豬圓環病毒2型高敏感性pk15細胞系l8的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬圓環病毒2型高敏感性PK15細胞系L8的制備方法，它的步驟如下：（1）將PK15細胞復蘇后培養于細胞瓶中長成細胞單層，用質量分數為0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生長液吹打，所述DMEM生長液含質量分數為10%的胎牛血清和質量分數為1%的雙抗，分散細胞成單個，用系列稀釋法進行細胞克隆；（2）通過間接免疫熒光篩選出對PCV2高敏感性的單細胞株。本發明采用更為方便高效的單細胞克隆技術獲得一株對PCV2具有更高感染率的細胞系，命名為L8。通過對該細胞系的穩定性以及純凈性檢測發現該細胞系能夠穩定的提高PCV2在細胞內的增殖滴度。
【專利說明】豬圓環病毒2型高敏感性PK15細胞系L8的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及促進2型豬圓環病毒體外細胞增殖【技術領域】。具體涉及豬圓環病毒2型高敏感性單細胞株的篩選及培養。
【背景技術】
[0002]豬圓環病毒2型(porcine cirovirus type 2, PCV2)可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、增生性壞死性肺炎、母豬繁殖與呼吸綜合征、豬皮炎與腎病綜合征和仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病，其中斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)最為常見且該病在世界范圍內廣泛流行，給各國養豬業造成了巨大的損失。此外，豬圓環病毒2型又常造成其他細菌或病毒的并發或繼發感染，從而增加了豬傳染病的預防和控制難度。
[0003]由于豬圓環病毒2型體外細胞增殖比較困難，其病毒滴度一般都在104_° —105_°TCID5Q/mL之間，免疫熒光染色顯示接種PCV2的PK15細胞中僅有20%左右的細胞對PCV2易感。這可能是制約PCV2全病毒滅活苗疫苗開發的技術瓶頸，因此研究提高PCV2在細胞內增殖滴度的方法成了國內外學者研究的熱點和難點，同時也成為了全病毒滅活苗開發所需要克服的最大障礙。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是獲得對豬圓環病毒2型具有較高敏感性的細胞株，通過對該細胞株的克隆、篩選與生物學特性的測定進一步驗證其功能，并增殖獲得具有較高滴度的豬圓環病毒2型細胞毒。
[0005]本發明涉及基于對所篩選出的細胞生物特性以及其對豬圓環2型病毒增殖促進情況的檢測。所述的克隆細胞能夠提高豬圓環病毒2型的體外增殖能力和滴度，有利于進一步研究豬圓環病毒2型體外復制、體外診斷及開發通過懸浮培養技術制備高效價PCV2全病毒滅活疫苗。
[0006]本發明的技術方案是:通過系列稀釋法克隆獲得單細胞株，并進一步通過間接免疫熒光(IFA)篩選出對PCV2高敏感性的單細胞株。一種豬圓環病毒2型高敏感性PK15細胞系L8的制備方法，它的步驟如下:
(1)將PK15細胞復蘇后培養于細胞瓶中長成細胞單層，用質量分數為0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生長液吹打，所述DMEM生長液含質量分數為10%的胎牛血清和質量分數為1%的雙抗，分散細胞成單個，用系列稀釋法進行細胞克隆；
(2)通過間接免疫熒光篩選出對PCV2高敏感性的單細胞株。
[0007]所述步驟(1)中用系列稀釋法進行細胞克隆的步驟如下:
①將PK15細胞稀釋到5xl04至lxl05cells/mL，在96孔板中，除了Al孔其他所有孔用八孔排槍加入100 μ L DMEM生長液，取稀釋好的ΡΚ15細胞液200 μ L加入到Al孔中；
②第一系列的稀釋:如圖1中豎向箭頭所示，在Al孔中取IOOyL至BI中進行倍比稀釋，用槍吸吹混勻，同樣取100 μ L至Cl孔中，以此類推進行倍比稀釋至Hl孔后，最后從Hl孔中取出100 μ L細胞混合液棄掉；
