痕量rna實時動態檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種痕量RNA實時動態檢測方法，包括以下步驟：A1、首先進行DNA探針在芯片上的包被；A2、然后將待檢痕量RNA與預先包被的DNA探針雜交，再加入DSN酶以降解雜交雙鏈中的DNA，使RNA游離出來與DNA探針雜交，進而RNA-DNA復合物中的DNA繼續被DSN降解，再次使RNA游離出來，重復上述過程，可以使體系中所有RNA-DNA復合物中的DNA均可被DSN酶降解。由于芯片上包被的DNA探針的量與SPR角度值成正相關，隨著芯片上的DNA探針被逐漸酶切，導致其SPR角度值逐漸改變，通過該SPR角度值的變化對靶分子RNA進行快速定量實時檢測。
【專利說明】痕量RNA實時動態檢測方法【技術領域】
[0001]本發明涉及檢驗【技術領域】，尤其涉及的是一種痕量RNA實時動態檢測方法。
【背景技術】
[0002]核糖核酸RNA是存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體，對基因的表達與蛋白質生物合成起重要的作用。在生物體內主要有四種不同的RNA分子，分別是信使 RNA (mRNA)、轉移 RNA (tRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、微小 RNA (microRNA，miRNA)。它們參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。最近的研究發現，miRNA表達與多種癌癥相關，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能。要了解RNA在基因調控中扮演的角色，很關鍵的一個方法就是迅速、準確地定量檢測RNA基因的表達。因此如果早期能對疾病進行分子水平RNA的檢測，將為疾病的早期診斷提供重要的依據。
[0003]但是由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達水平極低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。傳統常用的檢測方法有Northern blot技術、RNA芯片技術和實時定量PCR技術三類。Northern blot技術是驗證和確認RNA的重要方法，但該方法操作繁瑣并且靈敏度低，不適用于臨床樣本的高通量檢測芯片技術檢測方法可以實現快速、高通量的檢測，但其需要的RNA初始樣本量大，并且以雜交為基礎，因此無法區分單堿基差異的RNA，再者，芯片技術檢測的結果為半定量，該方法的重現性和準確性較差，一般多用于初篩。實時定量PCR技術可以定量分析RNA的表達，且樣本需要量較少，顯著提高了敏感度，但對于miRNAs檢測存在以下問題，由于成熟miRNAs長度較短，難以針對成熟miRNAs設計有效的特異性引物和探針，只能用前體miRNAs來代替，因此無法真實體現相應的成熟miRNAs水平。另外，實時定量PCR是基于體外擴增的技術，易受擴增溫度的影響，后來演變出以滾環擴增(RCA)技術為代表的等溫擴增技術，可以實現低豐度核酸的等溫檢測。然而該技術同樣存在著如下缺陷，當前，RCA均相檢測RNA多采用熒光染料與DNA產物相結合并產生強熒光進行檢測，但由于熒光染料與溶液中的DNA和RNA都能結合，在實際樣品分析時易使檢測的背景值偏高，降低檢測的靈敏度。并且，上述實時定量PCR技術、RCA技術都是是以擴增為基礎，檢測結果的特異性存在風險，極大的限制了核酸檢測技術的應用。因此，實現無需熒光標記無需核酸擴增的低豐度核酸直接檢測和實時動態監測將是方法學上的一大突破。
[0004] 雙鏈特異性核酸酶(Duplex-specificnuclease, DSN)能夠選擇性降解DNA-RNA雜交體中的DNA，對單鏈核酸分子幾乎沒有作用，因此是構建RNA文庫中的最經典工具之一。近年來，有文獻報道了將DSN用于miRNA檢測，其原理也是基于DSN能夠選擇性降解DNA-RNA雜交體中的DNA。通過使體系中RNA與DNA探針雜交，再運用DSN酶切DNA-RNA雙鏈中的DNA單鏈，使RNA單鏈游離后繼續與預先包被的DNA探針進行雜交。重復上述“雜交-酶切-游離”過程即可實現檢測信號的放大。然而上述方法有兩個問題尚無法克服:DmiRNA檢測技術是基于終點觀測，無法動態觀測miRNA-DNA結合與選擇性酶切這一動態過程，因此檢測結果的可靠性受到質疑。2)由于芯片上的包被的DNA數量是有限的(過高則存在較大空間位阻，過低則靈敏度差)，從而使得上述miRNA檢測的最低檢出限差，無法真正實現臨床樣本中低濃度miRNA的無擴增直接檢測。
