CRISPR-Cas9特異性敲除人PD1基因的方法以及用于特異性靶向PD1基因的sgRNA的制作方法

CRISPR-Cas9特異性敲除人PD1基因的方法以及用于特異性靶向PD1基因的sgRNA的制作方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，更具體地說，涉及CRISPR-Cas9特異性敲除人PD1基因的方法以及用于特異性靶向PD1基因的sgRNA。本發明提供了CRISPR-Cas9特異性敲除人PD1基因的方法以及用于特異性靶向PD1基因的sgRNA。利用本發明制備的特異性靶向人PD1基因的sgRNA能夠精確靶向人PD1基因并且實現基因敲除。該制備方法步驟簡單、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系統的敲除效率高。
【專利說明】CRISPR-Cas9特異性敲除人PD1基因的方法以及用于特異性靶向PD1基因的sgRNA
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，更具體地說涉及CRISPR_Cas9特異性敲除人PDl基因的方法以及用于特異性靶向PDl基因的sgRNA。
【背景技術】
[0002]規律成族間隔短回文重復系統(clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeat; CRISPR-associated, CRISPR_Cas9)是一種具有核酸內切酶活性的復合體，識別特定的DNA序列，進行特定位點切割造成雙鏈DNA斷裂(Double-strandbreaks, DSB),在沒有模板的條件下，發生非同源重組末端連接(Non_homologous endjoining, NHEJ),造成移碼突變(frameshift mutation),導致基因敲除(圖1)。
[0003]這一技術由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關注，在2012年開始像爆炸一般流行開來。由于其容易操作、可以同時靶向多個基因，可以高通量制備、造價低等優勢，Cas9已經成為一種發展最快的技術(Pennisi, 2013)。正是由于其優越性，這一技術在Nature推薦的2013十大進展中位列第一 (http://www.nature, com/news/365-days-nature-s-10-l.14367),在 Science 推薦的 2013 十大進展中位列第二位(http://news.sciencemaR.0rR/breakthrouRh-of-the-year-2013)0
[0004]Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA-crRNA (CRISPR RNA)和
tracrRNA (trans-activating crRNA)和祀序列互補識別的原理實現的。現在已經把兩種小RNA融合成一條RNA鏈,簡稱sgRNA (single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特異性、精確靶向目標基因是CRISPR -Cas9能否特異性敲除目標基因的先決條件，無論是脫靶還是錯誤靶向，都會影響CRISPR-Cas9對目標基因的特異性敲除。因此，能夠設計、制備出精確性和特異性靶向目標基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9基因敲除的關鍵技術(圖1)。
[0005]腫瘤免疫治療，尤其是對免疫檢查點的阻斷，是當前靶向基因治療最成功的領域。免疫檢查點是指維持免疫自我耐受，以及調節生理條件下的免疫反應強度和持續時間的一系列免疫抑制性反應。研究表明，腫瘤細胞和免疫檢查點途徑協同作用，產生了抑制腫瘤免疫的效果，特別是抑制腫瘤抗原特異的效應T細胞的作用。對免疫檢查點的阻斷，是指利用T細胞免疫檢查抑制性受體的單克隆抗體，特異性阻斷抑制性受體與其配體的結合，從而阻斷免疫檢查機制抑制T細胞活化的作用，增強效應T細胞的抗腫瘤效果。
[0006]已經成功用于臨床的腫瘤免疫治療的免疫檢查靶點之一是免疫抑制性受體，PDl基因。PDl的主要功能是限制外周組織的效應T細胞活性。腫瘤細胞表達的PDl配體和T細胞的PDl結合，抑制T細胞激活相關激酶，從而抑制效應T細胞活性。利用PDl單克隆抗體(MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224等)，抑制PDl配體和PDl結合，從而達到治療腫瘤的效果。
[0007]但是，利用PDl抗體的治療只在黑色素癌療效較好，對腎癌和肺癌有部分療效。因為利用抗體進行靶基因的治療還受到一些因素的限制:(I)抗體的作用只是暫時阻斷的作用；(2)抑制性受體有多種，如何利用多種抗體同時阻斷多種抑制性受體還沒有對策；(3)不容易研發出有效的抗體；(4)只針對細胞外靶點；(5)抗體藥物昂貴，等。
[0008]CRISPR-Cas9快速、簡便、高效、特異性靶向敲除基因，通過靶向敲除PDl基因，為實現腫瘤免疫治療提供了一種可行的策略。但是，能否設計、制備出精確性和特異性靶向PDl基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9特異性敲除PDl基因的關鍵技術。本發明的目的就是要解決這一關鍵技術問題，提供相應的技術方案，達到特異性敲除PDl基因的目的。
[0009]參考文獻:
[0010]Mali P, Esvelt KM, Church GM.Cas9as a versatile tool for engineeringbiology.Nat.Methods.2013;10(10):957-963.[0011]Pennisi E.The CRISPR craze.Science, 2013;341(6148):833-6.do1:10.1126/science.341.6148.833.[0012]Pardoll DM.The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nature Rev.Cancer, 2012;12:252-264.[0013]Mellman I, Coukos G, Dranoff G.Cancer immunotherapy comes of age.Nature, 2011;480:480-489.
