一種利用酶協同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法
【專利摘要】本發明提供一種金屬（Ca、Fe、Zn）螯合肽，具體涉及一種利用酶協同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法，屬于生物【技術領域】，以微藻蛋白為原料，采用復合蛋白酶及風味蛋白酶復配對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽，得到的肽的氨基酸序列為：eeplp。氨基酸和小肽具有促進鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬復合體如Fe、Zn的生物學利用率比無機鹽高且無毒副作用。因此，研究開發這種生物態鋅-蛋白酶解物螯合鋅，具有十分重要的意義。
【專利說明】一種利用酶協同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種金屬(Ca、Fe、Zn)螯合肽，具體涉及一種利用酶協同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]微藻蛋白源生物活性肽具有極高的營養價值、食用安全性及生理保健功能，在促進機體的生長、發育和疾病防治等方面都起著重要的作用，可作為功能性食品或食品添加劑乃至藥品應用到人們日常生活中。
[0003]鈣質缺乏是全球性的營養問題，我國人民由于以植物性膳食為主，缺鈣的現象更加嚴重，因此補鈣成為我國膳食營養研究中的重要課題。傳統的無機鈣鹽，如碳酸鈣、磷酸鈣、氯化鈣等，對維生素有一定破壞作用，生物學效價較低；有機鈣鹽，如檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖鈣等，雖然鈣吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且價格高。研究表明，多肽螯合鈣由于其獨特的螯合體制和轉運機制，易被吸收、安全無毒、價格低、可同時補充氨基酸和鈣，而成為補鈣首選。
[0004]鐵對人類健康特別是對嬰幼兒和兒童的生長發育有重要作用。雖然大分子蛋白質也可以與鐵離子結合，但這些大分子蛋白質本身也存在相對分子質量較大而很難通過腸黏膜的問題。而研究發現，氨基酸、多肽螯合鐵可以大大提高鐵離子的吸收率。
[0005]盡管自然界中鋅源十分豐富，但鋅在人體內的吸收代謝受種種因素的限制，鋅缺乏已成為我國及許多發展中國家的公共衛生問題。研究發現氨基酸和小肽具有促進鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬復合體如Fe、Zn的生物學利用率比無機鹽高且無毒副作用。因此，研究開發這種生物態鋅-蛋白酶解物螯合鋅，具有十分重要的意義。
[0006]因此，如何獲得具有金屬螯合活性的肽，就成為制備新型金屬元素補充劑迫切的研究方向。`
【發明內容】
[0007]為了解決上述問題，本發明提供了一種利用酶協同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法，使金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性得以高效地實現。
[0008]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種金屬螯合肽，是由5個氨基酸所構成的肽，所述肽的氨基酸序列為:eeplp。
[0009]所述的金屬為Ca、Fe或Zn。
[0010]一種金屬螯合肽的制備方法，以微藻蛋白為原料，采用復合蛋白酶及風味蛋白酶復配對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。
[0011]所述酶解的條件為:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時間為7小時、酶-底物重量配比為1:25 ;所述酶為復合蛋白酶和風味蛋白酶，兩種酶的重量復配比為復合蛋白酶:風味蛋白酶=2:1。
[0012]所述分離純化的具體步驟為:酶解產物首先利用T0Y0PEARL DEAE-650M陰離子交換色譜進行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5 M NaCl的0.02 M、pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min，洗脫峰在214 nm下進行測量；收集具有最高金屬螯合活性的峰，再用S印hadex G-25凝膠過濾色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進行測定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結束，進行梯度洗脫，收集體積比為28%乙腈和62%水處的洗脫峰，得到金屬螯合肽。
[0013]本發明立足于多肽具備與金屬離子螯合的作用位點，能夠與其形成穩定的化合物，且多肽-金屬螯合物具有獨特的螯合體制和轉運機制，易被吸收、可同時補充氨基酸和金屬的理論基礎，以來自于魚皮、魚鱗蛋白為原材料，通過復合蛋白酶及風味蛋白酶的切割條件控制，切割制備具有高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的肽，而使金屬螯合活性得以高效地實現。本發明為海洋源蛋白的應用提供了一條新思路。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1純化海洋源蛋白金屬螯合肽的CLC - HPLC-C18色譜圖。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
制備方法如下:
I海洋源蛋白酶解條件的優化
本技術所采用的微藻蛋白來自于實驗室自制，酶購自諾維信生物技術有限公司(中國?天津)。采用單因素實驗，分別對四個酶解因素進行考察，分別為底物濃度(1%，3%，5%和7%)、酶解溫度(40，50，55和60 °C )`、酶的復配比(復合蛋白酶:風味蛋白酶=1: 1，1: 2，1:3和 2:1 w/w)，酶-底物配比(1:100，1:50，1:25 和 1:20 w/w)以及酶解時間(1，3，5，7，9小時)。稱取5.0克海洋源蛋白溶解于100mL蒸餾水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調節至7.0。先將該溶液水浴加熱到49°C，接著再按照酶-底物配比為1:25的比例加入相應量的酶，按照預定的反應時間開始反應。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再1000Orpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性進行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大金屬螯合活性的酶解液的酶解條件是:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時間為7小時、酶-底物配比為1:25 (w/w);所述酶為復合蛋白酶和風味蛋白酶，兩種酶的復配比為復合蛋白酶:風味蛋白酶=2:1 (w/w)。
[0016](I)酶解產物的分離、純化
先在最佳酶解條件下進行酶解，得到的酶解產物先經過TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜(長50 cm，外徑1.6cm)進行分離，洗脫液為濃度梯度為0-0.5 M的NaCl的0.02mo I/L pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min，洗脫峰在214nm下進行測量；收集具有最高金屬螯合活性的峰。