[0005]表面等離子體共振(SPR)技術可以實時動態監測生物大分子間的反應，是觀測生物分子結合與解離的可靠檢測技術。本發明擬通過SPR技術平臺構建能夠實時動態監測痕量RNA的核酸檢測技術。并且通過發明一維碳納米材料石墨烯金膜包被技術和納米金修飾探針技術，數量級放大已包被的DNA探針質量信號，結合DSN的循環酶切技術，從而指數級提高檢測靈敏度，從而實現RNA的無需擴增直接檢測與動態觀測。最終建立一套“可視化” DSN信號放大RNA實時動態監測方法，以期為疾病的早期診斷提供可靠技術支撐(原理如圖1所示)。為增強檢測方法的靈敏度，引入了一種吸附性很強的石墨烯，通過構建的石墨烯芯片實現高效包被DNA探針，同時，對DNA探針進行納米金修飾，增加探針的質量，從而增大SPR的監測信號。另外，石墨烯芯片上的石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，避免造成SPR信號干擾。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的靈敏度不足和無法實時動態觀測的問題提供一種痕量RNA實時動態檢測方法。
[0007]本發明的技術方案如下:
[0008]一、首先進行DNA探針在芯片上的包被；包括如下方法:石墨烯系統，純金膜-巰基系統，短鏈羧化物-氨基系統(如常用的鏈酶親和素-生物素)。
[0009]二、然后將待 檢痕量RNA與預先包被的DNA探針雜交，再加入DSN酶以降解雜交雙鏈中的DNA，使RNA游離出來與DNA探針雜交，進而RNA-DNA復合物中的DNA繼續被DSN降解，再次使RNA游離出來，重復上述過程,可以使體系中所有RNA-DNA復合物中的DNA均可被DSN酶降解。
[0010]三、由于芯片上包被的DNA探針的量與SPR角度值成正相關，隨著芯片上的DNA探針被逐漸酶切，導致其SPR角度值逐漸改變，利用表面等離子體共振(SPR)平臺，可觀測每個時刻SPR角度值的變化，其反映了檢測RNA每個時刻的情況，通過該SPR角度值的變化可對靶分子RNA進行快速定量實時檢測。本方法可根據酶切完全時間來定量RNA，或者確定某一時刻根據相應的SPR角度值來定量RNA。
[0011]四、為了增大DNA探針在SPR上的監測信號，以納米金修飾DNA探針。
[0012]五、構建了石墨稀芯片以聞效包被DNA探針,確保檢測的靈敏度。同時，石墨稀可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號干擾。
[0013]六、酶切過程中加入的雙鏈特異性核酸酶(DSN)的反應溫度可在20°C -50°C，這里首選37 °C作為反應最適溫度。
[0014]七、為了增強DSN酶在反應過程中的活性，可加入一定濃度SDS，巰基乙醇，或者H202水溶液。
[0015]八、本方法利用表面等離子體共振(SPR)平臺，可完成檢測過程中對RNA水平的實時動態監測。
[0016]本發明具有以下有益效果:[0017]構建石墨烯芯片，以石墨烯的高親和性提高包被DNA探針數量，以納米金修飾DNA探針，增強單個探針的SPR信號，從而確保所包被探針具有較高的基礎SPR信號。以雙鏈特異性核酸酶(DSN)進行選擇性酶切，既可以實現在等溫情況下對痕量RNA的檢測信號進行放大提高檢測靈敏度，又可以利用DSN的酶切校正功能確保檢測特異性。同時，包被的多層石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號干擾。通過表面等離子體共振(SPR)技術實現痕量RNA的無需標記實時監測。有機整合上述方案可實現痕量RNA恒溫實時監測。同時本方法適合各種RNA分子的檢測，實用性廣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1DSN對于雙鏈的切割過程原理圖；
[0019]圖2DSN在不同條件下活性的檢測電泳圖；
[0020]圖3石墨稀芯片構建不意圖；
[0021]圖4石墨烯系統納米金DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0022]圖5純金膜-巰基系統DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0023]圖6短鏈羧化物-氨基系統DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0024]圖7DNA探針包被、miRNA21雜交及DSN酶切動態過程圖；
[0025]圖8不同濃度miRNA21雜交標準曲線圖；
[0026]圖9DNA探針與miRNA特異性檢測圖；
[0027]圖10不同濃度miRNA酶切時間比較圖；
[0028]圖1lmiRNA酶切完全時間標準曲線圖；
[0029]圖12定量檢測miRNA21標準曲線圖；
