一種耐高ph值菌種及新型發酵法生產賴氨酸方法
【專利摘要】本發明公開了一種耐高PH值菌種及新型發酵法生產賴氨酸方法，耐高PH值菌種，發酵過程不使用硫酸氨作為無機氮源，用氨水或液氨補充發酵液中氮源來合成賴氨酸，在發酵生產賴氨酸的過程中不添加硫酸銨，采用補入氨水或液氨作為氮源，使發酵液中硫酸根離子的濃度大大降低，方便了后續發酵液的處理，不需要離子交換去除硫酸根等離子進行提純，進從而簡化了生產飼料級賴氨酸鹽酸鹽的工藝，降低生產成本。補入氨水或液氨的方式采用調整發酵液中PH來控制發酵液中無機氮含量，保證培養罐中無機氮含量在合理范圍內，同時不再流加硫酸銨，減少發酵液中硫酸根離子等雜質含量，便于提取。
【專利說明】一種耐高PH值菌種及新型發酵法生產賴氨酸方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于發酵法生產賴氨酸的方法，尤其涉及一種耐高PH值菌種及新型發酵法生產賴氨酸方法。
【背景技術】
[0002]由于在食品或飼料中L-賴氨酸含量不足時，會限制其它氨基酸的利用，因此賴氨酸廣泛用于食品的強化、動物飼料的添加劑和藥用，L-賴氨酸是當前國內外全價配合飼料的主要添加劑，具有提高飼料利用率，促進動物生長和改進肉質的功效。
[0003]目前，生產飼料級L-賴氨酸鹽酸鹽過程中，發酵較多的采用連續發酵培養，在連續發酵培養中主要采用流加硫酸銨的方式提供氮源，保證賴氨酸的合成。硫酸銨中的氮被逐步消耗掉，而硫酸根離子則滯留在發酵液中，隨發酵時間的延長，發酵液中硫酸根離子逐漸增加，發酵結束后，發酵液中存在大量硫酸根離子，為提取工段造成一定難度。 [0004]傳統工藝采用發酵液膜過濾、經強酸性陽離子交換樹脂吸附解脫賴氨酸、濃縮、調酸結晶、離心分離干燥等工序生產飼料級賴氨酸鹽酸鹽。在離交工藝中用硫酸調節物料PH，用氨水進行解脫，同時需要大量純水用于清洗、洗脫，而且在此過程中產生大量低濃廢水、高濃廢水，其中，高濃廢水中含有大量硫酸銨需要提取回用，生產硫酸銨的過程中產生大量冷凝水，增加了水處理成本；增加了治理負擔。
[0005]傳統賴氨酸發酵過程PH —般控制小于7.2，不低于6.5，優先PH在7.0，此時賴氨酸生產和菌體生長均正常；過高或過低的PH，均會影響或抑制發酵過程賴氨酸生產和菌體生長，使發酵結束過程菌體偏低，發酵賴氨酸產率偏低。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于，克服現有技術的不足，提供了一種耐高PH值菌種及新型發酵法生產賴氨酸方法，本發明提供了一種耐高PH值菌種，發酵過程不使用硫酸氨作為無機氮源，用氨水或液氨補充發酵液中氮源來合成賴氨酸，在發酵生產賴氨酸的過程中不添加硫酸銨，采用補入氨水或液氨作為氮源，使發酵液中硫酸根離子的濃度大大降低，方便了后續發酵液的處理，不需要離子交換去除硫酸根等離子進行提純，進從而簡化了生產飼料級賴氨酸鹽酸鹽的工藝，降低生產成本。補入氨水或液氨的方式采用調整發酵液中PH來控制發酵液中無機氮含量，保證培養罐中無機氮含量在合理范圍內，同時不再流加硫酸銨，減少發酵液中硫酸根離子等雜質含量，便于提取。
[0007]為解決上述技術問題，本發明的技術方案為:一種耐高PH值菌種，該菌株為谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.8184，保藏時間為2013年9月13日。
[0008]一種新型發酵法生產賴氨酸方法，具體包括以下步驟
(O按常規方法配置生產賴氨酸的種子培養基，按120°c滅菌15-20分鐘；將生產賴氨酸的菌種，即耐高PH值菌種接入生產賴氨酸的種子培養基中，在28~37°C下，優選35°C下搖床培養到對數生長期，得到生產賴氨酸的種液；