【發明內容】

[0014]針對現有利用PDl抗體進行免疫檢測阻斷治療腫瘤存在的問題:(1)抗體的作用只是暫時阻斷的作用；(2)抑制性受體有多種，如何利用多種抗體阻斷多種抑制性受體還沒有對策；(3)不容易研發出有效的抗體；(4)只針對細胞外靶點；(5)開發抗體藥物費時、費力、費錢，使得抗體藥物昂貴等。本發明設計、合成了一組在CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因中特異性靶向PDl基因的sgRNA，并分別將該sgRNA與線性的pGL3_U6-SgRNA質粒連接成載體，將一對正向和方向sgRNA寡核苷酸載體與pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒一起成功轉染細胞即可實現HH基因的敲除。本申請提供了一種利用Cas9/sgRNA快速、簡便、高效、特異性敲除roi的策略。有效地解決了利用抗體治療存在的問題:(I)直接敲除roi基因，可以實現永久的效果；(2)既可以針對roi的多個編碼序列進行同時敲除，也可以針對多個靶基因進行同時敲除；`(3)提供了高效的SgRNA ; (4)既可以針對胞外，也能針對胞內靶點；(5) sgRNA只需要小量合成多核苷酸片斷，就能大批量生產。
[0015]為了解決上述技術問題，本申請的技術方案如下:
[0016]—、sgRNA寡核苷酸的設計和選擇
[0017]1.靶向PDl基因的sgRNA的設計:
[0018]因為沒有使用體外轉錄，只是構建普通載體的方式制作。所以如無特殊說明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA對應DNA序列。
[0019](I)在PDl基因上選擇5，-GGN(19)GG的序列，如果沒有5，-GGN(19)GG的序列，5’ -GN(20)GG 或者 5’ -N(21)GG 也可以。
[0020](2) sgRNA在PDl基因上的靶向位點位于基因的外顯子。
[0021](3) sgRNA在PDl基因上的靶向位點位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上。
[0022](4)在UCSC數據庫中用BLAT或NCBI數據庫中用BLAST，確定sgRNA的靶序列是
否唯一。[0023]2.靶向PDl基因的sgRNA的選擇:
[0024](I)不能離ATG起始子太近，防止轉錄會后下游另一個ATG開始而出現一個被截短的基因形式，不能保證基因完全失活；
[0025](2)sgRNA在PDl基因上的靶向位點位于整個基因的前半段，尤其宜在基因的功能結構域中；
[0026](3)選擇相隔一定距離(10~30bp)成對的位點。這樣有利于形成特異性的片段缺失，也有利于降低脫靶效應；
[0027]二、構建sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈
[0028]根據選擇的sgRNA,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已經有I或者2個G，那么就對應的省略I或者2個G);根據選擇的sgRNA，獲得其對應DNA的互補鏈，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈,如下:
[0029]Forward oligo:5' -CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0030]I I I I I I I I I I I | | | | I I
[0031 ] Reverse oligo:NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'
[0032]三、sgRNA寡聚核苷酸質粒的構建
[0033]1.線性化pGL3-U6_sgRNA質粒(結構如圖4所示)。
[0034]2.將退火的sgRNA寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3_U6-SgRNA質粒連接獲得pGL3-U6-hPDlsg 質粒。
[0035]3.轉化并涂 Amp+ 平板(50 μ g/ml)。
[0036]4.用ID N0.9的通用引物U6測序的方法鑒定陽性克隆。
[0037]5.37°C搖床搖菌過夜并用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AP-MN-P-250)抽提pGL3-U6-hPDlsg 質粒。
[0038]四、轉染細胞獲得PDl基因敲除細胞
[0039]1、按照 Lipofectamine?2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手冊，將分別帶有對應sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-hroisg質粒(可以為I種或者多種)與序列為SEQ ID N0.11的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒(結構如圖5所示)混勻，共轉染細胞。
[0040]2、用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認PDl基因已經被敲除。
