基于焦磷酸測序的檢測甲型h1n1流感病毒致病力的方法
【專利摘要】基于焦磷酸測序的檢測甲型H1N1流感病毒致病力的方法，包括對H1N1病毒血凝素基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，判斷甲型H1N1流感HA基因的裂解位點(diǎn)是否具有突變；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序?yàn)锳GCT。通過將檢驗(yàn)結(jié)果與甲型H1N1流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株的HA基因裂解位點(diǎn)序列比較，可高度準(zhǔn)確的檢測出甲型H1N1流感病毒的HA基因裂解位點(diǎn)的突變。本發(fā)明對于確定病毒毒力、致病性及宿主范圍提供了簡單、快捷的實(shí)驗(yàn)方案,避開了全基因測序所涉及的繁瑣實(shí)驗(yàn)步驟，還能準(zhǔn)確掌握病毒的變異方向,方便對其進(jìn)行監(jiān)測，隔離傳染源切斷傳播途徑，阻止疫情的進(jìn)一步擴(kuò)大。
【專利說明】基于焦磷酸測序的檢測甲型H1N1流感病毒致病力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測甲型HlNl流感病毒致病力的方法，具體涉及一種基于焦磷酸測序的檢測甲型HlNl流感病毒致病力的方法，屬于病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]2009年3月爆發(fā)的甲型HlNl流感是繼SARS、高致病性禽流感后又一次重大公共衛(wèi)生事件，給世界各國人民造成了巨大恐慌。甲型流感病毒是單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，易發(fā)生抗原漂移、抗原轉(zhuǎn)換和基因重組，尤其是病毒的外膜蛋白血凝素(HA)的突變和重組，可形成各種突變株或重組株，導(dǎo)致病毒的毒力及宿主范圍的變化，從而引起不同程度的流感流行。血凝素(HA)能否被切割成HAl和HA2是決定流感病毒致病性的重要因素，裂解位點(diǎn)的變異可引起病毒致病性的變化，分析裂解位點(diǎn)的序列，研究其進(jìn)化規(guī)律可以讓我們更深入地了解HlNl的致病性、毒力大小、宿主范圍.[0003]裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列是決定流感病毒致病力的因素之一。一般高致病性流感病毒在裂解位點(diǎn)附近都有連續(xù)4個(gè)以上堿性氨基酸(RRRR)，而低致病性流感病毒的HA裂解位點(diǎn)處一般就只有單個(gè)的堿性氨基酸(R)。高致病性流感病毒的HA裂解位點(diǎn)處多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，可以被多種蛋白酶所裂解，因而病毒可以在宿主不同組織細(xì)胞中生長繁殖，導(dǎo)致宿主的全身感染、衰竭并導(dǎo)致死亡。而低致病性流感病毒的HA蛋白裂解位點(diǎn)只能被呼吸道等少數(shù)組織細(xì)胞中的蛋白酶所裂解，因而只能在宿主的呼吸道中繁殖，導(dǎo)致溫和感染。HA蛋白的裂解位點(diǎn)的序列特征對病毒的宿主范圍、組織嗜性和致病性有著關(guān)鍵性影響，是病毒在機(jī)體中傳播的必要條件]。低致病性流感病毒有可能通過HAl區(qū)和HA2區(qū)之間的連接肽中的多種堿性氨基酸的基因突變增強(qiáng)毒力，變成高致病性的病毒株，因此，HA的裂解位點(diǎn)序列分析和監(jiān)測是非常重要
[0004]為了加強(qiáng)對HlNl快速傳播的控制及避免其爆發(fā)流行，發(fā)展快速、可靠高通量的檢測病毒突變技術(shù)是研究的熱點(diǎn)，傳統(tǒng)的基于Sanger法的全自動(dòng)DNA測序技術(shù)，在檢測病毒基因突變存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)。焦磷酸測序技術(shù)為新一代短片段DNA序列分析技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)地進(jìn)行短DNA序列分析，檢測通量高，操作簡單方便，可程序化，利用焦磷酸測序技術(shù)對甲型HlNl流感HA基因的裂解位點(diǎn)進(jìn)行檢測的研究未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明目的是提供一種基于焦磷酸測序的檢測甲型HlNl流感病毒致病力的方法，其使用焦磷酸測序方法檢測甲型HlNl流感病毒血凝素(HA)裂解位點(diǎn)的序列方法，判斷血凝素(HA)的裂解位點(diǎn)是否發(fā)生突變，導(dǎo)致病毒的毒力的變化，從而引起不同程度的流感流行。