(2)連續發酵:將步驟(1)制得的生產賴氨酸的種液接入經常規方法滅菌的發酵培養基中，其中，生產賴氨酸的培養基接種量為初始體積的10%~20%,發酵液中初始糖濃度為20克/升~80克/升，連續發酵過程中溫度控制在28~37°C下，優選35°C，通過向發酵液中通入無菌空氣維持壓力在0.02~0.08MP,并開動攪拌維持轉速在500~800rpm，使發酵液中溶氧維持在15%~25%，在連續發酵過程中通過流加濃度為500~800克/升的葡萄糖溶液，使發酵液中葡萄糖濃度在5克/升~20克/升，同時向發酵液中添加營養物質，營養物質為有機氮源、磷酸、無機鹽、維生素等；發酵液PH控制在7.2~7.6內的任意一個值附近。連續發酵時間為45~60hr。
[0009](3)連續發酵結束的培養液，膜過濾后不需要經過樹脂進行提純，直接濃縮、調酸、結晶生產賴氨酸。過濾后發酵液硫酸根離子等陰陽離子雜質較少，可以用超濾膜、脫色等方式去除發酵液中雜質，使發酵液賴氨酸純度提高到95%以上，然后經過四效濃縮把高純度賴氨酸濃縮至干物在60~80%左右、用鹽酸將濃縮液調節PH至5.0-5.5、結晶直接生產賴氨酸鹽酸鹽。
[0010]所述的PH控制在7.2~7.6內的任意一個值附近波動是7.4。
[0011]PH值控制方法:
(O按照賴氨酸連續發酵中葡萄糖消耗速率和無機氮消耗速率，向培養基中添加濃度為500~800克/升的葡萄糖溶液和氨水或液氨，通過PH在一定范圍內波動，使氨水或液氨補入，維持一定的無機氮濃度，維持一定的PH范圍；中間過程維持發酵液中葡萄糖濃度在5克/升~20克/升；葡萄糖的消耗降低發酵液PH值，補充氨水或液氨提高發酵液PH值。
[0012](2)向培養基中添加一量的營養物質,營養物質為有機氮源、磷酸、無機鹽、維生素等，通過PH在一定范圍內波動，使氨水或液氨補入，維持一定的無機氮濃度，維持一定的PH范圍；營養物質的流加比例為葡萄糖補入量的1/8-1/3 ;營養物補加降低發酵液PH值，補充氨水或液氨提高發酵液PH值。
[0013](3)將上述(1)、(2)所述的兩種控制方式使培養基PH在7.2~7.6內的任意一個值附近波動。
[0014]所述步驟(2)中營養物質為有機氮源、磷酸、無機鹽和維生素；
所述有機氮源為玉米漿、酵母粉和蛋白胨；無機鹽為氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳；維生素為維生素B1、維生素H和維生素B3。
[0015]所述營養物質配方為下述成分，余量為水，
H3PO4 10g/ L
MgSO4 10g/L KCL 5g/L FeSO4 0.25g/L MnSO4 0.25g/L 酵母粉100g/L 玉米漿 20g /L 維生素B1 lOOmg/L 維生素H 80mg/L維生素B3 70mg/Lo
[0016]賴氨酸發酵過程由于葡萄糖消耗產酸酸性物質，PH會降低；另一方面通過流加一定量的營養物質，營養物質為有機氮源、磷酸、無機鹽和維生素，也可使PH降低；為維持一定的PH，會使氨水或液氨自動補入,來提高發酵液PH。這幾種方式使發酵液中無機氮維持在一定范圍內，使賴氨酸菌種維持正常的代謝。
[0017]本發明中的PH值控制可通過市售的PH電極、傳感器、及其他相關儀表來完成。
[0018]本發明中所述的生產賴氨酸的種子培養基和發酵培養基，可根據現有技術按照生產賴氨酸的不同時期所需種子培養基和發酵培養基，采用常規方法配置。
[0019]所述的菌種為一種耐高PH值菌種，該菌株為谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏號為CGMCC N0.8184，保藏時間為2013年9月13日。
