一種防止神經毒素Anntoxin失活的方法
【專利摘要】本發明公開了一種防止神經毒素Anntoxin失活的方法，其目的在于克服神經毒素Anntoxin在蛋白游離狀態下容易被分解而失去活性且毒性不能有效針對昆蟲產生的問題。本發明將神經毒素Anntoxin包埋在多角體中，使得神經毒素Anntoxin不會受到環境影響而失活，長時間保存活性。此外，將神經毒素Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被昆蟲食入，在昆蟲體內降解釋放神經毒素Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺乳類動物體內穩定，不會被降解而釋放神經毒素Anntoxin。
【專利說明】-種防止神經毒素 Anntox i η失活的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學【技術領域】，特別涉及一種防止神經毒素 Anntoxin失活的 方法。
【背景技術】
[0002] Anntoxin是由雨蛙產生的一類對昆蟲、爬行類、鳥類和哺乳類動物具有很強致死 毒性的基因編碼的神經毒素。可應用于農業害蟲的殺滅，但該蛋白質（Anntoxin)不穩定，在 環境中易被分解而失去活性，因此很難用于生物殺蟲劑。此外，單獨的Anntoxin不但對于 昆蟲有很強的致死毒性，同時對于爬行類、鳥類和哺乳類動物也同樣有很強的致死毒性，這 樣即使Anntoxin能穩定存在能用于生物殺蟲劑，但是使用后毒性很威脅到各種動物及人， 因此也是無法應用的。
[0003] 桿狀病毒中的核型多角體病毒在感染宿主后的晚期能夠產生大量的多角體蛋白， 并聚合形成一種獨特的超大分子蛋白質結晶-多角體。它的功能是保護病毒顆粒免受外界 各種不良環境的破壞，它對各種蛋白分解酶有抗性，而在堿中易溶解，釋出病毒粒子，目前 的研究表明多角體的功能主要保護包埋在多角體內部的病毒粒子，使之長時間保存活性。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服神經毒素 Anntoxin在蛋白游離狀態下容易被分解而失去 活性且毒性不能有效針對昆蟲產生的問題，提供了一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方 法，將神經毒素 Anntoxin包埋在多角體中，使得神經毒素 Anntoxin不會受到環境影響而失 活，長時間保存活性。此外，將神經毒素 Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被昆蟲食 入，在昆蟲體內降解釋放神經毒素 Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺乳類動 物體內穩定，不會被降解而釋放神經毒素 Anntoxin。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是： 一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法，包括以下步驟： (1) 神經毒素 Anntoxin基因的克隆： 以從華西雨蛙(華西雨蛙的皮膚組織)抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增反應得到 神經毒素 Aw 基因；RT-PCR擴增反應所用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物 的序列見SEQ ID N0. 1，反向引物的序列見SEQ ID N0. 2 ; 本發明設計了特定的引物用以擴增得到神經毒素基因； 利用瓊脂糖凝膠電泳對神經毒素基因進行PCR產物分析和純化，隨后將PCR 產物克隆進pGEM-T Easy載體，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體； (2) 含有神經毒素 Anntoxin基因的重組桿狀病毒的構建： 用限制性內切酶漢和ZAa/消化pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體得到J/wioxi/? 