[0030]圖13驗證DSN活性最適條件圖；
[0031]圖14石墨烯系統RNA的DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0032]圖15RNA的DNA探針包被、RNA雜交及DSN酶切動態過程圖；
[0033]圖16不同濃度RNA雜交標準曲線圖；
[0034]圖17RNA的DNA探針與RNA特異性檢測圖；
[0035]圖18不同濃度RNA酶切時間比較圖；
[0036]圖19RNA酶切完全時間標準曲線圖；
[0037]圖20定量檢測RNA標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0038]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0039]具體實施方案一(檢測痕量miRNA):
[0040]一、雙鏈特異性核酸酶(DSN)酶切條件的優化
[0041]雙鏈特異性核酸酶(DSN)最適反應溫度為60°C，本實驗需要采用SPR技術，而SPR芯片的運行溫度不超過50°C。所以需要找到某種特定濃度的物質使酶在37°C有較高的活性。
[0042]1.雙鏈特異性核酸酶(DSN)分裝(由everogen公司生產的DSN試劑盒)
[0043]2.在整個反應體系(3ul 雙 鏈 DNA，lullOXDSNmasterbuffer，lulDSN 酶)中加入5ul2%的SDS，優化得到的雙鏈特異性核酸酶(DSN)的最適反應條件，保證最終SDS占1%。
[0044]在1.5%瓊脂糖、TBE緩沖液、80V電壓下，電泳30min。(圖3) M: 2000的marker,1.模板+37°C +未酶切，2.模板+37°C +酶切，3.模板+37°C +酶切+1%SDS，4.模板+65°C +酶切，5.模板+65°C +酶切+1%SDS。參考圖3，通過1.5%瓊脂糖電泳驗證DSN酶的活性，每個泳道的DNA加樣量為200ng ;泳道1-DNA模板在37°C孵育未加DSN酶，泳道2-DNA模板與DSN酶在37°C孵育，泳道3-DNA模板與DSN酶、1%SDS在37°C共同孵育，泳道4-DNA模板與DSN酶在65 °C孵育，泳道5-DNA模板與DSN酶、1%SDS在65 °C共同孵育。
[0045]泳道I在IOObp處可見高亮度的DNA條帶，泳道2、3、4在IOObp處模糊可見DNA條帶的痕跡，泳道5在IOObp處可見亮度明顯高于泳道2、3、4的DNA條帶，泳道3、5在750bp處的條帶痕跡是未溶解的SDS。
[0046]該實驗結果說明在37°C時加入1%的SDS’ DSN具有較好的酶切活性，在65°C時加入1%的SDS，DSN的酶切活性明顯受到抑制，使泳道5可以看見明顯條帶。
[0047]二、DNA探針和miRNA的合成(由上海生物工程公司合成)
[0048]1.合成 miRNA21:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
[0049]2.合成 miRNA21 的 DNA 探針 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探針的 5 ‘端進行納米金修飾(Pl)
[0050]3.合成 miRNA21 的 DNA 探針 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探針的 5 ‘端進行巰基修飾(P2) [0051]4.合成 miRNA21 的 DNA 探針 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探針的 5 ‘端進行氨基修飾(P3)
[0052]三、DNA探針在芯片上的包被(三種方法)
[0053](一)方法一:利用石墨烯高親和性包被探針Pl
[0054]1.從炭美石墨烯產品網絡銷售中心購買濃度為3mg/ml的氧化石墨烯水溶液。
[0055]2.制作基底芯片(具體過程見圖3):底層為石英玻璃(SiO2)，依次向上鍍有5nm的鈦(Ti)或者鉻(Cr)金屬層，50nm的金膜層。
[0056]3.構建石墨烯芯片:石墨烯芯片是通過電泳沉積分別使0.lmg/ml,0.3mg/ml,
0.5mg/ml,0.7mg/ml,0.9mg/ml的氧化石墨烯沉積到基底芯片上，電壓均為150V,時間20s,(可控制電壓、時間來決定沉積的氧化石墨烯的量)每個濃度做3組平行試驗。通過SEM/AFM檢測，篩選出氧化石墨烯沉積分布最均一的濃度，作為制備石墨烯芯片的最適濃度。這里首選0.5mg/ml的氧化石墨烯。