第二系列的稀釋:如圖1中橫向箭頭所示，在第一系列稀釋完之后，用八孔排槍取IOOyL細胞培養液加入到第一排中進行倍比稀釋并吸吹混勻之后，再從第一排孔中取100 μ L細胞混合液至第二排中進行同樣操作；同樣進行倍比稀釋至第十二排孔，棄掉最后取出的100 μ L細胞混合液；
③在96孔板中補加DMEM生長液至200 μ L，將培養板置于37°C 5%0)2培養箱中培養，培養4一5d時可在顯微鏡下挑出單克隆細胞孔并分別按照挑選的前后順序命名為L1、L5、L6、L8、L12和L15，繼續培養IOd即細胞長滿孔的1/3-1/2面積時可將細胞轉至24孔板中培養，細胞在24孔板中長滿后可轉至6孔板中培養，細胞在6孔板中長滿再轉至25cm2的細胞瓶中培養，在細胞培養過程中2 — 3d更換一次DMEM生長液，將培養的單細胞克隆凍存。
[0008]本發明的有益效果是:本發明采用更為方便高效的單細胞克隆技術獲得一株對PCV2具有更高感染率的細胞系，命名為L8。通過對該細胞系的穩定性以及純凈性檢測發現該細胞系能夠穩定的提高PCV2在細胞內的增殖滴度。
[0009]本發明中我們選用培養PCV2增殖所需的實驗室常用PK15細胞來作為克隆細胞的母細胞，首先通過一種更為有效簡便的系列稀釋法來獲得更多單細胞株；其次將所挑選出來的單細胞株擴大培養后，再通過特異性強的間接免疫熒光(IFA)技術對克隆細胞進行PCV2易感性的篩選。最終挑選出對PCV2細胞敏感性最高的細胞系，所克隆的細胞系細胞形態均一、生長性能好，連續傳代幾十代以后，仍然保持對PCV2高敏感性，病毒毒價可穩定在106_5TCID5tlAiL以上。在該克隆細胞株連續傳代過程中，每隔5代我們對其進行了純凈性檢驗，結果表明該克隆細胞株純凈，無支原體、無PCVl及其它外源病毒污染。這為針對PCV2的科學實驗及相關通過懸浮培養技術培養病毒提供技術支撐。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為系列稀釋法簡圖；
圖2為L8各代細胞PCVl的PCR檢測膠圖，注:M:DNA Marker DL2000，1.2為陽性對照，3為Fl代L8細胞，4為F5代L8細胞，5為FlO代L8細胞，6為F15代L8細胞，7為F20代L8細胞； 圖3為L8各代細胞PPV的PCR檢測膠圖，注:M:DNA Marker DL2000，4為陽性對照，I為Fl代L8細胞，2為F5代L8細胞，3為FlO代L8細胞，5為F15代L8細胞，6為F20代L8細胞；
圖4為L8各代細胞PRV的PCR檢測膠圖，注:M:DNA Marker DL2000, 2為陽性對照，I為Fl代L8細胞，3為F5代L8細胞，4為FlO代L8細胞，5為F15代L8細胞，6為F20代L8細胞；
圖5為L8各代細胞PRRSV的PCR檢測膠圖，注:M:DNA Marker DL2000，6為陽性對照，I為Fl代L8細胞，2為F5代L8細胞，3為FlO代L8細胞，4為F15代L8細胞，5為F20代L8細胞。
【具體實施方式】
[0011]一、豬圓環病毒2型高敏感性的PKl 5單細胞株的克隆與篩選I材料與方法 1.1材料
1.1.1細胞及毒株
PK15細胞購自中國獸藥監察所(凍存);PCV2—DF株購自河南省動物性食品安全重點實驗室。
[0012]1.1.2主要試劑
DMEM高糖培養基(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、0.25%胰蛋白酶購自索萊寶公司、0.01M PBS液的配制:取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鈉1.15g，磷酸氫二鉀0.2g,溶于800mL三蒸水中充分溶解后定容至1000mL,調pH值到7.4，高壓滅菌后4°C保存備用。
[0013]PCV2陽性血清(VMRD公司)、兔抗豬IG_g_FITC 二抗(Sigma)公司、兔血清封閉液(博士德)、D-氨基葡萄糖(Sigma公司)、DMSO購自Solarbio公司、其它試劑均為分析純試劑。
[0014]1.2 方法
1.2.1單細胞克隆的篩選方法(系列稀釋法)
PK15細胞復蘇后培養于細胞瓶中長成細胞單層，用適量0.25%的胰酶消化，加入適量DMEM生長液(含10%胎牛血清和1%雙抗)吹打，分散細胞成單個。用系列稀釋法進行細胞克隆，如圖1所示，操作如下:
