法均使用利用哺乳動物細胞的表達系統，Y-谷氨酰羧基化蛋白質的產量從工業規模的制造的觀點來看極其少，另外還有制造成本高的問題。
[0008]另一方面已知用利用大腸桿菌的表達系統，可期待大量表達期望的蛋白質，但是所表達的蛋白質并未進行翻譯后修飾。此外還知道，在使其表達結構復雜的蛋白質時，所述蛋白質幾乎全部變成不溶性凝集體。另外，用以往的利用鱗翅目昆蟲的表達系統可期待表達接近天然型蛋白質的翻譯后修飾的蛋白質，但在本發明人的預備實驗中，在蠶中表達的維生素K依賴性蛋白質幾乎未被Y-谷氨酰羧基化。
[0009]鑒于上述這樣的情況，本發明人以提供制造滿足下述兩個條件的重組型維生素K依賴性蛋白質的手段作為課題:可簡便并且大量地制造維生素K依賴性蛋白質、和所得到的維生素K依賴性蛋白質被充分地Y-谷氨酰羧基化。
[0010]本發明人發現，使用整合有編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒、和整合有編碼維生素K依賴性蛋白質的基因的重組桿狀病毒的鱗翅目昆蟲的表達系統，可簡便并且大量地得到維生素K依賴性蛋白質，所得到的維生素K依賴性蛋白質被充分地
Y-谷氨酰羧基化，從而完成本發明。
[0011]本發明提供整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶(GGCX)的基因及編碼DT-黃遞酶(NQOl)的基因的重組桿狀病毒。
[0012]本發明提供重組型維生素K依賴性蛋白質的制造方法。此方法包括下述步驟:使用整合有編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒，在鱗翅目昆蟲或上述鱗翅目昆蟲的培養細胞中表達Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。
[0013]本發明通過利用鱗翅目昆蟲或該鱗翅目昆蟲的培養細胞的表達系統，可簡便并且大量地制造Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:是顯示蠶來源的培養細胞中的各蛋白質的表達量的照片，所述蠶來源的培養細胞是被用于將GGCX、NQ01及VKOR分別單獨表達，或者將它們之中的2種共表達的重組桿狀病毒的感染的細胞。
[0015]圖2:圖2A是顯示在感染了實施例1中制作的各種的重組桿狀病毒，和用于表達人第X因子的重組桿狀病毒的蠶幼蟲中的人第X因子的表達量的照片，圖2B是顯示表達的人第X因子的Y-谷氨酰羧基化的程度的照片。
[0016]圖3:圖3A是顯示在感染了用于共表達GGCX及NQOl的重組桿狀病毒，和用于表達人凝血酶原的重組桿狀病毒的蠶蛹中的人凝血酶原的表達量的照片，圖3B是顯示表達的人凝血酶原的Y-谷氨酰羧基化的程度的照片。
[0017]圖4:圖4A是顯示在感染了實施例1中制作的各種的重組桿狀病毒，和用于表達人第X因子的重組桿狀病毒的蠶幼蟲中的人第X因子的表達量的照片，圖4B是顯示表達的人第X因子的Y-谷氨酰羧基化的程度的照片。
[0018]發明詳述
[0019]以下參照附圖描述本發明的優選的實施方式。
[0020]本發明的重組桿狀病毒整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因，可在鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞中共表達GGCX及NQ01。本發明的重組桿狀病毒可在鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞中表達Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質時適宜地使用。即，通過用本發明的重組桿狀病毒，和整合編碼希望的維生素K依賴性蛋白質的基因的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞，可在該昆蟲或培養細胞中大量地表達Y -谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。