[0057]4.系統自動采樣，采樣容量是實際的樣品量減去30微升，采樣流速一般為5微升/min。采樣成功后，停止采樣，停止掃描，停止柱塞泵，系統進行自動包被Pl探針30-40min(包被前后數據圖如圖4)，參考圖4，通過SPR對石墨烯芯片在0-1162S進行連續掃描，SPR角度值為68015毫度左右；P1探針包被后在1163-6500S對石墨烯芯片進行連續掃描，SPR角度值為69915毫度左右；6500s之后進行的是石墨烯芯片的再生處理，DNA解離后石墨烯芯片連續掃描的SPR角度值為68000毫度左右。該實驗表明在SPR上Pl探針的包被和解離過程現象十分明顯，可清晰的看見實驗的動態過程。
[0058](二)方法二:巰基化DNA探針P2包被
[0059]1、沒有點樣的金芯片(金芯片UMPH0A600芯片由北京金菩嘉醫療科技有限公司提供)首先用30%的H202對新芯片進行預處理，除去雜質，并使金膜表面暴露。
[0060]2、在SPR上進行P2探針的包被
[0061]P2探針的包被過程同包被方法(一)的步驟4，(包被前后數據圖如圖5)，參考圖5，通過SPR對裸金芯片在0-1162s進行連續掃描，SPR角度值為67082毫度左右；P2探針包被后在1163-6500S對金芯片進行連續掃描，SPR角度值為67315毫度左右；6500s之后進行的是金芯片再生處理，DNA解離后金芯片連續掃描的SPR角度值為67051毫度左右。該實驗表明在SPR上進行P2探針的包被和解離過程現象明顯，可看見實驗的動態過程。
[0062](三)方法三:氨基化DNA探針P3包被
[0063]1、表面為短鏈羧基的芯片(由北京金菩嘉醫療科技有限公司提供)，該芯片可以偶聯帶有氨基、巰基、醛基、羥基、羧基的分子。
[0064]2、在SPR上進行P3探針的包被
[0065]P3探針的包被過程同包被方法(一)的步驟4，(包被前后數據圖如圖6)，參考圖6，通過SPR對短鏈羧基的芯片在0-1162s進行連續掃描，SPR角度值為67155毫度左右；P3探針包被后在1163-6500S對金芯片進行連續掃描，SPR角度值為67409毫度左右；6500s之后進行的是金芯片再生處理，DNA解離后金芯片連續掃描的SPR角度值為67152毫度左右。該實驗表明在SPR上進行P3探針的包被和解離過程現象明顯，可看見實驗的動態過程。
[0066]以上三種方法均可用 于DNA探針包被，這里我們為了增大DNA探針在SPR上的監測信號，以納米金修飾DNA探針，所以選擇石墨烯芯片以高效包被DNA探針，確保檢測的靈敏度。同時，石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號干擾。
[0067]以下則是選用石墨烯芯片包被DNA探針對本專利具體實施方案進行說明。
[0068]四、SPR用于實時監測miRNA與DNA探針的雜交
[0069]1、加入50ul含20uM的納米金修飾的DNA探針Pl混合體系，進行DNA探針包被；
[0070]2、40min后，加入50 μ I的miRNA21和IU/ μ IDSN酶的混合體系，使其進行反應；
[0071]3、37攝氏度下反應60min，期間采用SPR儀器自動采樣并記錄反應后的SPR曲線。圖7中SPR角度為68000毫度時，是石墨烯芯片的角度值；74000毫度時，是完成了 Pl探針的包被此時石墨烯芯片的角度值；之后圖中曲線呈不規則下降，是加入了 miRNA21和DSN酶，雜交和酶切共同作用的動態過程。
[0072]五、SPR檢測miRNA的條件優化
[0073]1、向已經包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升0.01nM的miRNA21,檢測在30min時SPR角度值，同上步驟加入50微升0.1nM的miRNA21、lnM的miRNA21、IOnM的miRNA21、IOOnM的miRNA21，分別檢測在30min時SPR角度值，繪制標準曲線(圖8)。參考圖8，該實驗結果表明隨著miRNA21濃度的增加，其與Pl探針雜交的效果呈上升趨勢。
[0074]2、分別加入50微升30nM的堿基完全匹配、單堿基不匹配、雙堿基不匹配、三堿基不匹配、四堿基不匹配、完全不匹配的靶分子序列，判斷該方法的特異性(附圖9)。參考圖9，該實驗表明，雜交過程中加入的miRNA堿基不匹配，其酶切時間明顯延長，結果明顯受到影響，說明本方法特異性高。
[0075]3、向已經包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的miRNA21和IU/μ IDSN酶混合體系，檢測其酶切完成的時間，觀察酶切過程。miRNA的濃度分別為 0.03ηΜ(0.01lng)，0.3ηΜ(0.ling)，3ηΜ(1.lng)，30nM(llng)，60nM(22ng).(附圖10)。參考圖10，該實驗說明，在包被了等量的Pl探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入miRNA21濃度的增加，酶切雜交的時間將會縮短。