基因片段，然后將基因片段克隆入桿狀病毒轉移載體pFastBacHTA得到重組的轉 移載體； 將得到的重組的轉移載體轉化DHlOBmBac (polh+)感受態細胞(感受態細胞的選擇十 分重要，若不是選擇這樣的感受態細胞，則將不能形成多角體，也就不能包被神經毒素)，擴 大培養后，用PCR擴增的方法進行鑒定，提取陽性克隆的Bacmid DNA (現有常規方法)，將 Bacmid DNA、陽離子脂質體和無血清的TC-100培養基混合物在室溫培育15min后轉染對數 生長期的家蠶Bm5細胞，將該轉染后的家蠶Bm5細胞先用無血清的TC-100培養基在27°C條 件下培養5h，再用含有10% (體積比）胎牛血清的TC-100培養基在27 °C條件下培養120 h，收集上清進行二次感染，獲得相應的重組病毒，命名為vBmBac(polh+)-Anntoxin ; (3)家蠶Bm5細胞內表達： 對家蠶Bm5細胞接種步驟（2)獲得的重組病毒，在27°C下感染三天以進行感染表達，然 后離心收集家蠶Bm5細胞，用PBS緩沖液重懸后超聲破碎，離心收集多角體粗提物，將多角 體粗提物加入Percoll細胞分離液與PBS緩沖液混合液中，離心后收集純凈的多角體，最 后將純凈的多角體懸浮于含0.1% (體積比）SDS的PBS緩沖液中，室溫放置5 min，然后 用PBS緩沖液洗滌后得到最終純化的內部固定有神經毒素 Anntoxin的多角體。
[0006] 本發明利用能夠形成多角體的桿狀病毒表達系統表達神經毒素 Anntoxin，將重組 病毒感染家蠶Bm5細胞，這樣產生的多角體在細胞內會將神經毒素 Anntoxin包埋和固定入 多角體內部。這樣解決了神經毒素 Anntoxin容易失活的缺點，為開發神經毒素 Anntoxin 作為生物殺蟲劑創造了條件。此外，將神經毒素 Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被 昆蟲食入，在昆蟲體內降解釋放神經毒素 Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺 乳類動物體內穩定，不會被降解而釋放神經毒素 Anntoxin。
[0007] 作為優選，所述RT-PCR擴增反應參數為：一個循環，94°C模板變性5分鐘；接著35 個循環，94°C變性50秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1個循環，72°C延伸7分 鐘。
[0008] 作為優選，步驟（2)所述擴大培養為：在含有50 μ g/ml卡那霉素、7 μ g/ml慶 大霉素、10 yg/ml四環素、100 yg/ml X-gal和40 yg/ml IPTG的LB固體培養基上室 溫培養48h。
[0009] 作為優選，步驟（2)中Bacmid DNA、陽離子脂質體和無血清的TC-100培養基混合 物的制備方法為：將2μ g的Bacmid DNA、6y 1的陽離子脂質體加入聚苯乙烯錐形管內，補 充無血清的TC-100培養基至200 μ 1。
[0010] 作為優選，步驟（2)中二次感染具體為將收集的上清用含有10% (體積比）胎牛血 清的TC-100培養基在27°C條件下培養96-120 h。
[0011] 作為優選，步驟（3)中Percoll細胞分離液與PBS緩沖液混合液中Percoll細胞 分離液與PBS緩沖液的體積比為9:1。
[0012] 本發明的有益效果是： 1、將神經毒素 Anntoxin包埋在多角體中，使得神經毒素 Anntoxin不會受到環境影響 而失活，長時間保存活性。
[0013] 2、將神經毒素 Anntoxin包埋在多角體中，多角體易于被昆蟲食入，在昆蟲體內降 解釋放神經毒素 Anntoxin起作用，而多角體在爬行類、鳥類和哺乳類動物體內穩定，不會 被降解而釋放神經毒素 Anntoxin。
[0014]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1是基因 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0016] 圖2是重組病毒感染家蠶Bm5細胞的顯微鏡圖。
[0017] 圖3是多角體中神經毒素 Anntoxin的Western blotting圖， Μ代表Marker，1代表重組病毒感染家蠶Bm5細胞收集的多角體，2代表野生型病毒感 染家蠶Bm5細胞收集的多角體。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
[0019] 本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0020] 1、華西雨蛙：由浙江大學動物科學學院提供。
[0021] 2、pGEM-T Easy 載體：購于公司。
[0022] 3、PCR產物純化試劑盒：購于公司。