[0021]在本說明書中，維生素K依賴性蛋白質是指，在維生素K的存在下，由GGCX羧基化指定的谷氨酸殘基而將其變換為Gla的蛋白質。作為那樣的蛋白質，可舉出例如，維生素K依賴性凝血因子、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、增殖抑制特異性蛋白質6及棘蛇亞科(Acanthophiinae) FXa樣蛋白等。另外,維生素K依賴性凝血因子只要是通過被Y _谷氨酰羧基化而活化，或者能接受活化反應的凝血因子，就沒有特別限定，可舉出例如，凝血酶原(第II因子)、第VII因子、第IX因子、第X因子、蛋白C、蛋白S、蛋白Z等。
[0022]在本發明的實施方式中，編碼GGCX的基因(以下，也稱為“GGCX基因”)只要是從具有GGCX的期望的生物種來源的GGCX基因，就沒有特別限定，優選為人GGCX基因，更優選為編碼SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的基因。再有，人GGCX基因的堿基序列本身是公知的，例如，可在由美國國立醫學圖書館的國立生物信息中心(Nat1nal Center forB1technology Informat1n:NCBI )提供的數據庫，以登記號EU847509訪問。或者，作為GGCX基因，也可使用編碼與野生型GGCX有同等的生物活性的變異型GGCX的基因。
[0023]在本發明的實施方式中，編碼NQOl的基因(以下，也稱為“NQ01基因”)只要是從有NQOl的期望的生物種來源的NQOl基因，就沒有特別限定，優選為人NQOl基因，更優選為編碼SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列的基因。再有，人NQOl基因的堿基序列本身是公知的，例如，在由NCBI提供的數據庫，以登記號AK312368訪問。或者，作為NQOl基因，也可使用編碼與野生型NQOl有同等的生物活性的變異型NQOl的基因。
[0024]在本發明的重組桿狀病毒的DNA中的GGCX基因及NQOl基因的位置是只要各基因所編碼的酶在鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養細胞中表達，就沒有特別限定。從而，在本發明的重組桿狀病毒的DNA中，GGCX基因及NQOl基因可連續插入，也可在互相分離的位置插入。當這些基因連續插入到桿狀病毒DNA時，GGCX及NQOl作為融合蛋白質表達。再有，GGCX基因及NQOl基因之中，將任何一方作為上游，沒有特別限定。另一方面，GGCX基因及NQOl基因在桿狀病毒DNA中插入到互相分離的位置時，GGCX及NQOl分別作為個別的蛋白質表達。在本發明的實施方式中，GGCX基因及NQOl基因在桿狀病毒DNA中插入到互相分離的位置是優選的。
[0025]在本發明的實施方式中，桿狀病毒的種類只要是可感染鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞的病毒，就沒有特別限定，優選為核多角體病病毒(NPV)或其改變型病毒。作為那樣的病毒，可舉出例如BmNPV、HycuNPV, AnpeNPV, AcNPV、蠶蛾科的蠶(Bombyx mori)或夜蛾科的苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)等的兩宿主感染的重組桿狀病毒(參照特開2003-52371號公報)等。在優選的實施方式中，使用半胱氨酸蛋白酶缺損(CPd)桿狀病毒(參照特愿平7-303488號)。
[0026]本發明的重組桿狀病毒可由本領域公知的方法制作。作為那樣的方法，可舉出例如，使用可由同源重組將希望的基因插入桿狀病毒DNA的轉移載體的方法。此方法中，將整合了希望的基因的轉移載體，和由限制性內切酶等線性化的桿狀病毒DNA共轉染到鱗翅目昆蟲的培養細胞中，通過篩選感染細胞，可得到重組桿狀病毒。
[0027]在本發明的實施方式中，轉移載體只要是有使在鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養細胞中的基因表達成為可能的啟動子，可在該啟動子的下游插入希望的基因的載體DNA，就沒有特別限定。本領域公知那樣的轉移載體本身，可舉出例如PM02、pM23、pCPM、pYNG、pBM030、pBM050、pVL1392等。再有，上述的啟動子可從本領域公知的啟動子適宜選擇，可舉出例如，多角體蛋白啟動子、PlO啟動子、蠶肌動蛋白啟動子等。