[0041]更進一步的，同時利用一對相鄰(在PDl基因上的祀向起始位點相距5bp_8bp)的sgRNA可以顯著提高敲除效率。在靶向PDl的sgRNA寡核苷酸設計、選擇和合成之后，將靶向PDl的sgRNA寡聚核苷酸與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得含靶向PDl的sgRNA寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-hroisg，在轉染細胞獲得PDl基因敲除細胞過程中，如下操作:
[0042]1、按照 LipofectamineTM2000Transfection Reagent (Invitrogerull668-Ol9MA操作手冊，將兩個分 別含I個靶向PDl的sgRNA寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-hroisg(這兩個載體分別帶有的靶向PDl的sgRNA寡聚核苷酸在PDl基因上的互補起始位點相距5bp_8bp)與序列為SEQ ID N0.11的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒混勻，共轉染細胞。
[0043]2、用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認PDl基因已經被敲除。[0044]本發明還提供了特異性靶向roi基因的sgRNA，其序列如SEQ ID N0.24-203所示。
[0045]相比于現有利用PDl抗體進行免疫檢測阻斷治療腫瘤技術，本發明的優點在于:
[0046](I)抗體的作用只是暫時封閉的作用，本發明直接敲除PDl基因，可以實現永久的效果;
[0047](2)抑制性受體有多種，如何利用多種抗體封閉多種抑制性受體還沒有對策，本發明既可以針對roi的多個編碼序列進行敲除，也可以針對多個靶基因進行敲除；
[0048](3)有效的PDl抗體研發很困難，本發明提供了針對人PDl基因的一組高效的sgRNA ；
[0049](4)抗體作用只能針對細胞外靶點，本發明既可以針對胞外，也能針對胞內靶點；
[0050](5)開發抗體藥物是一項費時、費力、費錢的過程，使得抗體藥物昂貴等，利用sgRNA只需要小量合成多核苷酸片斷，就能大批量生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖lCas9實現定點切割導致DNA雙鏈斷裂過程示意圖
[0052]CRISPR/C as9系統定向識別和剪切從而導致基因敲除是通過sgRNA和Cas9實現的。sgRNA決定了 Cas9的祀向性。
[0053]圖2T7EN1酶切鑒定sgRNA/Cas9介導的基因人PDl特異性切割
[0054]以提取的HEK293T細胞基因組為模板，使用序列如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13的hPDltest For和hPDltest Rev為引物進行PCR擴增，PCR產物為390bp，純化PCR產物。將上述PCR產物取200ng退火，使用T7EN1酶切鑒定，電泳。如圖2所示，加入針對人TOl的sgRNA的樣品都出現了切割條帶，而且具有很高的效率。
[0055]圖3sgRNA/Cas9介導的基因位點特異性人PDl切割結果測序
[0056]以提取的細胞基因組為模板，使用序列如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13的hPDltest For和hPDltest Rev為引物進行PCR擴增。純化PCR產物，連入TA克隆并送測序。下劃線序列為PAM序列；㈠表示敲除。
[0057]圖4 載體 pGL3-U6_sgRNA 的結構
[0058]圖5 載體 pSTl374-NLS_f Iag-Cas9-ZF 的結構
【具體實施方式】
[0059]下面結合附圖和具體的實施例對本發明的技術方案做進一步介紹。
[0060]實施例1 CRISPR_Cas9特異性敲除人PDl基因中用于特異性靶向PDl基因的sgRNA的設計和合成
[0061]1.靶向人PDl基因的sgRNA的設計:
[0062](I)在PDl基因上選擇5，-GGN(19)GG的序列，如果沒有5，-GGN(19)GG的序列，5’ -GN(20)GG 或者 5’ -N(21)GG 也可以。
[0063](2)sgRNA在PDl基因上的靶向位點位于基因的外顯子，這樣更容易引起片段的缺失或移框突變，從而達到基因完全失活的目的。
[0064](3) sgRNA在PDl基因上的靶向位點位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上。
[0065](4)在UCSC數據庫中用BLAT或NCBI數據庫中用BLAST，確定sgRNA的靶序列是否唯一，減少潛在的脫靶位點。
[0066]根據以上方法，我們一共設計了 180個靶向人PDl基因的sgRNA，序列分別如序列表 SEQ ID N0.24-203 所示。
[0067]2.靶向人PDl基因的sgRNA的選擇:
[0068](I)靶向PDl基因的sgRNA的靶序列在PDl基因上不能離ATG起始子太近，防止轉錄會后下游另一個ATG開始而出現一個被截短的基因形式，不能保證基因完全失活。
[0069](2) sgRNA在PDl基因上的靶向位點位于整個基因的前半段，尤其宜在基因的功能結構域中。