[0020]本發明提供的生產賴氨酸的方法是基于這樣的構思:目前在賴氨酸提取工藝中都采用離交樹脂處理，在離交工藝中用硫酸調節物料PH，用氨水進行解脫，同時需要大量純水用于清洗、洗脫，而且在此過程中產生大量低濃廢水、高濃廢水，其中，高濃廢水中含有大量硫酸銨需要重新提取回收，生產硫酸銨的過程中產生大量冷凝水，增加了水處理成本；這就考慮能否不再經過離交工藝，這就要求盡量減少發酵液中的硫酸根離子，在連續發酵中采用氨水或液氨代替硫酸銨作為氮源，能大幅減少硫酸根離子的濃度；考慮到如何自動添加氨水或液氨，一方面賴氨酸發酵過程中PH會下降,會使氨水或液氨自動補入，另一方面可以添加適當的營養物， 使PH降低，氨水或液氨補入，另外提高PH也可使氨水或液氨補入；這幾個方面結合可以使發酵液中無機氮濃度維持在一定水平，保證了賴氨酸菌種的正常代謝。
[0021]本發明的有益效果是:本發明通過篩選得到一種耐高PH值菌種，發酵過程PH控制在7.2~7.6，遠高傳統賴氨酸發酵PH ;傳統賴氨酸發酵過程PH —般控制小于7.2，不低于
6.5，優先PH在7.0本發明發酵過程不使用硫酸氨作為無機氮源，只使用氨水或液氨作為無機氮源，同時氨水或液氨作為PH調節劑；因為氨水或液氨即要作為無機氮源維持菌體生長需求，同時也要作為PH調節劑，維持PH值；所以過程中必須保證高PH值，來保證無機氮源充足，保證菌體及賴氨酸生產過程無機氮源充足，才能得到高的賴氨酸產率。
[0022]同現有技術相比，本發明提供的是在連續發酵過程中補加氨水或液氨，不流加硫酸銨，而使發酵液中不含有硫酸根離子，進而簡化賴氨酸提取工藝的方法；本發明是在連續發酵過程中通過改變PH來控制氨水或液氨的補入，維持一定的無機氮濃度，進而保證賴氨酸菌種正常代謝；本發明的優勢在于對賴氨酸提取工藝進行了簡化。本發明通過在連續發酵中補入氨水或液氨提供氮源，發酵結束后由于發酵液中硫酸根離子較少，可以不用經過離交樹脂，經過使用氨水或液氨作為氮源的發酵液經過膜過濾去除菌體、大分子蛋白等雜質，過濾后發酵液不經過離交樹脂吸附解脫，直接通過脫色過濾及其他方法去除發酵液中其他離子等雜質，直接經過脫色過濾及其他方法去除發酵液中其他離子等雜質，然后直接通過濃縮、調酸、結晶、重結晶、離心分離、干燥等工藝生成賴氨酸鹽酸鹽。
【具體實施方式】[0023]實施例一
菌種使用谷氨酸棒桿菌進行賴氨酸連續發酵生產賴氨酸，所用的培養基如下:
(I)斜面培養基: 蛋白胨12 g/L、酵母粉7 g/L、氯化鈉5 g/L、蔗糖20g/L、瓊脂20 g/L，培養基用30%氫氧化鉀溶液調PH到7.5-8.0，在115°C滅菌20min，制備出高PH斜面培養基。
[0024](2)種子搖瓶培養基:
蛋白胨 10 g/L 酵母粉 5 g/L
氯化鈉 5 g/L 葡萄糖 40g/L 硫酸氨 5 g/L 尿素 3g/L 磷酸二氫鉀3g/L FeSO4 0.1 g/L MnSO4 0.1 g/L 維生素B1 10mg/L 維生素H 10mg/L 維生素B3 20mg/L
用30%氫氧化鉀溶液調PH到7.5-8.0,培養基在120°C滅菌15分鐘。
[0025](3)產L-賴氨酸的培養基:作為培養基可用含有碳源、氮源、無機鹽離子及其他有機成分的普通培養基。碳源可以使用糖如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖或淀粉水解物；氮源可以使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、尿素等，有機氮源如酵母浸膏、蛋白胨、玉米漿、大豆水解液等，氨水或液氨及是可以的；無機鹽離子如硫酸鎂、氯化鉀、鐵離子、錳離子等；有機成分可以引入如酵母粉、蛋白胨等；當使用需特殊物質培養的菌株如營養缺陷性時，可直接將這些物質加入培養基中，或者使用含有這些物質的蛋白水解物、蛋白胨、玉米漿、酵母抽提物等培養基。
[0026]培養條件優選在有氧條件下連續發酵培養時間為45~60hr最佳。培養溫度優選控在28~37°C下，優選35°C。培養過程PH優選控在6.0~8.0。有機或無機、酸性或堿性物質控制PH。
[0027]該發酵培養基通過溶解下述成分(1L)
葡萄糖50g
KH2PO4 IOg
MgSO4 Ig