[0006]由于血凝素(HA)能否被切割成HAl和HA2是決定流感病毒致病性的重要因素，裂解位點(diǎn)的變異可引起病毒致病性的變化，因此本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是針對甲型HlNl流感病毒裂解位點(diǎn)進(jìn)行焦磷酸測序檢測。本發(fā)明的檢測型HlNl流感病毒致病力變化的方法，首先采用RT-PCR擴(kuò)增HlNl病毒血凝素(HA)基因中片段(包含裂解位點(diǎn)序列)，隨后以焦磷酸測序法對擴(kuò)增片段進(jìn)行準(zhǔn)確測序，從而建立了一種快速、有效的裂解位點(diǎn)突變檢測方法。對于確定病毒毒力、致病性及宿主范圍提供了簡單、快捷的實(shí)驗(yàn)方案，避開了全基因測序所涉及的繁瑣實(shí)驗(yàn)步驟，還能準(zhǔn)確掌握病毒的變異方向，方便對其進(jìn)行監(jiān)測，隔離傳染源切斷傳播途徑，阻止疫情的進(jìn)一步擴(kuò)大。
[0007]本發(fā)明的主要原理為:
[0008]焦磷酸測序技術(shù)
[0009]1)焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)是全新的一種DNA序列分析技術(shù),可以快速、準(zhǔn)確地測定一段較短的目標(biāo)片段。該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，操作極為簡便。
[0010]2)焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，基本原理如下:將I個(gè)特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase)和底物混合物(包括 APS 和Luciferin)。向反應(yīng)體系中加入I種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時(shí)釋放出摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP ;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。加入另一種dNTP,使第2~4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。
[0011]3)焦磷酸測序操作系統(tǒng)中共有2個(gè)模式能進(jìn)行堿基突變的檢測，即序列分析模式(Sequence Analysis, SQA)和單核苷酸多態(tài)性模式(Single Nucleotide polymorphism,SNP)ο其中SQA模式的核苷酸加樣順序?yàn)檠h(huán)順序加樣法，即通過循環(huán)反復(fù)的加入A、G、C、T四種核苷酸以檢測出待檢樣品的序列，該法一次能準(zhǔn)確判讀40bp左右的堿基，將所測定序列與已知序列比對后自行判讀突變情況。SNP模式的核苷酸加樣順序?yàn)樘囟樞蚣訕臃?，即系統(tǒng)根據(jù)設(shè)定的待檢位點(diǎn)及位點(diǎn)周圍的序列自動(dòng)生成核苷酸的加樣順序，僅對單個(gè)位點(diǎn)的堿基變化進(jìn)行檢測，不對整個(gè)序列進(jìn)行測定。針對不同的檢測對象，需要摸索不同的焦磷酸測序檢測方法。
[0012]本發(fā)明的基于焦磷酸測序的檢測甲型HlNl流感病毒致病力的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0013]步驟I，對HlNl病毒血凝素(HA)基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；
[0014]步驟2，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，判斷甲型HlNl流感HA基因的裂解位點(diǎn)是否具有突變；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序?yàn)锳GCT。
[0015]上述步驟I中，對HlNl病毒血凝素(HA)基因進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，其中第一次RT-PCR擴(kuò)增以標(biāo)本甲型HlNl流感病毒RNA提取物為模板，第二次擴(kuò)增以第一次RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板。
[0016]上述第一次擴(kuò)增使用的PCR引物具有HlF和HlR所示序列，引物擴(kuò)增片段長度950bp,且包含裂解位點(diǎn)序列，[0017]第一PCR 引物序列如下:H1F:ACGTGTTACCCAGGAGATTTC, HlR:TCTTTACCYACTRCTGTGAA
[0018]針對甲型HlNl流感HA基因的裂解位點(diǎn)設(shè)計(jì)焦磷酸測序引物；
[0019]上述第二次擴(kuò)增使用的PCR引物具有帶有生物素標(biāo)記，此引物在甲型HlNl流感病毒血凝素(HA)基因序列是高度保守和唯一的；所用的第二次擴(kuò)增使用的PCR引物序列和測序引物序列詳見表1