[0070](3)在PDl基因上選擇相隔一定距離(10~30bp)成對的位點。這樣有利于形成特異性的片段缺失，也有利于降低脫靶效應。
[0071]根據以上方法，在180個靶向人PDl基因的包含PAM序列的sgRNA(序列分別如序列表SEQ ID N0.24-203所示)中符合的序列有12個(分別如序列表SEQ ID N0.40、51、52、57、63、78、82、96、101、126、128或者136所示)，由于序列較多，沒有必要——做實驗驗證，我們從中選擇了 4個(分別如序列表SEQ ID N0.52、57、78或者82所示)進行后續實驗。
[0072]3.靶向人PDl基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和構建
[0073]根據選擇的4個(分別如序列表SEQ ID N0.52、57、78或者82所示)，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已經有I或者2個G，那么就對應的省略I或者2個G);根據選擇的sgRNA，獲得其互補鏈，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分別合成(合成方法參見文獻Significant improvementof quality for long oligonucleotides by using controlled pore glass with largepores.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2005; 24 (5-7): 1037-41.)上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火，退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸，模式如下:
[0074]Forward oligo:5' -CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0075]I I I I I I I I I I I I I I I I I
[0076]Reverse οIigo:NNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5'
[0077]變性、退火體系為:
[0078]2.5 μ I forward Oligo (100 μ Μ)
[0079]2.5 μ I reverse Oligo (100 μ Μ)
[0080]I μ I NEB buffer2`[0081]4μ1滅菌水
[0082]在PCR 儀中按照以下 touch down 程序運行:95 °C, 5min ；95 - 85 °C at_2 °C /s ；85 - 25°C at-0.1°C /s ；hold at4°C。
[0083]選擇的第I 個 sgRNA(如序列表 SEQ ID N0.52 所不)，其 forward oligo 和 reverseoligo (Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.1和2所不)成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0084]選擇的第2 個 sgRNA(如序列表 SEQ ID N0.82 所不)，其 forward oligo 和 reverseoligo (Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.3和4所不)成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0085]選擇的第3 個 sgRNA(如序列表 SEQ ID N0.57 所不)，其 forward oligo 和 reverseoligo (Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.5和6所不)成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0086]選擇的第4 個 sgRNA(如序列表 SEQ ID N0.78 所不)，其 forward oligo 和 reverseoligo (Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.7和8所不)成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0087]實施例2利用CRISPR_Cas9特異性敲除人PDl基因(用于靶向PDl基因的sgRNA如序列表52所示)
[0088]1、線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質粒。
[0089]酶切體系和條件如下:
[0090]2 μ g pGL3_U6_sgRNA (400ng/μ I)；
[0091]I μ I CutSmart Buffer ；
[0092]I μ I BsaI (NEB, R0535L)；
[0093]補水至50μ 1，37°C孵育3~4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發
