一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗，其特征在于：含鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的真核表達質粒pcDNA3.1(+)-OmpA，質粒濃度為2mg~5mg/mL，該真核表達質粒含有鴨疫里默氏桿菌OmpA的全基因編碼序列，該基因的長度為1164個核苷酸，類型為核苷酸，全長為編碼區(qū)。本發(fā)明鴨疫里默氏桿菌疫苗安全有效，可誘導鴨機體產(chǎn)生特異性的體液免疫應答，能有效預防鴨疫里默氏桿菌的發(fā)生與流行。
【專利說明】—種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002]鴨疫里默氏桿菌iRiemerella anatipestifer, RA)引起的鴨病稱為鴨傳染性衆(zhòng)膜炎{infectious serositis),是感染鴨、鵝等多種禽類的一種急性或慢性接觸性性傳染病，鵝感染后曾被稱為鵝流感或鵝滲出性敗血癥，具有較高的發(fā)病率和死亡率。鴨疫里默氏桿菌病在我國普遍流行，幾乎遍布了所有養(yǎng)鴨地區(qū)，給養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展造成了極大的損失，特別是對西部地區(qū)蓬勃興起的養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴峻的威脅。[0003]目前，我國對鴨疫里默氏桿菌病的控制主要采取藥物為主，因其具有多種血清型，而各種不同血清之間無交叉保護性，故全國沒有的統(tǒng)一的滅活疫苗，針對地區(qū)研發(fā)出的各種疫苗也只能對相應的地區(qū)有局部有效果，都存在一定的不足，滅活疫苗免疫效果不佳，需用劑量較大，只能提供短暫保護。而DNA疫苗又稱裸疫苗，是繼滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程重組蛋白疫苗之后的第三代疫苗，目前已用于HIV、流感病毒、惡性瘧原蟲等多種病原體感染性疾病的防控，并取得了積極的進展。
[0004]據(jù)研究資料顯示，鴨疫里默氏桿菌病毒OmpA基因所編碼的OmpA蛋白是目前各地區(qū)各血清特異性強的結構蛋白，具有較強的抗原性，能誘導鴨細胞免疫和體液免疫應答反應，產(chǎn)生特異性中和抗體和各種細胞因子，在鴨疫里默氏桿菌病的預防與控制上發(fā)揮重要作用。關于基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗少見報道。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明要解決的技術問題在于，提供一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗及制備方法，該疫苗能誘導鴨產(chǎn)生良好的體液免疫應答，且不引起鴨產(chǎn)生不良反應，具有良好的生物安全性。
[0006]本發(fā)明的技術內容:
一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗，含鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的真核表達質粒pcDNA3.1 (+)-OmpA,質粒濃度為2mg~5mg/mL,該真核表達質粒含有鴨疫里默氏桿菌OmpA的全基因編碼序列，該基因的長度為1164個核苷酸，類型為核苷酸，全長為編碼區(qū)。
[0007]一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟:
第一，培養(yǎng)鴨疫里默氏桿菌貴州三穗分離株，采用DNA提取試劑盒或煮沸法提取細菌DNA，進行PCR目的基因擴增；
第二，將獲得的目的基因片段連接于PMD-18T載體，構建pMD-18T-0mpA，再轉入大腸桿菌DH5 α中；
第三，采用PCR方法從pMD-18T-0mpA擴增出OmpA基因，用Η--/ΙΙΙ+ Ba?H I進行酶切，同法處理真核表達載體PCDNA3.1(+)，然后電泳分離和分別回收目的基因；
第四，采用T4 DNA連接酶將鴨疫里默氏桿OmpA基因插入真核表達質粒pcDNA3.1 (+)中，轉化大腸桿菌DH5a ,藍白斑篩選,挑取可疑菌落于LB液體培養(yǎng)基于36°C~38°C培養(yǎng)12~18h，收集菌液采用DNA提取試劑盒提取質粒，用PCR和雙酶切進行鑒定；
第五，取鑒定為陽性重組質粒的大腸桿菌DH5 a，于LB液體培養(yǎng)基36°C~38°C培養(yǎng)12~18h后，采用大劑量質粒提取試劑盒提取得到pcDNA3.1 (+)-OmpA,即為基于鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗。
[0008]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明方法適用于鴨的免疫接種，防制鴨疫里默氏桿菌病的發(fā)生與流行，同時具有良好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下的技術優(yōu)勢和積極效果:
(I)免疫效果良好:本發(fā)明所采用真核表達載體PCDNA3.1(+)構建的鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗，肌肉注射動物后能誘導鴨產(chǎn)生良好的體液免疫應答，且真核表達質粒不易降解，性能穩(wěn)定，免疫效果持續(xù)時間長。
[0009](2)制備成本較低:本發(fā)明的DNA疫苗在需要時，只需將含重組質粒pcDNA3.1(+)-011^^的大腸桿菌0冊0進行大量培養(yǎng)后，提取重組質粒pcDNA3.l(+)_0mpA即可。