[0028]使用轉移載體制作本發明的重組桿狀病毒時，GGCX基因及NQOl基因可整合到相同的轉移載體中，也可分別整合到個別的轉移載體中。當將GGCX基因及NQOl基因分別整合進個別的轉移載體中時，這2種轉移載體優選為可將各基因整合到桿狀病毒DNA中的互相不同的位置的載體的組合。作為那樣的載體的組合，可舉出例如，可將桿狀病毒DNA的多角體蛋白基因部位重組為希望的基因的轉移載體，和可將桿狀病毒DNA的半胱氨酸蛋白酶基因部位重組為希望的基因的轉移載體的組合。
[0029]在本發明的實施方式中，根據需要，也可向GGCX及NQOl融合蛋白質分泌信號序列。即，在本發明的重組桿狀病毒中，也可將編碼蛋白質分泌信號序列的基因再分別整合到GGCX基因及NQOl基因的上游或下游。那樣的蛋白質分泌信號序列，可根據重組型維生素K依賴性蛋白質的種類等，在利用鱗翅目昆蟲的表達系統中，從使用的公知的序列適宜選擇。可舉出例如，凝血酶原來源分泌信號序列(SEQ ID NO: 3)、蠶來源30K信號序列(SEQID NO:4)及蠶來源SP信號序列(SEQ ID NO: 5)等。
[0030]在本發明的實施方式中，根據需要，也可向GGCX及NQOl融合功能性標簽。即，在本發明的重組桿狀病毒中，也可將編碼功能性標簽的基因再分別整合到GGCX基因及NQOl基因的上游或下游。作為那樣的功能性標簽的種類，特別優選蛋白質純化用標簽，可舉出例如，FLAG標簽、6 X Hi s標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶標簽、麥芽糖結合蛋白質標簽等。
[0031]在本發明的別的實施方式中，也可向整合了 GGCX基因及NQOl基因的重組桿狀病毒再整合有編碼維生素K依賴性蛋白質的基因。此時，編碼維生素K依賴性蛋白質的基因，在桿狀病毒DNA中，以可表達的方式整合到與GGCX基因及NQOl基因分離的位置是優選的。即，維生素K依賴性蛋白質作為與GGCX及NQOl個別的蛋白質表達。通過這樣的重組桿狀病毒，使得單獨用該病毒在鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞中大量地表達Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質成為可能。
[0032]在本發明的范圍內還包括，通過用上述的本發明的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲的培養細胞而得到的宿主細胞。
[0033]在本發明的實施方式中，鱗翅目昆蟲只要是適宜于重組蛋白質的表達的公知的鱗翅目昆蟲，就沒有特別限定，可舉出例如，蠶(Bombyx mori)、黃領麻紋燈蛾(Spilosomaimpari I is)、作香(Antheraea pernyi )、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等。在它們之中，特別優選蠶。再有，鱗翅目昆蟲可以是成蟲、蛹及幼蟲中的任何一種形態，但從絲氨酸蛋白酶的活性和對桿狀病毒的感受性的角度來看，優選使用蛹或幼蟲。另外，作為鱗翅目昆蟲的培養細胞，只要是由適宜于重組型蛋白質的表達的鱗翅目昆蟲建立的細胞株，就沒有特別限定，可舉出例如BmN、BmN4、SpIm、Anpe、Sf9、Sf21、High5 等。
[0034]用本發明的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或此鱗翅目昆蟲的培養細胞的手段沒有特別限定，可從本領域公知的方法適宜選擇。例如，當感染鱗翅目昆蟲時，可舉出將含重組桿狀病毒的液體注射進該昆蟲的方法等。另外，當感染培養細胞時，也可將含重組桿狀病毒的液體添加到培養基中。向鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞感染重組桿狀病毒起飼育或培養5~8天，則在宿主細胞中，重組蛋白質表達。
[0035]在本發明的實施方式中，可在向鱗翅目昆蟲或此鱗翅目昆蟲的培養細胞感染整合了 GGCX基因及NQOl基因的重組桿狀病毒之后，再感染整合編碼希望的維生素K依賴性蛋白質的基因的重組桿狀病毒。