至管蓋上。
`[0094]酶切完成后用AxyPr印 PCR Clean up Kit (AP-PCR-250)純化回收至 20 ~40 μ I滅菌水中。
[0095]2、將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.1和2所示)與線性化的 pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsgl 質粒。
[0096]連接體系如下:
[0097]3 μ I, 50 μ M退火產物(雙鏈sgRNA寡聚核苷酸,其forward oligo如序列表SEQ IDN0.1所不，其reverse oligo如序列表SEQ ID N0.2所不)
[0098]I μ I 線性化的 pGL3_U6_sgRNA 質粒(25ng/ μ I)
[0099]I μ I Τ4 ligation Buffer
[0100]0.5μ1 T4 ligase (NEB, M0202S)
[0101]4.5μ1 滅菌水
[0102]16°C孵育I小時。
[0103]4、將上述步驟獲得的連接產物轉化DH5a感受態細胞(TransGen，⑶201)并涂Amp+平板(50 μ g/ml),并挑取克隆。
[0104]5、用如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6，用常規測序的方法鑒定獲得陽性克隆。
[0105]6、37 °C搖床搖菌過夜培養陽性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提質粒，獲得pGL3-U6-hroisgl質粒(如序列表SEQ ID N0.14所示)。
[0106]7、細胞培養與轉染
[0107](1)冊1(2931'細胞接種培養于01^]\1高糖培養液中(取(:101^，SH30022.01B)，其中含10%FBS, penicillin (100U/ml)和 streptomycin (100 μ g/ml)。
[0108](2)在轉染前分至12孔板中，待70%~80%密度時進行轉染。[0109](3)按照 Lipofectamine?2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手冊，將0.5yg pGL3-U6-hPDlsgl (如序列表SEQ ID N0.14所示)與1.5 μ g的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒(如序列表SEQ ID N0.11所示)混勻，共轉染至每孔細胞中，6 ~8 小時后換液，并加入 Blasticidin (Sigma, 15205)和 Puromycin (Merck, 540411)藥篩，48小時后收取細胞。
[0110]質粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF 的制備方法參見文獻:Shen etal.2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA_mediated gene targeting.CellResearch23, 720-723.(do1:10.1038/cr.2013.46)
[0111]8、T7EN1 酶切檢測
[0112](I)將收集的細胞在裂解液(10 μ M Tris-HCl,0.4Μ NaCl, 2μ M EDTA, 1%SDS)中用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50 μ I去離子水中。
[0113](2)使用序列如 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.13 的引物 hPDltest For 和 hPDltest Rev進行PCR擴增，用AxyPr印PCR cleanup純化獲得PCR回收產物，取200ng統一稀釋到 20 μ I 進行變性、退火，程序如:95°C,5min ；95 - 85°C at_2°C /s ；85 - 25°C at-0.1°C /s ；hold at4°C。
[0114](3)在20μ I體系中加入Τ7ΕΝ10.3μ 1，37°C酶切30分鐘后，加入2μ I 10ΧLoading Buffer,用2.5%的瓊脂糖膠電泳檢測。
[0115]9、TA克隆測序
[0116](I)將T7EN1酶切檢測步驟(2)獲得的PCR回收產物用rTaq進行加A反應。加A反應體系為:`
[0117]700 ~800ng PCR 回收產物
[0118]5 μ I 10Χ Buffer (Mg2+free)
[0119]3 μ I Mg2+
[0120]4 μ I dNTP
[0121]0.5 μ I rTaq (TAKARA, R001 AM)
[0122]補水至50 μ I體系。
[0123]37°C溫育30分鐘后，取I μ I產物與pMD19_T vector (TAKARA, 3271)連接并轉化DH5a 感受態細胞(TransGen, CD201)。
[0124](2)挑取單克隆以序列如序列表SEQ ID N0.9的通用引物U6測序，根據測序結果(如序列表SEQ ID N0.18所示)發現:靶基因PDl缺失了 sgRNA靶向的一段序列，基因敲除成功。