[0010](3)免疫接種方便:本發(fā)明的DNA疫苗采用肌肉注射進行接種，操作方便，不像其他滅活疫苗要求皮內或皮下注射。
[0011](4)安全無副作用:本發(fā)明的DNA疫苗不會引起毒力增強或導致基因整合，也不會引起鴨發(fā)生其他癥狀。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗的制備流程圖。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明的實施例:本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗的主要原料是由含鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的克隆質粒pMD-18T-0mpA、真核表達載體pcDNA3.1 (+)和大腸桿菌DH5a構成。
[0014]如圖1所示意，本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟: 第一，培養(yǎng)鴨疫里默氏桿菌貴州分離株，采用DNA提取試劑盒或煮沸法提取細菌DNA，
進行PCR目的基因擴增；
第二，將獲得的目的基因片段連接于PMD-18T載體，構建pMD-18T-0mpA，再轉入大腸桿菌DH5 α中；
第三，采用PCR方法從克隆質粒pMD-18T-0mpA中擴增出鴨疫里默氏桿菌OmpA基因，以核酸內切酶Η//--/III和Ba?H I進行雙酶切，同時以相同的酶處理真核表達載體pcDNA3.1 (+)，然后分別進行電泳分離和回收。
[0015]第四，采用T4 DNA連接酶將OmpA基因插入真核表達載體pcDNA3.1(+)，構建重組真核表達載體pcDNA3.1 (+) -OmpA,轉化大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍白斑篩選后，挑取可疑菌落于LB液體培養(yǎng)基于36°C~38°C培養(yǎng)12~18h，收集菌液采用DNA提取試劑盒提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定。
[0016]第五，取含鑒定為重組真核表達載體pcDNA3.1 (+) -OmpA的大腸桿菌DH5a,于LB液體培養(yǎng)基36 °C~38°C培養(yǎng)12~18h后，采用大劑量質粒提取試劑盒提取得到pcDNA3.1 (+) -OmpA,調整其濃度為2mg/mL，即為基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗。
[0017]第六，疫苗效果試驗:取第五步獲得的真核表達質粒，按每只鴨0.2mg的劑量腿部肌肉注射，分別在第6日齡首免和第20日齡二次免疫，于第16d、30 d、40d、50d和60d時抽血檢測，同時在30日齡進行攻毒免疫保護試驗，試驗組的鴨疫里默氏桿菌抗體滴度達1:800，遠遠高于空白對照組的1:50 ;試驗組的攻毒免疫保護率較高。
[0018]第七，疫苗的安全性檢測:取第五步獲得的真核表達質粒，按照0.1mg的劑量注射小鼠共12只，觀察兩周內小白鼠的臨床表現(xiàn)，并每隔2天時間剖殺，觀察內臟組織病變情況，小白鼠未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀和病理變化，且未發(fā)生死亡，說明所制備的疫苗具有良好的安全性。
[0019]通過以上第一至第七步證實，發(fā)明的基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗獲得成功。
【權利要求】
1.一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗，其特征在于:含鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的真核表達質粒pcDNA3.1 (+) -OmpA,質粒濃度為2mg~5mg/mL，該真核表達質粒含有鴨疫里默氏桿菌OmpA的全基因編碼序列，該基因的長度為1164個核苷酸，類型為核苷酸，全長為編碼區(qū)。
2.一種如權利要求1所述的一種基于OmpA基因鴨疫里默氏桿菌DNA疫苗的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 第一，培養(yǎng)鴨疫里默氏桿菌貴州三穗分離株，采用DNA提取試劑盒或煮沸法提取細菌DNA，進行PCR目的基因擴增； 第二，將獲得的目的基因片段連接于PMD-18T載體，構建pMD-18T-0mpA，再轉入大腸桿菌DH5 α中； 第三，采用PCR方法從pMD-18T-0mpA擴增出OmpA基因，用Η--/ΙΙΙ+ Ba?H I進行酶切，同法處理真核表達載體PCDNA3.1(+)，然后電泳分離和分別回收目的基因； 第四，采用T4 DNA連接酶將鴨疫里默氏桿OmpA基因插入真核表達質粒pcDNA3.1 (+)中，轉化大腸桿菌DH5a ,藍白斑篩選,挑取可疑菌落于LB液體培養(yǎng)基于36°C~38°C培養(yǎng)12^18h,收集菌液采用DNA提取試劑盒提取質粒，用PCR和雙酶切進行鑒定； 第五，取鑒定為陽性重組質粒的大腸桿菌DH5 a，于LB液體培養(yǎng)基36°C~38°C培養(yǎng)12~18h后，采用大劑量質粒提取試劑盒提取得到pcDNA3.1 (+)-OmpA,即為基于鴨疫里默氏桿菌DN A疫苗。
【文檔編號】C12N15/79GK103830746SQ201410098187
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權日:2014年3月18日
【發(fā)明者】嵇辛勤, 傅心亮, 文明, 阮涌 申請人:貴州大學