一種恙蟲病東方體核酸檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及恙蟲病東方體核酸檢測試劑盒，特別是涉及一種利用復合探針實時熒光PCR技術檢測恙蟲病東方體核酸的試劑盒。該試劑盒通過對樣本中的恙蟲病東方體進行定性檢測，可應用于恙蟲病東方體感染的輔助診斷。
【專利說明】一種恙蟲病東方體核酸檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及恙蟲病東方體核酸檢測試劑盒，特別是涉及一種利用復合探針技術實時熒光PCR技術檢測恙蟲病東方體的試劑盒。該試劑盒通過對樣本中的恙蟲病東方體進行定性檢測，可應用于含恙蟲病東方體感染的輔助診斷。
【背景技術】
[0002]恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi)是由恙螨幼蟲盯咬傳播而引起恙蟲病的病原體，過去稱恙蟲病立克次體。以鼠類為主要傳染源，通過恙螨幼蟲叮咬而傳播。恙蟲病東方體呈圓形、橢圓型或短桿狀。革蘭染色陰性。吉姆薩染色呈紫紅色。在發熱期間，可從病人的焦痂、血液、淋巴結或骨髓等分離出病原體。恙蟲病立克次體有自然裂解傾向，不易保存。對熱及一般消毒方法都很敏感，對低溫的抵抗力較強。恙蟲病立克次體在不同地區、不同株間的抗原性有較大差異，對人的致病力也不相同。臨床上以發熱、焦痂或潰瘍、淋巴結腫大及皮疫為特征，易造成誤診。[Ruang-areerate T, Jeamwattanalert P,Rodkvamtookff, et al.Genotype divetsity and distribution of Orientia tsutsugamushi causingscrub typhus in Thai land[J].Journal of clinical microbiology，2011，49(7):2584-2589 ;Luksameetanasan R, Blacksell S D, Kalambaheti T, et al.Patient andsample-related factots that effect the success of in vitro isolation ofOrientia tsutsugamushi[J].2007.]。
[0003]為了有效地診斷和預防恙蟲病，國內外對恙蟲病東方體的主要抗原分子進行了深入研究。研究較多的是56kD、47kD、58kD、110kD和22kD等。58kD蛋白是菌體外膜蛋白，高度保守，各株共有，系恙蟲病東方 體屬特異性抗原，也是潛在性保護性抗原。56kD蛋白是菌體主要外膜蛋白，暴露在菌體表面，與立克次體的吸附和侵入有關。該抗原含有型特異性抗原決定族，也可產生特異型保護作用。22kD蛋白也含型特異性抗原表位。47kDa蛋白是恙蟲病東方體表面含量豐富的蛋白之一，具有較強的免疫原性。由于該蛋白為屬特異性，相對于型特異性的56kDa蛋白，其在用于診斷和預防不同型別恙蟲病東方體感染方面具有潛在的優越性。[Seong S Y, Huh M S, Jang W J, et al.1nduction of homologous immuneresponse to Rickettsia tsutsugamushi Boryong with a partial56_ki lodaltonrecombinant antigen fused with the maltose-binding protein MBP-Bor56 [J].1nfection and immunity,1997,65 (4):1541-1545.； Jiang J, Chan T C, Temenak J J,et al.Development of a quantitative real-time polymerase chain reaction assayspecific for Orientia tsutsugamushi[R].NAVAL MEDICAL RESEARCH CENTER SILVERSPRING MD,2004.]。
[0004]臨床微生物實驗室對恙蟲病東方體的檢測較為困難，主要原因包括:1)血清學診斷在發病一周內很難檢測到抗體，而且病原分離操作復雜，且分離率十分低；2)病原學檢查耗時長加之分離操作過程中存在隨時致人受染的危險；3)Q熱臨床表現的多型以及多種并發癥的可能出現，給臨床診斷帶來一定的困難。現將目前臨床上檢測恙蟲病東方體的主要方法分述如下:
[0005]1.血象白細胞計數減少或正常。有其它并發癥時可增多，分類常呈中性粒細胞增多，核左移(桿狀中性粒細胞增多)。
[0006]2.病原學檢查取發熱期患者血液0.5~ImL,接種于小鼠腹腔內。若小鼠于I~2周內發病、死亡，則取其腹膜、腸系膜或脾臟剖面在載玻片上作印片，干后經姬姆薩染色，再用顯微鏡油鏡檢查。在單核細胞、巨噬細胞的胞質內可見紫紅色、成簇分布的恙蟲病東方體。