[0076]4、向已經包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的miRNA21和IU/μ IDSN酶混合體系，檢測其雜交酶切完成的時間，繪制標準曲線。miRNA的濃度分別為0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖11)。參考圖11，該實驗說明，在包被了等量的Pl探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入miRNA21濃度的增加，雜交酶切完全時間呈下降趨勢。
[0077]六、定量檢測的標準曲線繪制
[0078]在已經包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的miRNA21和IU/ μ IDSN酶混合體系，在60min后，檢測不同濃度miRNA21的SPR角度值，繪制標準曲線，miRNA21 的濃度分別為 0.0OlnM,0.01nM,0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖 12)。參考圖12，在包被了固定濃度的PI探針石墨烯芯片上，當反應60min后，根據SPR角度值可定量miRNA21的濃度。[0079]具體實施方案二 (檢測痕量RNA):
[0080]一、采用具體實施方案一所得的雙鏈特異性核酸酶(DSN)最適反應條件進行驗證試驗。
[0081]在1.5%瓊脂糖、TBE緩沖液、80V電壓下，電泳30min。(附圖13)M:2000的marker，
1.模板+37°C +未酶切，2.模板+37°C +酶切+1%SDS。參考圖13，通過1.5%瓊脂糖電泳試驗對DSN酶活性驗證，每個泳道的DNA加樣量為200ng ;泳道1-DNA模板在37°C孵育未加DSN酶，泳道2-DNA模板與DSN酶、1%SDS在37 °C共同孵育。
[0082]泳道I在IOObp處可見高亮度的DNA條帶，泳道2在IOObp處僅隱約可見DNA條
帶的痕跡。
[0083]該實驗結果再次驗證在37°C時加入1%的SDS’ DSN具有較好的酶切活性。
[0084]二、DNA探針和RNA的合成(由上海生物工程公司合成)
[0085]1.合成RNA:人類胰島素mRNA的部分序列:
[0086]ccugcagccc uuggcccugg aggggucccu gcagaagcgu ggcauugugg aacaaugcug
[0087]uaccagcauc ugcucccucu accagcugga gaacuacugc
[0088]2.合成 RNA 的 DNA 探針 atggtcgtag acgagggaga tggtcgacct,在探針的 5 ‘端加上納米金(Ρ1')。
[0089]三、RNA的DNA探針P1’在石墨烯芯片上的包被同具體實施方案一的步驟三。(包被前后數據圖如圖14)，參考圖14，通過SPR對石墨烯芯片在0-1162S進行連續掃描，SPR角度值為68500毫度左右；Ρ1'探針包被后在1163-6500S對石墨烯芯片進行連續掃描，SPR角度值為73000毫度左右；6500s之后進行的是石墨烯芯片再生處理，DNA解離后石墨烯芯片連續掃描的SPR角度值為68450毫度左右。
[0090]該實驗表明在SPR上進行Ρ1'探針的包被和解離過程現象十分明顯，可清晰的看見實驗的動態過程。
[0091]四、SPR用于實時監測RNA與DNA探針的雜交同具體實施方案一的步驟四。
[0092]1、加入50ul含20uM的DNA探針混合體系，進行P1’探針包被；[0093]2、40min后，加入50 μ I的RNA和IU/ μ IDSN酶的混合體系，使其進行反應；
[0094]3、37攝氏度下反應60min，期間采用SPR儀器自動采樣并記錄反應后的SPR曲線。圖15中，SPR角度值為68000毫度時，是石墨烯芯片的角度值；75000毫度時，是完成了 P1’探針包被此時石墨烯芯片的角度值；之后圖中曲線呈不規則下降，是加入了 RNA和DSN酶，雜交和酶切共同作用的動態過程。
[0095]五、SPR檢測RNA的條件優化同具體實施方案一的步驟五。
[0096]1、向已經包被了 ΡI探針的石墨烯芯片上，加入50微升0.01nM的RNA，檢測在30min時SPR角度值，同上步驟加入50微升0.1nM的RNA、InM的RNA、IOnM的RNA、IOOnM的RNA，分別檢測在30min時SPR角度值，繪制標準曲線(附圖16)。圖16中，實驗結果表明隨著RNA濃度的增加，其與ΡI探針雜交的效果呈上升趨勢。