FeSO4 0.1g
MnSO4 0.1g
酵母粉100g
玉米漿 6g
維生素B1 30mg
維生素H 40mg維生素B3 30mg
用氨水或液氨調整PH到6.0, 120°C滅菌30分鐘。
[0028]實施例二
將菌株劃線接入斜面培養基，在31.5°C下培養24-32hr。收集平板上菌株并進行擴大培養，篩選出生長較好的菌株作為實驗菌株。從生長好的活化斜面上刮取1/4-1環種子，接Λ 500ml液體培養基中，放入搖床培養。在溫度35°C、轉速180_220r培養條件下培養18-24小時。使搖瓶種子達到對數生長期。取搖瓶種子液按10%的接種量接入含有IL發酵培養基的3L自動發酵罐B10-110 (美國NBS公司)中，發酵罐帶有溫度、PH、溶氧等自動控制功倉泛。
[0029]在發酵過程中發酵溫度控制在35°C，罐壓控制在0.03Mpa，通過調節通氣量和轉速控制溶氧在15%~25%。開始階段PH設定為7.0,發酵過程比較穩定，到6hr開始補加濃度為500~800克/升的葡萄糖溶液，同時檢測無機氮指標，發現為0.30g/dl，仍很高，到12hr時，發現無機氮指標為(以銨態氮計)0.22g/dl，開始頻繁的調高PH到7.2，并開始添加營養物質，營養物質為有機氮源、磷酸、無機鹽、維生素等，到24hr時PH調高到7.6，并進一步提高營養物質的比例；到30hr之后消耗較慢，將PH降到7.3，直到發酵結束。培養45hr，消耗葡萄糖270g，產酸率為80.5g/L，產酸總量為121.5g，糖酸轉化率為45.0%。停罐發酵液用鹽酸調節PH到5.6左右，再加熱到80度左右經過膜過濾，將濃菌體去除掉，清液賴氨酸在78.9g/l，然后用氨基酸脫色樹脂進行脫色，發酵液純度達到95.2%，脫色過濾后的發酵液用蒸發器蒸發，蒸發到物料中賴氨酸濃度達到69.6%，然后將溫度降低到45度左右結晶(上下波動不超過2度)，物料再通過離心機進行離心分離并用去離子水進行水洗，吸水量為物料體積10%左右，離心后物料通過烘干檢測相關指標，賴氨酸主含量為98.61%，水分0.7%，完全達到相關產品指標要求。母液需要重結晶進行提純。
[0030]實施例三
菌種、種子準備及發酵條件同實例二。其中:連續發酵過程中用流加稀鹽酸的方法控制PH，初始PH控在7.0，前期無機氮降低先用提高PH的方法，PH最高提到7.3。若耗無機氮消耗較快，PH在7.3時仍不能滿足氨氮需要，再流加適量的濃鹽酸控制。3hr開始流加營養物，營養物質(營養物質為有機氮源、磷酸、無機鹽和維生素)的流加比例為葡萄糖補入量的1/8-1/3。
[0031 ] 該營養物質配方通過溶解下述成分(1L)
H3PO4 IOg MgSO4 IOg KCL 5 g FeSO4 0.25g MnSO4 0.25g 酵母粉100g 玉米漿 20g 維生素B1 IOOmg 維生素H 80mg 維生素B3 70mg培養過程中初始利用調高PH來控制，12hr之后用流加洗鹽酸來控制，添加稀鹽酸能使PH穩定在7.3，且使無機氮維持在0.06g/dl的水平。培養45hr，消耗葡萄糖330g，產酸率為92.5g/L，產酸總量為161.8g，糖酸轉化率為49.03%。停罐發酵液用鹽酸調節PH到5.6左右，再加熱到80度左右經過膜過濾，將濃菌體去除掉，清液賴氨酸在91.2g/l，然后用氨基酸脫色樹脂進行脫色，發酵液純度達到94.9%，脫色過濾后的發酵液用蒸發器蒸發，蒸發到物料中賴氨酸濃度達到71.10%，然后將溫度降低到45度左右結晶(上下波動不超過2度)，物料通過離心機進行離心分離并用去離子水進行水洗，吸水量為物料體積10%左右，離心后物料通過烘干檢測相關指標，賴氨酸主含量為98.53%，水分0.58%，完全達到相關產品指標要求。母液需要重結晶進行提純。
[0032]發酵結束后，發酵液經過膜過濾去除菌體、大分子蛋白等雜質，過濾后發酵液不經過離交樹脂吸附解脫，直接通過脫色過濾及其他方法去除發酵液中其他離子等雜質，然后直接通過濃縮、調酸、結晶、重結晶(母液)、離心分離、干燥等工藝生成賴氨酸鹽酸鹽。