[0036]在本發明的范圍內包括整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒，也包括重組維生素K依賴性蛋白質的制造用試劑盒(以下，也簡稱為“試劑盒”)。再有，對于此重組桿狀病毒而言，與對于本發明的重組桿狀病毒所描述的內容相同。
[0037]在本發明的實施方式中，優選重組桿狀病毒再整合編碼維生素K依賴性蛋白質的基因。即，在桿狀病毒DNA中，整合有GGCX基因、NQOl基因及編碼維生素K依賴性蛋白質的基因這3種。對于此實施方式的重組桿狀病毒而言，與對于本發明的重組桿狀病毒所描述的內容相同。
[0038]在別的實施方式中，本發明的試劑盒優選還含有整合編碼維生素K依賴性蛋白質的基因的重組桿狀病毒。再有，此桿狀病毒，除了作為希望的基因使用編碼維生素K依賴性蛋白質的基因以外，可如本發明的桿狀病毒同樣方式地制作。其中，整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒也稱為“第I桿狀病毒”，整合了編碼維生素K依賴性蛋白質的基因的重組桿狀病毒也稱為“第2桿狀病毒”。在此實施方式的試劑盒中，第I桿狀病毒和第2桿狀病毒可在分開的容器中保存，也可將兩者混合而在I個容器中保存。再有，將第I桿狀病毒和第2桿狀病毒混合保存時，兩者的混合比例沒有特別限定，但優選按照病毒效價1:1來混合。
[0039]在本發明的范圍內包括重組型維生素K依賴性蛋白質的制造方法(以下，也簡稱為“制造方法”)，其包括下述步驟:使用整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒，將Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質在鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養細胞中表達。再有，對于此重組桿狀病毒、鱗翅目昆蟲及此昆蟲的培養細胞而言，與對本發明的重組桿狀病毒所描述的內容相同。
[0040]在本發明的實施方式中，優選重組桿狀病毒再整合編碼維生素K依賴性蛋白質的基因。對于此實施方式的重組桿狀病毒而言，與對本發明的重組桿狀病毒所描述的內容相同。或者，與整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒(第I桿狀病毒)一同使用整合編碼維生素K依賴性蛋白質的基因的重組桿狀病毒(第2桿狀病毒)是優選的。
[0041]在本發明的制造方法中，可通過用上述的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養細胞來表達Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。再有，感染手段與對本發明的宿主細胞所描述內容相同。
[0042]在本發明的制造方法中，當使用第I桿狀病毒及第2桿狀病毒時，可同時感染到鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養細胞，也可在感染其中一種重組桿狀病毒之后，再感染另一種重組桿狀病毒。此時，從第1次的感染I周之內進行第2次的感染是優選的。再有，第I桿狀病毒和第2桿狀病毒的使用量的比例沒有特別限定，但優選為病毒效價為1:1的量。
[0043]通常，可通過向鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞感染重組桿狀病毒起飼育或培養5~8天來表達Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。在本發明的實施方式中，從表達目的蛋白質的鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養細胞取得該蛋白質的手段沒有特別限定。例如，使用鱗翅目昆蟲時，可通過采集體液，或者將該昆蟲破碎而制備勻漿來取得Y -谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。另外，使用培養細胞時，可通過將該細胞物理性破碎，或者在含表面活性劑等的細胞溶解劑的溶液中溶解來取得Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質。
