永生化人軟骨終板干細胞系的制備方法及其用途
【專利摘要】本發明屬于細胞工程【技術領域】，具體涉及永生化人軟骨終板干細胞系的制備方法及其用途。本發明要解決的技術問題是為構建永生化人軟骨終板干細胞系提供一種有效的制備方法。本發明的技術方案是采用慢病毒轉染技術構建永生化人軟骨終板干細胞系的制備方法，包括如下步驟：a、構建SV40T抗原病毒載體；b、SV40T抗原基因轉染人終板干細胞；c、傳代并篩選得到永生化軟骨終板干細胞。本發明還提供了由上述方法得到的永生化人軟骨終板干細胞系在制備骨組織工程材料中的用途。本發明可應用于組織工程骨的制備，為臨床上一系列長骨缺損、骨不連病人提供一種價格低廉、成骨能力強的骨組織工程的種子細胞。
【專利說明】永生化人軟骨終板干細胞系的制備方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于細胞工程【技術領域】，具體涉及永生化人軟骨終板干細胞系的制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002]臨床上常由于某些原因如外傷、感染、腫瘤等造成開放性骨折、骨不連以及骨缺損，是運動系統疾病中常見和處理困難的疾患，也是患者喪失勞動力的重要原因。解決長骨缺損、骨不連等需要大量具有良好符合人體生物學、生物力學特性的骨移植材料。為此，許多學者進行了相關的研究，取得了一些成績，但是對于長骨缺損，仍然是運動系統疾病中的難題。隨著近年來組織工程技術的興起，骨缺損的修復研究進入組織工程的時代。目前的組織工程理論認為，種子細胞、支架材料、生長因子是組織工程的三要素。傳統上一般選用骨髓間充質干細胞作為骨組織工程的種子細胞，但其面臨諸多的局限性，包括手術病人抽取骨髓面臨二次創傷，細胞數量受限，是否具備最佳的成骨能力等。比較而言，人軟骨終板干細胞(Cartilage Endplate Stem Cells, CESCs)具有取材方便,不會給病人帶來二次創傷，易于分離培養，體外增殖能力強，同時具有較強的成骨能力。而且CESCs作為其他非組織工程的種子細胞也具有廣闊前景，許多研究證實CESCs具有成體干細胞特性，表現為較強的增殖能力和向多種間充質細胞分化的潛能。由于臨床上對骨移植材料的需求量巨大，同時組織工程技術的發展有望實現骨缺損的理想修復。但是分離原代培養的CESCs隨著傳代次數的提高，其活力越來越差，最終發生凋亡，難以存活，因此構建永生化人退變軟骨終板干細胞系具有較強的實用價值，同時為研究人終板干細胞的生物學行為提供標準細胞系，為組織工程基礎研究提供平臺，為臨床應用提供足量種子細胞，并為建立人退變軟骨終板干細胞系提供一種有效、可靠的方法。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是為構建永生化人軟骨終板干細胞系提供一種新選擇。
[0004]本發明的技術方案是永生化人退變軟骨終板干細胞系的制備方法，包括如下步驟:
[0005]將外源性猴腎病毒SV40T抗原基因轉染人終板軟骨干細胞而誘導獲得永生化人終板軟骨干細胞系；其中，外源性SV40T抗原基因通過構建成慢病毒顆粒轉染人終板軟骨干細胞；所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示；包括如下步驟:
[0006]a、構建SV40T抗原病毒載體:將表達SV40T抗原基因的逆轉錄病毒載體和包裝載體共轉染人胚腎293細胞系HEK293，包裝出表達SV40T抗原的逆轉錄病毒；
[0007]b、慢病毒轉染:將人退變軟骨終板原代干細胞傳至第3代，使細胞密度為3 X IO3/ml,按0.5ml/cm2培養面積添加含4μ g/ml聚凝胺的逆轉錄病毒,病毒滴度為IX 108TU/ml,感染2天后，換液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B篩選14天，形成篩選后的干細胞集落；[0008]C、傳代:將篩選后的干細胞集落擴增并進行連續傳至30代以上，即得到永生化的人退變軟骨終板干細胞系iCESCs，凍存備用。
[0009]其中，步驟b中的人退變軟骨終板原代干細胞采用如下方法制備:將手術中遺棄的軟骨終板標本，在無菌條件下去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環組織，得到透明狀的軟骨終板；機械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細胞。
[0010]其中，步驟b中人退變軟骨終板原代干細胞傳至第3代的培養條件如下:培養基為90%DMEM/F12，含10%的FBS (胎牛血清)，細胞長滿接近培養皿80%后傳代。
[0011]本發明還提供了由上述方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細胞系。
[0012]本發明還提供了由上述方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細胞系在制備骨組織工程材料中的用途。