[0020]表1.HA基因裂解位點(diǎn)測序引物和二次擴(kuò)增使用PCR引物
[0021]
【權(quán)利要求】
1.基于焦磷酸測序的檢測甲型HlNl流感病毒致病力的方法，其特征在于包括以下步驟:.1.對HlNl病毒血凝素(HA)基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增； .1.1用具有HlF所示序列的PCR引物和具有和HlR所示序列的PCR引物，對HlNl病毒血凝素(HA)基因進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，以提取的病毒RNA為模板；RT-PCR反應(yīng)條件為:50°C反轉(zhuǎn)錄 30min;94°C預(yù)變性 2min;94°C 15s, 55°C 30s, 68°C lmin, 45 個(gè)循環(huán)；68°C 5min ； 第一輪擴(kuò)增PCR引物序列如下:
HlF:ACGTGTTACCCAGGAGATTTC
HlR:TCTTTACCYACTRCTGTGAA .1.2用帶有生物素(Biotin)標(biāo)記的Reverse PCR引物和Forward PCR引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，模板為第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；PCR反應(yīng)過程如下: 先在94°C下進(jìn)行預(yù)熱10分鐘；在94°C下保持45秒進(jìn)行變性、64°C下保持45秒進(jìn)行退火、72°C下保持90秒進(jìn)行擴(kuò)增和延伸，循環(huán)退火過程30次；最后在72°C下保持10分鐘。 第二輪擴(kuò)增PCR引物
Reverse 引物 5'_GGTTCCCAC GATATTTGTGGT-3
Forward 引物 5' -AAAAGGTCCACC AACTTGAGAAAT-3-.2.對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，判斷甲型HlNl流感HA基因的裂解位點(diǎn)是否具有突變；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序?yàn)锳GCT，具體如下: (1)將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物固定在磁珠上， (2)將磁珠吸附在真空樣品轉(zhuǎn)移器上，再將真空樣品轉(zhuǎn)移器放入70%乙醇中輕微振蕩5秒，然后移到變性緩沖液中抽吸5秒，使DNA變性以得到純化的單鏈DNA模板，最后移到洗滌緩沖液中清洗5~10秒，洗滌未固定的單鏈DNA，從而得到作為測序模板的單鏈DNA， (3)引物雜交:先在焦磷酸測序微孔板各孔中加入退火緩沖液50μ L，再加入序列測序引物，測序引物的最低要求濃度為I P mol/L,最高濃度為0.2mmol/L,再將真空樣品轉(zhuǎn)移器從PCR板移入焦磷酸測序微孔板，關(guān)閉真空泵，將已純化好的單鏈DNA模板與序列測序物引物混和，在80°C下變性2分鐘，然后冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交； 測序引物的序列:5-GTTACTTTGGC CGTT-3 (4)焦磷酸測序:利用測序儀和試劑盒，依次在試劑倉中加入酶、底物和4種dNTPs，選用SQA檢測模式、以A、G、C、T順序循環(huán)加樣16次的堿基加入順序進(jìn)行測序反應(yīng)；通過(XD光學(xué)系統(tǒng)對每次加樣后產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以獲得特異的檢測峰，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息， (5)將焦磷酸測序檢驗(yàn)結(jié)果與甲型HlNl流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株的HAl基因裂解位點(diǎn)序列相比較，進(jìn)而判斷甲型HlNl流感HA基因的裂解位點(diǎn)是否具有突變。
2.如權(quán)利要求1所述的基于焦磷酸測序的檢測甲型HlNl流感病毒致病力的方法，其特征在于上述步驟I中，在50 μ L反應(yīng)體系中，第一引物最佳的濃度為50nmol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的基于焦磷酸測序的檢測甲型HlNl流感病毒致病力的方法，其特征在于上述步驟I中，在50 μ L反應(yīng)體系中，第二引物最佳的濃度為50nmol/L。
【文檔編號】C12Q1/70GK103834747SQ201410095889
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月16日
【發(fā)明者】陳曉光, 程琳, 郭寧, 張瑾, 姜華, 金燕, 梁潔, 張娟 申請人:山東國際旅行衛(wèi)生保健中心