[0044]在本發明的制造方法中，根據需要，可再包括從上述的表達步驟得到的鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養細胞取得含Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質的可溶性級分的步驟。可通過將如上述一樣得到的鱗翅目昆蟲的體液或勻漿、或者細胞破碎液或細胞裂解物過濾或離心，分離上清而得到可溶性級分。再有，離心時，也可向樣品任意地添加適當的緩沖液。那樣的緩沖液只要是適宜于蛋白質的保存，就沒有特別限定，可舉出例如，TriS緩沖液、磷酸緩沖液等。
[0045]接下來，通過實施例詳細地說明本發明，但本發明不限于這些實施例。
實施例
[0046]實施例1:重組桿狀病毒的制作及表達的探討
[0047](I)分別編碼GGCX、NQOl及VKOR的基因的亞克隆
[0048]基于已經報告的人GGCX基因的堿基序列(NCBI Acc.N0.EU847509)、人NQOl基因的喊基序列(NCBI Acc.N0.AK312368)及人VKOR基因的喊基序列(NCBI Acc.N0.AY521634)，設計用于亞克隆各基因的引物組。下面顯示了各引物的堿基序列。再有，在各引物各自附加適宜的限制性內切酶位點的堿基序列。
[0049](i) GGCX基因用引物組
[0050]F:5’-GGGGTACCATGGCGGTGTCTGCCGGGTCCGC-3’(SEQ ID NO:6)
[0051]R:5，-GCTCTAGAGAACTCTGAGTGGACAGGATCA-3’(SEQ ID NO:7)
[0052](ii) NQOl基因用引物組
[0053]F:5’-GAAGATCTATGGTCGGCAGAAGAGCACTGATCGTA-3’(SEQ ID NO:8)
[0054]R:5’-GCTCTAGATTTTCTAGCTTTGATCTGGTTGTCAGTT-3’(SEQ ID NO:9)
[0055](iii) VKOR基因用引物組
[0056]F:5’-GGGGTACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT-3’ (SEQ ID NO:10)
[0057]R:5’-GCTCTAGATCAGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG-3’ (SEQ ID NO:11)
[0058]使用上述的引物組，通過以人肝臟cDNA庫(clontech公司)作為模板的PCR法分離GGCX基因、NQOl基因及VKOR基因。將分離的各基因的DNA片段使用QIAquick (QIAGEN公司)純化，用限制性內切酶(GGCX =KpnI及Xba1、NQOl:XbaI, VKOR =KpnI及XbaI)處理。將得到的各片段整合到PM23載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點。將得到的質粒構建體各自稱為pM-GGCX、pM-NQ01及pM_VK0R。這些的質粒是Polh部位重組用轉移質粒。另外，將上述的限制性內切酶處理后的各DNA片段整合到pCPM載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點。將得到的質粒構建體各自稱為pCPM-GGCX、pCPM-NQ01及pCPM_VK0R。這些質粒是CP部位重組用轉移質粒。
[0059]再有，上述的轉移質粒均在導入基因的下游整合有編碼FLAG標簽的基因，所以在使用各轉移質粒表達的蛋白質的C末端融合有FLAG標簽。
[0060](2)重組桿狀病毒的制作
[0061](2-1)單獨表達病毒的制作
[0062]制作用于分別單獨表達GGCX、NQOl及VKOR的重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的制作是將 Maeda 等的方法(InverterbrateCell system 及 Applicat1ns, Vol.1，p.167-181，CRC Press, Boca Raton (1989))改變而進行。具體而言如下。首先，將上述的Polh部位重組用轉移質粒用質粒純化試劑盒(QIAGEN公司)純化。然后，將各轉移質粒(0.5μ g)和直鏈化的CPd桿狀病毒(ATCC VR2500)的DNA (0.2μ g)使用脂轉染試劑(X-tremeGENE9DNA轉染試劑:Roche公司)共轉染進BmN細胞(Maeda，1989)。篩選通過利用96孔板的有限稀釋法進行，挑選確認感染跡象的病毒，回收培養上清。由此，得到分別整合GGCX基因、NQOl基因及VKOR基因的重組桿狀病毒。將得到的病毒分別稱為GGCX單獨表達病毒、NQOl單獨表達病毒及VKOR單獨表達病毒。