[0007]3.血清學檢查對本病的診斷有較大價值。常用有以下四種方法。
[0008](I)外斐反應(變形桿菌0X19凝集試驗):對變形桿菌OXK抗原發生凝集反應，而且效價在1: 160或以上，或早、晚期雙份血清效價呈4倍以上增長者有診斷意義。
[0009](2)補體結合試驗:應用當地代表株抗原或多價抗原進行檢測，特異度強，檢出率較聞。
[0010](3)間接免疫熒光試驗:檢測病人血清中的特異性IgM、IgG抗體。具有較高的敏感性、特異性和重現性，被視為“金標準”。
[0011]3.分子診斷方法:簡便快速，且高度敏感，解決了恙蟲病患者發病初期抗體滴度太低無法進行血清學檢測的難題，是恙蟲病早期診斷有價值的方法。其中，實時熒光PCR法則是公認的檢測細菌最準確、最快捷的方法。目前也有數種基于PCR末端和實時檢測技術被用于產KPC菌株的檢測，這些技術具有更高的特異性，但需要專業的技術人員和設備才能實施,檢測成本相對也較高。
[0012]本試驗以恙蟲病東方體47KD基因為靶序列，應用復合探針法建立了一種特異、靈敏、快速檢測恙蟲病東方體的方法。
【發明內容】
[0013]本發明的目的在于提供一種實時熒光PCR法檢測恙蟲病東方體核酸的試劑盒(下面簡稱試劑盒)，該試劑盒包括:(I)樣本處理液A、樣本處理液B、PCR反應液A、PCR反應液B、陰性對照、強陽對照、弱陽性對照。(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
[0014]為了解決上述任務，本發明的具體技術路線為:
[0015](I)針對恙蟲病東方體基因保守序列設計的能夠與靶多核苷酸結合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。
[0016](2)寡核苷酸探針標記熒光發生基團，使所說的熒光發生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結合。
[0017](3)適宜于PCR擴增的反應體系和熒光檢測體系。核酸擴增反應體系包括耐熱DNA聚合酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結合并且兩末端分別結合有熒光發生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針、含有鎂離子和甲酰胺的緩沖液。
[0018](4)從待測樣本中提取DNA，加入前述的反應體系中，直接經PCR擴增，從熒光擴增曲線判斷是否存在恙蟲病東方體。
[0019]根據本發明一個優選的實施方案，其中試劑盒的PCR反應液由10XPCR緩沖液、靶基因正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、滅菌水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物分別是5’ -AACTGATTTTATTCAAACTAATGCT-3’和5’ -AGCAAAACTTATGCCTGAGTAA-3’ ；用于靶多核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸探針是f:FAM-TGGTCCAGTTAACCAAAATGCTCTT-P, q:GATTAAACATCGGTCCACCAAA-dabcyI ；PCR 反應酶系包含Taq酶和UNG酶。
[0020]根據本發明另一個優選的實施方案，陰性質控品為滅菌水；陽性質控品為通過體外重組將目的片段基因導入T載體，構建并提取重組質粒DNA，用TE液稀釋-20C保存。用于實際檢測中的質量控制。
[0021]根據本發明提供的試劑盒，對恙蟲病東方體進行檢測，該方法包括下列步驟:
[0022](1)用樣本處理液進行陰、陽性質控品和待測樣本的DNA提取。樣本處理液除本發明提及的方法外，還可以使用其它成熟的DNA提取方法和試劑盒。
[0023](2)將提取的DNA加入到含有PCR反應液和PCR反應酶系的PCR反應管中，進行PCR擴增，使用熒光定量PCR檢測儀進行檢測。
[0024]本發明所述的試劑盒針對恙蟲病東方體檢測中的特殊性，對反應體系中引物探針濃度、Taq酶的用量、退火溫度等均進行優化，結合熒光PCR技術，用于恙蟲病東方體核酸檢測，并研制出用于恙蟲病東方體核酸檢測試劑盒，靈敏度可達到IO2拷貝/ ml。
[0025]本發明與現有技術相比，具有下列優點:
[0026](I)采用的復合探針技術為國內唯一實時熒光PCR技術(專利號:ZL99125469.4，相關論文發表于Anal Biochem, 2002, 309:206-211)，是具有自主知識產權產品。特異性更
強，靈敏度更高；
[0027](2)全封閉反應，提取細菌DNA后，直接用于PCR檢測，避免了污染發生；
[0028](3)檢測速度快，整個過程不超過2小時；