[0125]實施例3利用CRISPR_Cas9特異性敲除人PDl基因(用于靶向PDl基因的sgRNA如序列表SEQ ID N0.82所示)
[0126]1、線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質粒。
[0127]酶切體系和條件如下:
[0128]2 μ g pGL3_U6_sgRNA (400ng/μ I)；
[0129]I μ I CutSmart Buffer ；
[0130]I μ I BsaI (NEB, R0535L)；
[0131]補水至50μ 1，37°C孵育3~4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發至管蓋上。
[0132]酶切完成后用AxyPr印 PCR Clean up Kit (AP-PCR-250)純化回收至 20 ~40 μ I滅菌水中。
[0133]2、將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.3和4所示)與線性化的 pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsgl 質粒。
[0134]連接體系如下:
[0135]3 μ 150 μ M退火產物雙鏈sgRNA寡聚核苷酸,其forward oligo如序列表SEQ IDN0.3所不，其reverse oligo如序列表SEQ ID N0.4所不)
[0136]I μ I 線性化的 pGL3_U6_sgRNA 質粒(25ng/ μ I)
[0137]I μ I Τ4 ligation Buffer
[0138]0.5μ1 T4 ligase (NEB, M0202S)
[0139]4.5μ1 滅菌水
[0140]16°C孵育I小時。
[0141]4、將上述步驟獲得的連接產物轉化DH5a感受態細胞(TransGen,⑶201)并涂Amp+平板(50 μ g/ml),并挑取`克隆。
[0142]5、用如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6，用常規測序的方法鑒定獲得陽性克隆。
[0143]6、37 °C搖床搖菌過夜培養陽性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提質粒，獲得pGL3-U6-hroisg2質粒(如序列表SEQ ID N0.15所示)。
[0144]7、細胞培養與轉染
[0145](1)冊1(2931'細胞接種培養于01^]\1高糖培養液中(取(:101^，SH30022.01B)，其中含10%FBS, penicillin (100U/ml)和 streptomycin (100 μ g/ml)。
[0146](2)在轉染前分至12孔板中，待70%~80%密度時進行轉染。
[0147](3)按照 LipofectamineTM2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手冊，將0.5 μ g PGL3-U6-hPDlsg2質粒(如序列表SEQ ID N0.15所示)與1.5 μ g的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒(如序列表SEQ ID N0.11所示)混勻，共轉染至每孔細胞中，6 ~8 小時后換液，并加入 Blasticidin (Sigma, 15205)和 Puromycin (Merck, 540411)藥篩，48小時后收取細胞。
[0148]質粒pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF 的制備方法參見文獻:Shen etal.2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA_mediated gene targeting.Cell Research23, 720-723.(do1:10.1038/cr.2013.46)
[0149]8、T7EN1 酶切檢測
[0150](I)將收集的細胞在裂解液(10 μ M Tris-HCl,0.4Μ NaCl, 2μ M EDTA, 1%SDS)中用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50 μ I去離子水中。
[0151](2)使用序列如 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.13 的引物 hPDltest For 和 hPDltestRev進行PCR擴增，用AxyPrep PCR cleanup純化獲得PCR回收產物，取200ng統一稀釋到 20 μ I 進行變性、退火，程序如:95°C,5min ；95 - 85°C at_2°C /s ；85 - 25°C at-0.1°C /s ；hold at4°C。[0152](3)在20μ I體系中加入Τ7ΕΝ10.3μ 1，37°C酶切30分鐘后，加入2μ I IOXLoading Buffer,用2.5%的瓊脂糖膠電泳檢測。
[0153]9、TA克隆測序
[0154](I)將T7EN1酶切檢測步驟(2)獲得的PCR回收產物用rTaq進行加A反應。加A反應體系為:
[0155]700 ~800ng PCR 回收產物