(1)將細胞稀釋到5xl04至IxlO5CelWmL；
(2)在96孔板中，除了Al孔其他所有孔用八孔排槍加入100 μ L細胞培養液；
(3)取稀釋好的細胞液200μ L加入到Al孔中；
(4)第一系列的稀釋:如圖1中豎向箭頭所示，在Al孔中取IOOyL至BI中進行倍比稀釋，用槍吸吹混勻后。同樣取100μ L至Cl孔中，以此類推進行倍比稀釋至Hl孔后，最后從Hl孔中取出100 μ L細胞混合液棄掉；
(5)第二系列的稀釋:如圖1中橫向箭頭所示，在第一系列稀釋完之后，用八孔排槍取100 μ L細胞培養液加入到第一排中進行倍比稀釋并吸吹混勻之后，再從第一排孔中取100 μ L細胞混合液至第二排中進行同樣操作；以此類推進行倍比稀釋至第十二排孔，棄掉最后取出的100 μ L細胞混合液；
(6)在96孔板中補加培養基至200μ L，將培養板置于37°C 5%C02培養箱中培養；
(7)培養4一5d時可在顯微鏡下挑出單克隆細胞孔并做好標記，繼續培養IOd左右即細胞長滿孔的1/3 —1/2面積時可將細胞轉至24孔板中培養，細胞在24孔板中長滿后可轉至6孔板中培養，細胞在6孔板中長滿再轉至25cm2的細胞瓶中培養(注:細胞培養過程中2 — 3d更換一次新鮮培養液)，將培養的單細胞克隆凍存并以備后續的篩選鑒定用。
[0015]1.2.2 PCV2增值易感PK15克隆細胞篩選
復蘇不同的PK15克隆細胞，傳3代后用0.25%的胰酶消化下來，加培養基，再加10%的病毒液充分混勻后封裝到24孔板中，500 μ L/孔，置于37°C 5%C02溫箱中靜置培養24h以后，棄掉上清液。加入含2mM D-氨基葡萄糖2%胎牛血清繼續培養48h，用IFA檢測病毒感染的細胞量，挑選出PCV2易感的克隆細胞。
[0016]1.2.3間接免疫熒光試驗(IFA)
將上述的24孔板棄去維持液，用PBS洗滌3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌2次，晾干；用0.2% Tritonx-100/PBS處理接毒細胞，37°C IOmin, PBS洗滌2次，晾干；每孔加正常兔血清封閉液37°C封閉lh，倒掉；一抗處理，VMRD公司的多抗(1:1000) 37°C孵育 45min，PBS 洗 5 次；二抗處理，兔抗豬 IgG-FITC (1:200) 37°C孵育 45min，PBS 洗 5 次；PBS洗3次；80%甘油封底，熒光鏡檢。有熒光物質著染的細胞即為PCV2感染細胞。
[0017]1.2.4 PK15細胞的傳代、凍存與復蘇
將復蘇后的PK15細胞培養于細胞瓶中，待生成至細胞單層，用1mL 0.25%胰酶消化，加入6mL DMEM培養液(含10%胎牛血清和1%雙抗)吹打，分散細胞成單個，加入培養液，分瓶后放置于37°C溫箱培養1一2d，形成單層，再用適量胰酶消化，一直傳代。傳代過程中，取不同代次細胞加入適量細胞凍存液凍存。
[0018]將P5，P10, P20代PK15細胞單層，用PBS液洗2次，加入適量0.25%胰酶消化，加入適量生長液，1000rpm離心10min，去上清，加入適量細胞凍存液(DMEM)含30%胎牛血清、10% DMS0，懸浮細胞，放入凍存盒中，放置于_80°C超低溫冰箱中保存，之后再轉入液氮灌中長期保存。
[0019]1.2.5 病毒 TCID5tl 測定
用新消化的PK15細胞液將20代的病毒液做KT1到10_7倍稀釋后接種到96孔板上，每個稀釋度8孔，同時設有陰性對照。37°C，5% CO2溫箱中靜置培養，24h后，棄去培養液，加含2mM D-氨基葡萄糖2%胎牛血清的1640培養基維持液，每孔100 μ L，繼續培養48h，棄去維持液，用PBS洗滌3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌2次，晾干；用0.2%Tritonx-100/PBS處理接毒細胞，37°C IOmin, PBS洗滌2次，晾干；每孔加正常兔血清封閉液37°C封閉lh，倒掉；一抗處理，VMRD公司的多抗(1:1000) 37 °C孵育45min，PBS洗5次；二抗處理，兔抗豬IgG-FITC (1:800) 37°C孵育45min，PBS洗5次；PBS封底，熒光鏡檢。根據Karber氏法計算病毒TCID5tl。