[0029](4)操作簡單，可控性強，可進行大批量樣品檢測，有利于產業化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1顯示試劑盒檢測恙蟲病東方體核酸的條件設置。
[0031]圖2顯示試劑盒檢測恙蟲病東方體核酸時不同濃度樣本的擴增曲線，二個陽性標本的擴增曲線為S形，均能夠判定為陽性。
[0032]圖3顯示試劑盒十個陰性標本的擴增曲線，均不具S形特征，能夠判定為陰性。
[0033]圖4顯示強陽性對照和弱陽性對照的擴增曲線。圖示擴增曲線為S型曲線，說明檢測體系有效擴增了恙蟲病東方體核酸。
[0034]圖5顯示陰性質控品擴增曲線。圖示擴增曲線較平為直的折線，與熒光檢測閾值線沒有交點，且曲線不呈S型，說明檢測過程中沒有恙蟲病東方體核酸的污染。
【具體實施方式】
[0035]下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。
[0036]恙蟲病東方體核酸檢測試劑盒檢測方法
[0037]1.樣品的采集
[0038]a)采集血清:取受檢者靜脈血2ml，收集于無菌離心管中，室溫放置不超過4小時，3000rpm離心20分鐘，吸取血清轉入另一無菌離心管中備用；[0039]b)采集血漿:去受檢者靜脈血2ml于含有抗凝劑的無菌離心管中(禁止使用肝素抗凝)，室溫放置不超過4小時，3000rpm離心20分鐘,分離血衆,轉入無菌離心管備用。
[0040]2.核酸提取
[0041]2.1核酸提取
[0042]a)用帶濾芯吸嘴吸取100 μ I樣品處理液A至離心管中。
[0043]b)加入100 μ I待測樣本。
[0044]c)蓋上管蓋，震蕩混勻，I, 3000rpm離心10分鐘。
[0045]d)吸棄175 μ I上清(避免攪動或碰到沉淀)。
[0046]e)加入25 μ I樣品處理液B。
[0047]f)充分震蕩混勻，低速(2000rpm)離心數秒后，100°C干浴或沸水浴10分鐘。
[0048]g) I, 3000rpm離心10分鐘，取上清為PCR反應模板(上清如不立即使用，需置_20°C保存，重新使用時需1，3000rpm離心10分鐘)。
[0049]3.PCR 檢測
[0050]3.1配制體系
[0051]a)取一支0.5ml離心管，按下列組成配制PCR反應液(N為反應管數):`[0052]PCR 反應液 A26 μ I X (Ν+1)
[0053]PCR 反應液 BI μ I X (N+i)
[0054]按27.0 μ I /管分裝至PCR反應管中。
[0055](注意:使用前確保PCR反應液充分溶解，PCR反應液B在使用前需離心以確保所有酶集中在底部)
[0056]b)加樣
[0057]將3μ I處理過的樣本上清液分別加入PCR反應管中蓋緊管蓋，6000rpm離心Imin后放入PCR擴增儀。
[0058]擴增程序設置
[0059]Bio-Rad、ABI7300 / 7500PCR擴增儀的參數設置如下
【權利要求】
1.一種實時熒光PCR法檢測恙蟲病東方體核酸的試劑盒(下面簡稱試劑盒)，該試劑盒包括:(I)樣本處理液A、樣本處理液B、PCR反應液A、PCR反應液B、陰性對照、強陽性對照、弱陽性對照；(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中試劑盒的PCR反應液由IOXPCR緩沖液、靶基因的正向引物、反向引物、寡核苷酸探針和滅菌水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物分別是5’ -AACTGATTTTATTCAAACTAATGCT-3’和5’ -AGCAAAACTTATGCCTGAGTAA-3’。
2.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于用于靶多核苷酸擴增的寡核苷酸探針是5’-FAM-TGGTCCAGTTAACCAAAATGCTCTT-P-3’ 和 5’ -GATTAAACATCGGTCCACCAAA-dabcyl-3’。
3.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR反應酶系包含Taq酶和UNG酶。
4.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于陰性質控品為滅菌水；陽性質控品為通過體外重組將目 的片段基因導入PGEM-T載體，構建并提取重組質粒DNA。
【文檔編號】C12Q1/04GK103866013SQ201410079165
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】王升啟, 陳蘇紅, 羅琳, 劉志紅, 孫曉彥, 郝寶平, 王立軍, 喬平, 劉琦琪 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所, 邢臺縣醫院