[0023] 4、cDNA合成試劑盒：購于Promega公司。
[0024] 5、桿狀病毒轉移載體pFast BacHTA、lipofectin (陽離子脂質體)和6XHis的單 克隆抗體：均為美國//? h 公司產品。
[0025] 6、胎牛血清FCS、無血清TC-100培養基均為Gko份￡公司的產品。
[0026] 7、Percoll細胞分離液是Pharmacia公司產品。
[0027] 8、X_gal、IPTG 購自 Sigma 公司。
[0028] 本發明使用的 PBS 緩沖液配方為：20 mmol/L NaH2P04, 20 mmol/L Na2HP04, 150 mmol/L NaCl;pH 7. 2〇
[0029] 實施例： (1)神經毒素 Anntoxin基因的克隆： 以從華西雨蛙的皮膚組織抽提的總RNA為模板(抽提RNA的方法為現有常規的TRIzol RNA提取方法)，利用RT-PCR擴增反應得到神經毒素基因；所述PCR擴增所用的 引物設計如下：正向引物為含有酶切位點的5' GGATCC ATGAAGACTTCTGTGGTTTTC 3' (SEQ ID NO. 1), 反向引物為含有油aJ酶切位點的5 ' TCTAGATTCTGCTGTCACGCAGGT 3 '（ SEQ ID NO. 2)； RT-PCR擴增反應具體過程為： cDNA合成：（采用市售cDNA合成試劑盒） 反應體系：提取的總RNA 2 μ g 01igo(dT)15 0·5μ1(ΜΗ20補充至 5 yl，70°C 5min，然后冰上放置 5min; 5Xbuffer 4μ 1 dNTP 1. 0μ 1 核糖核酸酶抑制劑1.〇μ 1 逆轉錄酶?.Ομ 1 補充ddH20至15 μ 1 ;將兩者混合。
[0030] 擴增體系：25°C退火 5min，42°C延伸 lh，70°C滅活 15min。
[0031] PCR 反應體系：5 X buffer 4 μ 1 模板1 μ 1 dNTP 1. 0μ 1 正反向引物各0. 5 μ 1 Taq 酶(市售）0· 5μ 1 補充 ddH20 至 20 μ 1。
[0032] PCR擴增反應參數為：一個循環，94°C模板變性5分鐘；接著35個循環，94°C變性 50秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1個循環，72°C延伸7分鐘。
[0033] 利用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳對神經毒素基因進行PCR產物分析，如圖1 所示，從圖1可得知擴增得到了 基因片段，并用PCR產物純化試劑盒純化，隨后將 PCR產物克隆進pGEM-T Easy載體，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體，于上海英駿生物 技術有限公司對重組載體進行測序，確認擴增序列的正確性。
[0034] (2)含有神經毒素 Anntoxin基因的重組桿狀病毒的構建： 用限制性內切酶(市售）和油aJ (市售）消化pGEM-T Easyj/wiozi/?重組載體 得到基因片段，然后將基因片段克隆入桿狀病毒轉移載體pFastBacHTA 得到重組的轉移載體。
[0035] 將得到的重組的轉移載體轉化DH10BmBac(polh+)感受態細胞 (DH10BmBac(polh+)感受態細胞的制備方法見 Xingwei Xiang 等，Construction of a BmNPV polyhedrin-plus Bac-to-Bac baculovirus expression system for application in silkworm, Bombyx mori, Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:289_295)，在含有 50 yg/ml 卡那霉素、7 yg/ml 慶大霉素、10 yg/ml 四環素、100 yg/ml X-gal 和 40 yg/ml IPTG的LB固體培養基上室溫培養48h，挑取白色單菌落，并用PCR擴增的方法 進行鑒定，提取陽性克隆的Bacmid DNA (Bacmid DNA提取方法為現有常規方法)，將2yg 的Bacmid DNA、6yl的陽離子脂質體（lipofectin)加入聚苯乙烯錐形管內，補充無血清的 TC-100培養基至200 μ 1得混合物，混合物在室溫培育15min后轉染對數生長期的家蠶Bm5 細胞，將該轉染后的家蠶Bm5細胞先用無血清的TC-100培養基在27°C條件下培養5h，再用 含有10%胎牛血清的TC-100培養基在27 °C條件下培養120 h，收集上清進行二次感染，二 次感染具體為將收集的上清用含有10% (體積比)胎牛血清的TC-100培養基在27°C條件下 培養96-120 h，獲得相應的重組病毒，命名為vBmBac(polh+)-Anntoxin; (3)家蠶Bm5細胞內表達： 對家蠶Bm5細胞接種步驟（2)獲得的重組病毒，在27°C下感染三天以進行感染表達， 后通過離心收集家蠶Bm5細胞(如圖2所示，圖2表明家蠶細胞被重組病毒感染)。