[0033]本發明的發酵液膜過濾后不需要經過樹脂直接濃縮結晶生產賴氨酸。過濾后發酵液硫酸根離子等陰陽離子雜質較少，可以實驗用超濾膜、脫色等方式去除發酵液中雜質，使發酵液賴氨酸純度提高到95%以上，然后經過濃縮、調酸、結晶等工藝直接生產賴氨酸。
[0034]本發明提取工藝中不需要離交工藝，傳統工藝經強酸性陽離子交換樹脂吸附解脫賴氨酸，在離交工藝中用硫酸調節物料PH,用5%氨水或液氨進行解脫，同時需要大量純水用于清洗、洗脫，而且在此過程中產生大量低濃廢水、高濃廢水，其中，高濃廢水中含有大量硫酸銨需要提取回用，生產硫酸銨的過程中產生大量冷凝水，增加了水處理成本；而新工藝中發酵液中硫酸離子較少，提取車間接受發酵液后不用硫酸調節PH值，新方法發酵液提取不經過樹脂吸附解脫，節省了大量硫酸、氨水或液氨等生產原料，同時節省大量純水，但需要用活性炭等原料進行脫色，因此其他原料有所增加。從兩種工藝對比看新工藝節省大量硫酸及硫酸銨消耗， 減少了樹脂及設備投入，增加了活性炭過濾等成本，總之，不經離交直接結晶法生產賴氨酸比離交吸附解脫法生產成本下降較多。
【權利要求】
1.一種耐高PH值菌種,該菌株為谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8184，保藏時間為2013年9月13日。
2.一種新型發酵法生產賴氨酸方法，具體包括以下步驟: (1)將生產賴氨酸的菌種，既權利要求1所述的耐高PH值谷氨酸棒桿菌接入生產賴氨酸的種子培養基中，搖床培養到對數生長期，得到生產賴氨酸的種子培養液； (2)連續發酵:將步驟(1)制得的生產賴氨酸的種液接入滅菌的發酵培養基中，其中，生產賴氨酸的培養基接種量為初始體積的10%~20%,發酵培養基中初始糖濃度為20克/升~60克/升，通過向發酵液中通入無菌空氣維持罐壓0.04~0.08MP,并開動攪拌，使發酵液中溶氧維持在15%~25% ;發酵過程使用氨水或液氨將發酵液PH控制在7.2~7.6內的任意一個值附近；在連續發酵過程中通過流加濃度為500~800克/升的葡萄糖溶液，使發酵液中葡萄糖濃度維持在5克/升~20克/升；同時向發酵液中添加營養物質，連續發酵時間為45~60hr ； (3)連續發酵結束的培養液，膜過濾后濃縮結晶生產賴氨酸。
3.根據權利要求2所述的一種新型發酵法生產賴氨酸方法，其特征在于:所述步驟(1)中的溫度為28~37°C，優選35°C。
4.根據權利要求2所述的一種新型發酵法生產賴氨酸方法，其特征在于:所述步驟(2)中連續發酵過程中溫度控制在28~37°C下，優選35°C。
5.根據權利要求2 所述的一種新型發酵法生產賴氨酸方法，其特征在于:所述步驟(2)中營養物質為有機氮源、磷酸、無機鹽和維生素； 根據權利要求5所述的一種新型發酵法生產賴氨酸方法，其特征在于:所述有機氮源為玉米漿、酵母粉和蛋白胨；無機鹽為氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳；維生素為維生素B1、維生素H和維生素B3。
6.根據權利要求4或5所述的一種新型發酵法生產賴氨酸方法，其特征在于:所述營養物質配方為下述成分，余量為水， H3PO4 10g/L MgSO4 10g/L KCL 5g/L FeSO4 0.25g/L MnSO4 0.25g/L 酵母粉100g/L 玉米漿 20g /L 維生素B1 lOOmg/L 維生素H 80mg/L 維生素B3 70mg/Lo
【文檔編號】C12P13/08GK103992964SQ201410106950
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】吳澤華, 李剛, 馮雨, 羅明剛 申請人:山東壽光巨能金玉米開發有限公司