[0063](2-2)共表達病毒的制作
[0064]制作用于分別共表達GGCX及NQOl、以及GGCX及VKOR的各自的組合的重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的制作通過改變上述(2-1)的方法來進行。具體而言如下。將上述的Polh 部位重組用轉移質粒及CP部位重組用轉移質粒由質粒純化試劑盒(QIAGEN公司)純化。然后，將各Polh部位重組用轉移質粒(0.5 μ g)、各CP部位重組用轉移質粒(0.5 μ g),和 5cut CPd 桿狀病毒(ATCC VR2500)的 DNA (0.2 μ g)，使用脂轉染試劑(X_tremeGENE9DNA轉染試劑=Roche公司)共轉染進BmN細胞(Maeda，1989)。篩選通過利用96孔板的有限稀釋法進行，挑選確認感染跡象的病毒，回收培養上清。由此，得到分別整合GGCX基因、NQOl基因及VKOR基因的重組桿狀病毒。將得到的病毒分別稱為GGCX/NQ01共表達病毒及GGCX/VKOR共表達病毒。
[0065](3) BmN細胞中的標簽融合凝血酶原的表達的探討
[0066]回收上清后，制備BmN細胞的裂解物。對于得到的裂解物，用SDS-PAGE及使用抗FLAG抗體(和光純藥工業株式會社)的蛋白印跡進行解析。結果示于圖1。由圖1確認，BmN裂解物中表達具有被預測為是GGCX、NQOl及VKOR的分子量的蛋白質。
[0067]實施例2:蠶中的維生素K依賴性蛋白質的表達及Y -谷氨酰谷氨酰羧基化的探討
[0068](I)分別編碼第X因子及凝血酶原的基因的亞克隆
[0069]基于數據庫中公開的人第X因子基因(以下，也稱為hFX基因)的堿基序列(NCBIAcc.N0.BC_040125)及人凝血酶原基因(以下，也稱為hPTH基因)的堿基序列(NCBI Acc.N0.NM_000506)，設計用于克隆各基因的引物組。以下顯示各引物的序列。再有，向各引物分別附加適宜的限制性內切酶位點的堿基序列。
[0070](i) hFX基因用引物組
[0071]F:5’-AAGGTACCCGGGGATCCATGGGGCGCCCACTG-3’ (SEQ ID NO:12)
[0072]R:5’-AATCTAGATCACTTTAATGGAGAGGACGTTAT-3’ (SEQ ID NO:13)
[0073](ii)hPTH基因用引物組
[0074]F:5’-AAGAATTCATGGCCAACACCTTCTTGGAGGAG-3’ (SEQ ID NO:14)
[0075]R:5’-AATCTAGACTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTT-3’ (SEQ ID NO:15)
[0076]使用上述的引物組，通過以人肝臟cDNA庫(clontech公司)作為模板的PCR法分離hFX基因及hPTH基因。將分離的DNA片段使用QIAquick (QIAGEN公司)進行純化，用限制性內切酶KpnI及XbaI處理之后，整合到pM23載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點。將得到的質粒構建體分別稱為PM-FX及pM-PTH。
[0077](2)重組桿狀病毒的制作
[0078]制作用于分別單獨表達第X因子及凝血酶原的重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的制作是，使用PM-FX及pM-PTH，如上述實施例1的(2-1)同樣地進行。由此得到分別整合第X因子基因及凝血酶原基因的重組桿狀病毒。將得到的病毒分別稱為FX單獨表達病毒及PTH單獨表達病毒。
[0079](3)維生素K依賴性蛋白質的表達及Y-谷氨酰羧基化
[0080](3-1)人第X因子
[0081](i)人第X因子的表達及Y-谷氨酰羧基化的探討