[0013]本發明的有益效果:本發明方法提供一種永生化的人椎間盤軟骨終板干細胞的制備方法。該方法得到的永生化干細胞與原代培養軟骨終板干細胞具有相似的生物學特性，能向骨、軟骨及脂肪等方向誘導分化，而且較骨髓間充質干細胞具有更強的成骨分化能力，且不具成瘤性。本發明提供了永生化人軟骨終板干細胞的制備方法以及在骨組織工程中的應用，主要可應用于組織工程骨的制備，為臨床上一系列長骨缺損、骨不連病人提供一種價格低廉、成骨能力強的骨組織工程的種子細胞。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1.瓊脂糖懸浮培養篩選CESCs。A.接種于瓊脂糖中的單個細胞。B.培養六周后的單細胞克隆(黑色箭頭)和單個細胞(紅色箭頭)。C.單細胞克隆的龍膽紫染色。D.經擴增培養的CESCs。
[0015]圖2包裝的SV40T抗原慢病毒孔內可見病毒空斑。
[0016]圖3轉染后形成的單克隆細胞。
[0017]圖4單克隆細胞擴大培養后。
[0018]圖5iCESCs的干細胞標志物流式細胞術檢測。A，B為細胞流式實驗的結果。A圖縱坐標是對應⑶標志物的熒光強度。淺色線是實驗組，深色線是陰性對照組。
[0019]B圖的橫坐標是標志物的名稱，橫坐標下面的stem cell markers為干細胞標志物，Percentageof markers為標志物百分比。
[0020]圖6iCESCs的體外成骨、成脂及成軟骨誘導的組織學及分化相關基因表達的檢測。A:正常培養基，茜素紅染色，陰性；B:誘導成骨培養基，茜素紅，陽性；C:PCR檢測成骨相關基因表達情況；D:正常培養基，油紅O染色，陰性；E:誘導成脂肪培養基，油紅O染色，陽性；F:PCR檢測成脂肪相關基因表達情況；G:成軟骨誘導培養基，微球培養后成軟骨情況:成軟骨誘導培養基，微球培養后經阿爾新藍染色；1:PCR檢測成軟骨相關基因情況；J:第三代iCESCs倒置顯微鏡圖片；K:成軟骨誘導培養基，微球培養后經阿爾新藍染色后行石蠟包埋切片。
[0021]圖7.A圖為永生化后第I代。B圖為永生化后第10代。C圖為永生化后第30代。D圖為永生化后第50代。
[0022]圖8植入3個月后動物體內L2-L3橫突間干細胞-羥基灰石復合物，箭頭所示為BM-MSCs-羥基灰石復合物，三角所示為iCESCs-羥基灰石復合物。A:解剖標本，B:標本固定后O
[0023]圖9通過Micro-CT分別選取BM-MSCs組和iCESCs組對應解剖位置的相同大小組織塊。Micro-CT照片顯示如圖，圖A為MSC成骨，圖B為iCESC成骨。其中藍色代表羥基灰石支架，橙黃色代表新生骨。
[0024]圖1OBM-MSCs 組和 iCESCs 組的 TMD 值。(*:P<0.05)
【具體實施方式】
[0025]本發明永生化人終板軟骨干細胞體系制備方法及體內植骨實驗的實施例，通過目的基因克隆、真核表達質粒中目的基因序列測定、目的基因慢病毒構建、轉染SV40T抗原基因(SV40TAg)，成功轉然軟骨終板干細胞穩定表達SV40T抗原基因，從而獲得永生化軟骨終板干細胞體系，并通過體內植骨實驗證實其具有較強的成骨能力。
[0026]外源性SV40T抗原的核苷酸序列(SEQ ID N0.21):
【權利要求】
1.永生化人退變軟骨終板干細胞系的制備方法，其特征在于:將外源性猴腎病毒SV40T抗原基因轉染人終板軟骨干細胞而誘導獲得永生化人終板軟骨干細胞系；其中，外源性SV40T抗原基因通過構建成慢病毒顆粒轉染人終板軟骨干細胞；所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示；包括如下步驟: a、構建SV40T抗原病毒載體:將表達SV40T抗原基因的逆轉錄病毒載體和包裝載體共轉染人胚腎293細胞系HEK293，包裝出表達SV40T抗原的逆轉錄病毒； b、慢病毒轉染:將人退變軟骨終板原代干細胞傳至第3代，使細胞密度為3X103/ml，按0.5ml/cm2培養面積添加含4 μ g/ml聚凝胺的逆轉錄病毒，病毒滴度為I X 108TU/ml，感染2天后，換液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B篩選14天，形成篩選后的干細胞集落； C、傳代:將篩選后的干細胞集落擴增并進行連續傳至30代以上，即得到永生化的人退變軟骨終板干細胞系，凍存備用。
2.如權利要求1所述的永生化人退變軟骨終板干細胞系的制備方法，其特征在于:步驟b中的人退變軟骨終板原代干細胞采用如下方法制備:將手術中遺棄的軟骨終板標本，在無菌條件下去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環組織，得到透明狀的軟骨終板；機械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細胞。
3.如權利要求1或2所述的永生化人退變軟骨終板干細胞系的制備方法，其特征在于:步驟b中人退變軟骨終板原代干細胞傳至第3代的培養條件如下:培養基為90%DMEM/F12，含10%的胎牛血清，細胞長滿接近培養皿80%后傳代。
4.由權利要求1~3任一項所述的方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細胞系。
5.由權利要求1~3任一項所述的方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細胞系在制備骨組織工程材料中的用`途。
【文檔編號】C12N15/867GK103865877SQ201410088040
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】黃博, 劉銘漢, 王海, 劉蘭濤, 周躍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院