[0156]5 μ I IOX Buffer (Mg2+free)
[0157]3 μ I Mg2+
[0158]4 μ I dNTP
[0159]0.5 μ I rTaq (TAKARA, ROOI AM)
[0160]補水至50 μ I體系。
[0161]37°C溫育30分鐘后，取I μ I產物與pMD19-T vector (TAKARA, 3271)連接并轉化DH5a 感受態細胞(TransGen, CD201)。
[0162](2)挑取單克隆以序列如序列表SEQ ID N0.9的通用引物U6測序，根據測序結果(如序列表SEQ ID N0.19所示)發現:靶基因PDl缺失了 sgRNA靶向的一段序列，基因敲除成功。
[0163]實施例4利用CRISPR`_Cas9特異性敲除人PDl基因(用于靶向PDl基因的sgRNA如序列表SEQ ID N0.57所示)
[0164]1、線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質粒。
[0165]酶切體系和條件如下:
[0166]2 μ g pGL3_U6_sgRNA (400ng/μ I)；
[0167]I μ I CutSmart Buffer ；
[0168]I μ I BsaI (NEB, R0535L)；
[0169]補水至50μ 1，37°C孵育3~4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發
至管蓋上。
[0170]酶切完成后用AxyPr印 PCR Clean up Kit (AP-PCR-250)純化回收至 20 ~40 μ I滅菌水中。
[0171]2、將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.5和6所示)與線性化的 pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsgl 質粒。
[0172]連接體系如下:
[0173]3 μ I 50 μ M退火產物(雙鏈sgRNA寡聚核苷酸,其forward oligo如序列表SEQ IDN0.5所不，其reverse oligo如序列表SEQ ID N0.6所不)
[0174]I μ I 線性化的 pGL3_U6_sgRNA 質粒(25ng/ μ I)
[0175]I μ I Τ4 ligation Buffer
[0176]0.5μ1 T4 ligase (NEB, M0202S)
[0177]4.5μ1 滅菌水
[0178]16°C孵育I小時。
[0179]4、將上述步驟獲得的連接產物轉化DH5a感受態細胞(TransGen,⑶201)并涂Amp+平板(50 μ g/ml),并挑取克隆。
[0180]5、用如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6，用常規測序的方法鑒定獲得陽性克隆。
[0181]6、37°C搖床搖菌過夜培養陽性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提質粒，獲得 pGL3-U6-hTOIsg3 (如序列表 SEQ ID N0.16 所示)。
[0182]7、細胞培養與轉染
[0183](1)冊1(2931'細胞接種培養于01^]\1高糖培養液中(取(:101^，SH30022.01B)，其中含10%FBS, penicillin (100U/ml)和 streptomycin (100 μ g/ml)。
[0184](2)在轉染前分至12孔板中，待70%~80%密度時進行轉染。
[0185](3)按照 LipofectamineTM2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手冊，將0.5 μ g PGL3-U6-hPDlsg3質粒(如序列表SEQ ID N0.16所示)與1.5 μ g的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒(如序列表SEQ ID N0.10所示)混勻，共轉染至每孔細胞中，6 ~8 小時后換液，并加入 Blasticidin (Sigma, 15205)和 Puromycin (Merck, 540411)藥篩，48小時后收取細胞。
[0186]質粒pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF 的制備方法參見文獻:Shen etal.2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA_mediated gene targeting.Cell Research23, 720-723.(do1:10.1038/cr.2013.46)`[0187]8、T7EN1 酶切檢測
[0188](I)將收集的細胞在裂解液(10 μ M Tris-HCl,0.4Μ NaCl, 2μ M EDTA, 1%SDS)中用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50 μ I去離子水中。