[0082]將FX單獨表達病毒，和上述的實施例1中制作的各表達病毒混合至病毒效價為1:1的比率,將其接種于蠶幼蟲(品種:近秋錦和。從上田蠶種公司購入蠶卵，由Sysmex株式會社人工飼育至幼蟲)。另外，作為對照，僅將FX單獨表達病毒接種于蠶幼蟲。病毒接種7天后，從感染幼蟲提取體液。為了確認第X因子的表達量，對于得到的體液之一部分，用SDS-PAGE及使用抗因子X抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進行解析。另外，為了檢測Y-谷氨酰羧基化的第X因子，對于得到的體液，使用抗Gla-結構域抗體(積水Medical株式會社)進行免疫沉降，對于得到的沉降物，用SDS-PAGE及使用抗因子X抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進行解析。結果示于圖2。再有，圖2的各試驗區中的樣品如下。
[0083]試驗區1:GGCX/NQ01共表達病毒及FX單獨表達病毒
[0084]試驗區2:GGCX/VK0R共表達病毒及FX單獨表達病毒
[0085]試驗區3 =GGCX單獨表達病毒及FX單獨表達病毒
[0086]試驗區4 =NQOl 單獨表達病毒及FX單獨表達病毒
[0087]試驗區5 =VKOR單獨表達病毒及FX單獨表達病毒
[0088]試驗區6:FX單獨表達病毒
[0089]PC:天然型人第 X 因子(Haematologic Technologies 公司)
[0090]NC:未感染蠶幼蟲體液
[0091]從圖2A知，在試驗區I~6均確認條帶，在第X因子的表達量上未見到大的差異。從圖2B知，在感染FX單獨表達病毒和GGCX/NQ01共表達病毒的樣品(試驗區I)中，相比其他樣品(試驗區2~6)，得到顯著高的信號。結果提示，在蠶幼蟲中共表達GGCX及NQOl和第X因子時，有效得到Y-谷氨酰羧基化的第X因子。
[0092](ii)人第X因子的表達量的探討
[0093]將感染GGCX/NQ01共表達病毒及FX單獨表達病毒的蠶幼蟲的體液中含的人第X因子的濃度由使用人因子X ELISA試劑盒(Assaypro公司)的夾心ELISA法測定。結果得知，在體液中含500μ g/ml左右的人第X因子。每I只蠶幼蟲的體液的回收量是0.4ml左右，所以預測每I只蠶幼蟲的表達量是200 μ g左右。
[0094](3-2)關于人凝血酶原
[0095]將PTH單獨表達病毒和GGCX/NQ01共表達病毒混合至病毒效價成1:1的比率，將其接種于蠶蛹(品種:近秋錦和。長上田蠶種公司購入蠶卵，由Sysmex株式會社人工飼育至蛹)。另外，作為對照，僅將PTH單獨表達病毒接種于蠶幼蟲。病毒接種7天后，回收感染的蛹，將其于_80°C冷凍。將冷凍的蛹用混合機破碎。將得到的破碎液中的蛹殘渣低速離心處理及并通過過濾除去，得到勻漿。為了確認凝血酶原的表達量，對于得到的勻漿之一部分,用SDS-PAGE及使用抗凝血酶抗體(Novus公司)的蛋白印跡進行解析。另外，為了檢測
Y-谷氨酰羧基化的凝血酶原，對于得到的體液，使用抗Gla-結構域抗體(積水Medical株式會社)進行免疫沉降，對于得到的沉降物，用SDS-PAGE及使用抗凝血酶抗體(Novus公司)的蛋白印跡進行解析。結果示于圖3。再有，圖3的各試驗區中的樣品如下。
[0096]試驗區1:GGCX/NQ01共表達病毒及PTH單獨表達病毒
[0097]試驗區2 =PTH單獨表達病毒
[0098]PC:天然型人凝血酶原(人血衆來源、Calb1chem公司)
[0099]NC:未感染蠶勻漿
[0100]從圖3A知，試驗區I及2均確認條帶，所以凝血酶原的表達量未見大的差異。從圖3B得知，在感染PTH單獨表達病毒和GGCX/NQ01共表達病毒的樣品(試驗區I)中，相比其他樣品(試驗區2)得到顯著高的信號。結果提示，在蠶蛹中共表達GGCX及NQOl和凝血酶原時，有效得到Y-谷氨酰羧基化的凝血酶原。
[0101]實施例3:蠶中的維生素K依賴性蛋白質的Y -谷氨酰羧基化的條件的探討
[0102]將上述的實施例2中制作的FX單獨表達病毒，和上述的實施例1中制作的各表達病毒混合至病毒效價成下述比率，將其接種于蠶幼蟲(品種:近秋錦和。從上田蠶種公司購入蠶卵，由Sysmex株式會社人工飼育至幼蟲)(試驗區I~4)。另外,作為對照,僅將FX單獨表達病毒接種于蠶幼蟲(試驗區5)。