用10 mLPBS緩沖液懸浮后超聲破碎。于4°C，15,000 rpm離心10 min收集多角體粗提物。將 Percoll細胞分離液與PBS緩沖液按9:1的體積比混合，調節pH至7. 2。將多角體粗提 物緩慢的加入Percoll細胞分離液與PBS緩沖液混合液中，4°C，12, 000 rpm離心20 min 后收集純凈的多角體。最后將純凈的多角體懸浮于含0.1% (體積比）SDS的PBS緩沖液 (即PBS緩沖液99. 9ml與0. lml SDS配置而成）中，室溫放置5 min，然后用PBS緩沖液 洗漆2次得到最終純化的內部固定有神經毒素 Anntoxin的多角體。
[0036] (4)多角體晶體固定神經毒素 Anntoxin的分析鑒定： 將上述離心收集到的家蠶Bm5細胞樣品進行超聲波破碎，釋放細胞內的多角體，用碳 酸緩沖液裂解，經15% SDS-PAGE凝膠電泳后轉移到PVDF膜上，進行Western Blotting 檢測，對固定入多角體內的重組神經毒素 Anntoxin進行鑒定，檢測多角體用的一抗是鼠抗 6父把8的單克隆抗體（1:1，000)，二抗是！1即標記的羊抗鼠186抗體（1 :1，000，市售）， 最后使用ECL化學發光檢測試劑盒(市售）顯色并拍照，如圖3所示，能特異性的檢測到一 條分子量較小、大小約為9 KDa的蛋白條帶，與預測的重組神經毒素 Anntoxin分子量大小 一致，證明這是重組神經毒素 Anntoxin，這說明除多角體蛋白外，多角體內還含有神經毒素 Anntoxin,這一結果表明利用多角體固定神經毒素 Anntoxin蛋白成功。
[0037] 神經毒素 Anntoxin基因的序列見基因數據庫GenBank，編號FJ598043. 1，具體如 下： ATGAAGACTTCTGTGGTTTTCTTGGTTGTCCTCGCTGCCGGCCTCTTCCTGCTGTCAGAAGGCGCTCAAGAT TATAGATGTCAGTTATCTAGGAATTATGGGAAAGGAAGTGGTTCTTTTACCAATTATTACTACGATAAAGCAACAAG CTCCTGTAAGACATTCAGATACCGCGGCTCCGGGGGAAATGGCAATAGATTCAAAACCCTCGAGGATTGTGAGGCGA CCTGCGTGACAGCAGAATAA (SEQ ID NO. 3)〇
[0038] 以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的 限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。 SEQUENCE LISTING 〈110>浙江省海洋開發研究院 〈120> -種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法 <130> 2014.03.21 <160> 3 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 27 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 ggatccatga agacttctgt ggttttc 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 2 tctagattct gctgtcacgc aggt 24 <210> 3 <211> 246 〈212> DNA 〈213> 雨蛙 〈400> 3 atgaagactt ctgtggtttt cttggttgtc ctcgctgccg gcctcttcct gctgtcagaa 60 ggcgctcaag attatagatg tcagttatct aggaattatg ggaaaggaag tggttctttt 120 accaattatt actacgataa agcaacaagc tcctgtaaga cattcagata ccgcggctcc 180 gggggaaatg gcaatagatt caaaaccctc gaggattgtg aggcgacctg cgtgacagca 240 gaataa 246