[0020]1.2.6 L8對PCV2增殖穩定性檢測
L8克隆株的P5、P10、P15、P20分別接種等量的病毒，用IFA法檢測陽性細胞數，觀察不同代次間陽性細胞數的差異，來判定克隆株L8是否對PCV2增殖穩定。
[0021]2 結果
2.1細胞克隆與PCV2 IFA檢測
將PK15進行細胞克隆，獲得6個單克隆細胞株，分別命名為L1、L5、L6、L8、L12和L15。通過IFA檢測結果顯示，L8克隆細胞對PCV2最為易感，L12最不易感。L8克隆細胞病毒感染后72h，綠色熒光物質著染的PCV2陽性細胞數明顯增多。
[0022]2.2PK15-L8克隆細胞培養PCV2毒株TCID5tl測定
將等量的PCV2病毒分別接種到L8、L12和PK15母細胞，37°C培養48h后，分別用IFA方法測定其TCID5tlt5結果顯示，細胞克隆株L8的病毒滴度達到106 75TCID5(l/mL、L12的病毒滴度達到102 25 TCID5(l/mLPK15母細胞增殖滴度達到IO4 75 TCID5(l/mL。
[0023]2.3PK15-L8克隆細胞傳代、凍存與復蘇
將L8細胞傳代至20代，均貼壁良好，細胞長成單層后形態一致。將P5、P10、P15細胞凍存于-196 °C—個月，復蘇后均生長良好。
[0024]2.4 PK15-L8對PCV2增殖的穩定性
P5、P10、P15、P20分別接種PCV2-DF毒72h通過IFA檢測其TCID5tl，結果表明陽性細胞數量無明顯差異，可見篩選的克隆細胞對PCV2增殖比較穩定。[0025]表1不同代次的L8細胞檢測的PCV2-DF毒的TCID5tl
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【權利要求】
1.一種豬圓環病毒2型高敏感性PK15細胞系L8的制備方法，其特征在于，它的步驟如下: (1)將PK15細胞復蘇后培養于細胞瓶中長成細胞單層，用質量分數為0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生長液吹打，所述DMEM生長液含質量分數為10%的胎牛血清和質量分數為1%的雙抗，分散細胞成單個，用系列稀釋法進行細胞克隆； (2)通過間接免疫熒光篩選出對PCV2高敏感性的單細胞株。
2.根據權利要求1所述的豬圓環病毒2型高敏感性PK15細胞系L8的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中用系列稀釋法進行細胞克隆的步驟如下: ①將PK15細胞稀釋到5xl04至lxl05cells/mL，在96孔板中，除了Al孔其他所有孔用八孔排槍加入100 μ L DMEM生長液，取稀釋好的ΡΚ15細胞液200 μ L加入到Al孔中； ②第一系列的稀釋:在Al孔中取IOOyL至BI中進行倍比稀釋，用槍吸吹混勻，同樣取100 μ L至Cl孔中，以此類推進行倍比稀釋至Hl孔后，最后從Hl孔中取出100 μ L細胞混合液棄掉； 第二系列的稀釋:在第一系列稀釋完之后，用八孔排槍取100 μ L細胞培養液加入到第一排中進行倍比稀釋并吸吹混勻之后，再從第一排孔中取100 μ L細胞混合液至第二排中進行同樣操作；同樣進行倍比稀釋至第十二排孔，棄掉最后取出的100 μ L細胞混合液； ③在96孔板中補加DMEM生長液至200μ L，將培養板置于37°C 5%0)2培養箱中培養，培養4一5d時可在顯微 鏡下挑出單克隆細胞孔并分別按照挑選的前后順序命名為L1、L5、L6、L8、L12和L15，繼續培養IOd即細胞長滿孔的1/3-1/2面積時可將細胞轉至24孔板中培養，細胞在24孔板中長滿后可轉至6孔板中培養，細胞在6孔板中長滿再轉至25cm2的細胞瓶中培養，在細胞培養過程中2 — 3d更換一次DMEM生長液，將培養的單細胞克隆凍存。
【文檔編號】C12R1/91GK103898044SQ201410104575
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月20日 優先權日:2014年3月20日
【發明者】侯賢敏, 郭敬, 崔保安, 郭官鵬, 陳紅英 申請人:河南農業大學