[0103]病毒接種7天后，從感染幼蟲提取體液。為了確認第X因子的表達量，對于得到的體液之一部分，用SDS-PAGE及使用抗因子X抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進行解析。另外，為了檢測Y-谷氨酰羧基化的第X因子，對于得到的體液，使用抗Gla-結構域抗體(積水Medical株式會社)進行免疫沉降,對于得到的沉降物,用SDS-PAGE及使用抗因子X抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進行解析。結果示于圖4。圖4的各試驗區中的樣品如下。
[0104]試驗區1:GGCX單獨表達病毒:NQ01單獨表達病毒:FX單獨表達病毒=1:1:1
[0105]試驗區2 =GGCX單獨表達病毒:VKOR單獨表達病毒:FX單獨表達病毒=1:1:1
[0106]試驗區3 =GGCX單獨表達病毒:NQ01單獨表達病毒:VK0R單獨表達病毒:FX單獨表達病毒=1:1:1:1
[0107]試驗區4:GGCX/NQ01共表達病毒:FX單獨表達病毒=1:1
[0108]試驗區5:FX單獨表達病毒
[0109]PC:天然型人第 X 因子(Haematologic Technologies 公司)
[0110]從圖4A得知，試驗區I~5均確認條帶，所以第X因子的表達量未見大的差異。從圖4B得知，在感染FX單獨表達病毒和GGCX/NQ01共表達病毒的樣品(試驗區I)中，相比其他樣品(試驗區I~3及5)，得到顯著高的信號。從結果得知，在蠶幼蟲中，在使用分別單獨表達與Y -谷氨酰羧基化相關的各因子(GGCX、NQOl及VK0R)和第X因子的桿狀病毒的表達系統中幾乎得不到Y-谷氨酰羧基化的第X因子。從而顯示，為了有效得到Y-谷氨酰羧基化的第X因子，有使用GGCX基因及NQOl基因整合到相同的桿狀病毒的GGCX/NQ01共表達病毒的必要。
【權利要求】
1.重組桿狀病毒，其整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶的基因和編碼DT-黃遞酶的基因。
2.權利要求1所述的重組桿狀病毒，其中進一步整合有編碼維生素K依賴性蛋白質的基因。
3.權利要求2所述的重組桿狀病毒，其中上述維生素K依賴性蛋白質是維生素K依賴性凝固因子。
4.權利要求3所述的重組桿狀病毒，其中上述維生素K依賴性凝固因子選自:凝血酶原、第VII因子、第IX因子、第X因子、蛋白C、蛋白S及蛋白Z。
5.宿主細胞,其通過用權利要求1~4中任一項所述的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲的培養細胞而得到。
6.權利要求5所述的宿主細胞，其中上述鱗翅目昆蟲是蠶。
7.重組維生素K依賴性蛋白質的制備用試劑盒，其包含整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶的基因和編碼DT-黃遞酶的基因的重組桿狀病毒。
8.重組型維生素K依賴性蛋白質的制備方法，其包括下述步驟:使用整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶的基因和編碼DT-黃遞酶的基因的重組桿狀病毒，使Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質在鱗翅目昆蟲或上述鱗翅目昆蟲的培養細胞中表達。
9.權利要求8所述的制備方法，其中上述表達步驟是在鱗翅目昆蟲中表達Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質的步驟。
10.權利要求9所述的制備方法，其中上述表達步驟是在鱗翅目昆蟲的幼蟲或蛹中表達Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質步驟。
【文檔編號】C12R1/93GK104073471SQ201410122911
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年3月28日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】坂東孝彥, 菅井睦美 申請人:希森美康株式會社