【權利要求】
1. 一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 神經毒素 Anntoxin基因的克隆： 以從華西雨蛙抽提的總RNA為模板，利用RT-PCR擴增反應得到神經毒素 基因；RT-PCR擴增反應所用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列見SEQ ID NO. 1，反向引物的序列見SEQ ID NO. 2 ; 利用瓊脂糖凝膠電泳對神經毒素基因進行PCR產物分析和純化，隨后將PCR 產物克隆進pGEM-T Easy載體，得到pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體； (2) 含有神經毒素 Anntoxin基因的重組桿狀病毒的構建： 用限制性內切酶漢和ZAa/消化pGEM-T Easy-J/wiiori/?重組載體得到J/wioxi/? 基因片段，然后將基因片段克隆入桿狀病毒轉移載體pFastBacHTA得到重組的轉 移載體； 將得到的重組的轉移載體轉化DH10BmBac(p〇lh+)感受態細胞，擴大培養后，用PCR擴 增的方法進行鑒定，提取陽性克隆的Bacmid DNA，將Bacmid DNA、陽離子脂質體和無血清 的TC-100培養基混合物在室溫培育15min后轉染對數生長期的家蠶Bm5細胞，將該轉染后 的家蠶Bm5細胞先用無血清的TC-100培養基在27°C條件下培養5h，再用含有10%胎牛血 清的TC-100培養基在27 °C條件下培養120 h，收集上清進行二次感染，獲得相應的重組 病毒，命名為 vBmBac(polh+)_Anntoxin; (3) 家蠶Bm5細胞內表達： 對家蠶Bm5細胞接種步驟（2)獲得的重組病毒，在27°C下感染三天以進行感染表達，然 后離心收集家蠶Bm5細胞，用PBS緩沖液重懸后超聲破碎，離心收集多角體粗提物，將多角 體粗提物加入Percoll細胞分離液與PBS緩沖液混合液中，離心后收集純凈的多角體，最 后將純凈的多角體懸浮于含0. 1%SDS的PBS緩沖液中，室溫放置5 min，然后用PBS緩 沖液洗滌后得到最終純化的內部固定有神經毒素 Anntoxin的多角體。
2. 根據權利要求1所述的一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于：所 述RT-PCR擴增反應參數為：一個循環，94°C模板變性5分鐘；接著35個循環，94°C變性50 秒，57°C退火30秒，72°C延伸25秒；最后1個循環，72°C延伸7分鐘。
3. 根據權利要求1或2所述的一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（2)所述擴大培養為：在含有50 yg/ml卡那霉素、7 yg/ml慶大霉素、10 yg/ml 四環素、100 yg/ml X-gal和40 yg/ml IPTG的LB固體培養基上室溫培養48h。
4. 根據權利要求1或2所述的一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（2)中Bacmid DNA、陽離子脂質體和無血清的TC-100培養基混合物的制備方法為：將 2 μ g的Bacmid DNA、6 μ 1的陽離子脂質體加入聚苯乙烯錐形管內，補充無血清的TC-100培 養基至200 μ 1。
5. 根據權利要求1或2所述的一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（2)中二次感染具體為將收集的上清用含有10%胎牛血清的TC-100培養基在27°C條 件下培養96-120 h。
6. 根據權利要求1或2所述的一種防止神經毒素 Anntoxin失活的方法，其特征在于： 步驟（3)中Percoll細胞分離液與PBS緩沖液混合液中Percoll細胞分離液與PBS緩沖 液的體積比為9:1。
【文檔編號】C12N7/01GK104059921SQ201410109882
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2014年3月24日
【發明者】相興偉, 章耀, 周宇芳, 徐珊, 楊會成 申請人:浙江省海洋開發研究院