[0017]對TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜分離的具有最高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的洗脫峰再進行下一步的分離，用S印adex G-25凝膠過濾色譜(長100 cm，外徑2.0cm)收集具有最高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的峰，再利用制備型RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，反相HPLC的分離條件是用10-90% (v/v)乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為I mL/min,收集各峰進行金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活力測定,洗脫液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水(v/v)的混合液結束，進行梯度洗脫，收集28%乙腈和62%水(v/v)處的洗脫峰，即洗脫時間為22.016分鐘處的洗脫峰，得到高純度的金屬螯合肽。
[0018]冷凍干燥得到本發明的金屬(Ca、Fe、Zn)螯合肽。
[0019]采用鄰-甲酚酞比色法，測定金屬螯合肽對鈣離子的螯合作用。將I mL 5 mmol/L的CaCl2和2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)加入具塞試管中，再加入I mL清蛋白肽溶液，置于恒溫加熱水浴搖床中37°C溫育2h，取出后10000 r/min常溫離心10 min。取I mL上清液，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻。放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值，將數值代入標準曲線中計算出可溶性鈣結合量。
[0020]標準曲線的制作:分別取標準Ca工作液(10 ug/ mL) O,0.2,0.4,0.6,0.8, 1.0mL于10 mL試管中，分別加去離子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，O mL，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻，放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值。以可溶性鈣含量(ug/ mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標做圖，得標準曲線公式為:y = 0.0974x - 0.0402, R2 = 0.9996。
[0021]采用鄰菲羅啉比色法，測定金屬螯合肽對鐵離子的螯合作用。將0.05 g樣品置于100 mL燒杯中，加入2 mL濃鹽酸，待樣品完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中。準確吸取5 mL樣品液于50 mL容量瓶中，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的鹽酸羥胺I mL，0.12%鄰菲羅啉I mL，然后加入10%醋酸鈉5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白溶液作參比液， 在510 nm波長處測定吸光度，將數值代入標準曲線中計算出鐵結合量。
[0022]標準曲線的制作:吸取10 ug/mL鐵的標準溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,分別置于50 mL容量瓶中，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的鹽酸羥胺I mL，0.12%鄰菲羅啉I mL，然后加入10%醋酸鈉5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白溶液作參比液，在510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，得標準曲線公式為:y =
0.1717x+0.003，R2 = 0.9994。
[0023]采用EDTA滴定法，測定金屬螯合肽對鋅離子的螯合作用。稱量螯合物100 mg于100 mL小燒杯中，加水50 mL，加入6 mol/L鹽酸數滴。搖勻后于水浴上加熱使之完全溶解，冷卻后定容至100 mL,從中吸取10 mL于三角瓶，平3份，加入NH3-NH4CI緩沖液(pH 10) 10mL,鉻黑T指示劑適量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴至藍色；紀錄消耗EDTA的毫升數，計算螯合物含鋅量。
[0024]應用T0Y0PEARL DEAE-650M 陰離子交換色譜、Sephadex G-25 分子篩、RP-HPLC 反相高效液相色譜等分離純化手段，實現顯著活性的金屬螯合蛋白肽的高效分離純化。
[0025]利用蛋白質測序儀(AppliedBiosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA,U.S.A)測定金屬螯合肽的氨基酸全序列。
[0026]純化得到的特異性金屬螯合肽具有很高的金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性，由表1可以看出，與酶解液相比，螯合肽的金屬螯合力有了很大提高。
[0027]表1純化的特異性金屬螯合肽的金屬螯合力
【權利要求】
1.一種金屬螯合肽，其特征在于:所述肽的氨基酸序列為:eeplp。
2.根據權利要求1所述的一種金屬螯合肽，其特征在于:所述的金屬為Ca、Fe或Zn。
3.—種如權利要求1所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:以微藻蛋白為原料，采用復合蛋白酶及風味蛋白酶復配對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。
4.根據權利要求3所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:所述酶解的條件為:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時間為7小時、酶-底物重量配比為1:25 ；所述酶為復合蛋白酶和風味蛋白酶，兩種酶的重量復配比為復合蛋白酶:風味蛋白酶=2:1。
5.根據權利要求3所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:所述分離純化的具體步驟為:酶解產物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜進行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5 M NaCl的0.02 M、pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min,洗脫峰在214 nm下進行測量；收集具有最高金屬螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝膠過濾色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進行測定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結束，進行梯度洗脫，收集體積 比為28%乙腈和62%水處的洗脫峰，得到金屬螯合肽。
【文檔編號】C12P21/06GK103880921SQ201410078643
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】汪少蕓, 邵彪, 林彬彬, 方衛東, 趙立娜, 廖蘭, 洪晶 申請人:福州大學