[0097]2、分別加入50微升30nM的堿基完全匹配、單堿基不匹配、雙堿基不匹配、三堿基不匹配、四堿基不匹配、五堿基不匹配的靶分子序列，判斷該方法的特異性(附圖17)。圖17中，實驗表明，雜交過程中加入的RNA堿基不匹配，其酶切時間明顯延長，結果明顯受到影響，說明本方法特異性高。
[0098]3、向已經包被了固定濃度的ΡI探針石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的RNA和IU/μ IDSN酶混合體系，檢測其酶切完成的時間，RNA的濃度分別為0.03nM(0.01lng)，
0.3nM(0.llng)，3nM(l.lng)，30nM(ling)，60nM(22ng)(附圖 18)。參考圖 18，該實驗說明，在包被了等量的ΡI探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入RNA濃度的增加，酶切雜交的時間將會縮短。 [0099]4、向已經包被了固定濃度的ΡI探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的RNA和lU/μ IDSN酶混合體系，檢測其雜交酶切完成的時間，繪制標準曲線。RNA的濃度分別為0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖19)。參考圖19，該實驗說明，在包被了等量的ΡI探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入RNA濃度的增加，雜交酶切完全時間呈下降趨勢。
[0100]六、定量檢測的標準曲線繪制同具體實施方案一的步驟六。
[0101]在已經包被了固定濃度的ΡI探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的RNA和IU/ μ IDSN酶混合體系，在60min后，檢測不同濃度RNA的SPR角度值，繪制標準曲線，RNA的濃度分別為 0.0OlnM, 0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖 20)。參考圖 20，在包被了固定濃度的ΡI探針石墨烯芯片上，當反應60min后，根據SPR角度值可定量RNA的濃度。
[0102]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
[0103]
【權利要求】
1.一種痕量RNA實時檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: Al、首先進行DNA探針在芯片上的包被；包括如下方法:石墨烯系統，純金膜-巰基系統，短鏈羧化物-氨基系統(如常用的鏈酶親和素-生物素)； A2、然后將待檢痕量RNA與預先包被的DNA探針雜交，再加入DSN酶以降解雜交雙鏈中的DNA，使RNA游離出來與DNA探針雜交，進而RNA-DNA復合物中的DNA繼續被DSN降解，再次使RNA游離出來，重復上述過程，可以使體系中所有RNA-DNA復合物中的DNA均可被DSN酶降解； A3、由于芯片上包被的DNA探針的量與SPR角度值成正相關，隨著芯片上的DNA探針被逐漸酶切，導致其SPR角度值逐漸改變，利用表面等離子體共振(SPR)平臺，可觀測每個時刻SPR角度值的變化，其反映了檢測RNA每個時刻的情況，通過該SPR角度值的變化可對靶分子RNA進行快速定量實時檢測；本方法可根據酶切完全時間來定量RNA，或者確定某一時刻根據相應的SPR角度值來定量RNA。
2.根據權利要求1所述的痕量RNA實時檢測方法，其特征在于: Al、為了增大DNA探針在SPR上的監測信號，以納米金修飾DNA探針； A2、構建了石墨稀芯片以聞效包被DNA探針，確保檢測的靈敏度；同時，石墨稀可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號干擾； A3、酶切過程中加入的雙鏈特異性核酸酶(DSN)的反應溫度可在20°C -50°C，這里首選，37 °C作為反應最適溫度； A4、為了增強DSN酶在 反應過 程中的活性，可加入一定濃度SDS，巰基乙醇，或者H2O2水溶液； A5、本方法利用表面等離子體共振( SPR)平臺，可完成檢測過程中對RNA水平的實時動態監測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882132SQ201410122611
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】羅陽, 邱曉沛, 張洪, 蔣天倫 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院