[0189](2)使用序列如 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID 勵.13的引物詘01 test Foi^PhPDltest Rev進行PCR擴增，用AxyPr印PCR cleanup純化獲得PCR回收產物，取200ng統一稀釋到 20 μ I 進行變性、退火，程序如:95°C,5min ；95 - 85°C at_2°C /s ；85 - 25°C at-0.1°C /s ；hold at4°C。
[0190](3)在 20μ I 體系中加入 T7EN10.3μ 1，37°C 酶切 30 分鐘后，加入 2μ I IOXLoadingBuffer,用2.5%的瓊脂糖膠電泳檢測。
[0191]9、TA克隆測序
[0192](I)將T7EN1酶切檢測步驟(2)獲得的PCR回收產物用rTaq進行加A反應。加A反應體系為:
[0193]700 ~800ng PCR 回收產物
[0194]5 μ I 10Χ Buffer (Mg2+free)
[0195]3 μ I Mg2+
[0196]4μ I dNTP
[0197]0.5 μ I rTaq (TAKARA, R001 AM)
[0198]補水至50 μ I體系。
[0199]37°C溫育30分鐘后，取I μ I產物與pMD19_T vector (TAKARA, 3271)連接并轉化DH5a 感受態細胞(TransGen, CD201)。
[0200](2)挑取單克隆以序列如序列表SEQ ID N0.9的通用引物U6測序，根據測序結果(如序列表SEQ ID N0.20所示)發現:靶基因PDl缺失sgRNA靶向的序列，基因敲除成功。[0201]實施例5利用CRISPR_Cas9特異性敲除人PDl基因(用于靶向PDl基因的sgRNA如序列表SEQ ID N0.78所示)
[0202]1、線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3-U6_sgRNA質粒。
[0203]酶切體系和條件如下:
[0204]2 μ g pGL3_U6_sgRNA (400ng/μ I)；
[0205]I μ I CutSmart Buffer ；
[0206]I μ I BsaI (NEB, R0535L)；
[0207]補水至50μ 1，37°C孵育3~4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發
至管蓋上。
[0208]酶切完成后用AxyPr印 PCR Clean up Kit (AP-PCR-250)純化回收至 20 ~40 μ I滅菌水中。
[0209]2、將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.7和8所示)與線性化的 pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsg4 質粒。
[0210]連接體系如下:
[0211]3 μ 150 μ M`退火產物(雙鏈sgRNA寡聚核苷酸,其forward oligo如序列表SEQ IDN0.7所不，其reverse oligo如序列表SEQ ID N0.8所不)
[0212]I μ I 線性化的 pGL3-U6_sgRNA 質粒(25ng/ μ I)
[0213]I μ I T4 ligation Buffer
[0214]0.5μ1 T4 ligase (NEB, M0202S)
[0215]4.5μ1 滅菌水
[0216]16°C孵育I小時。
[0217]3、將上述步驟獲得的連接產物轉化DH5a感受態細胞(TransGen,⑶201)并涂Amp+平板(50 μ g/ml),并挑取克隆。
[0218]4、用如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6，用常規測序的方法鑒定獲得陽性克隆。
[0219]5、37 °C搖床搖菌過夜培養陽性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提質粒，獲得 pGL3-U6-hTOIsg4 (如序列表 SEQ ID N0.17 所示)。
[0220]6、細胞培養與轉染
[0221](1)冊1(2931'細胞接種培養于01^]\1高糖培養液中(取(:101^，SH30022.01B)，其中含10%FBS, penicillin (100U/ml)和 streptomycin (100 μ g/ml)。
[0222](2)在轉染前分至12孔板中，待70%~80%密度時進行轉染。
[0223](3)按照 LipofectamineTM2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手冊，將0.5 μ g PGL3-U6-hPDlsg4 (如序列表SEQ ID N0.17所示)與1.5 μ g的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒(如序列表SEQ ID N0.11所示)混勻，共轉染至每孔細胞中，6 ~8 小時后換液，并加入 Blasticidin (Sigma, 15205)和 Puromycin (Merck, 540411)藥篩，48小時后收取細胞。
[0224]質粒pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF 的制備方法參見文獻:Shen etal.2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA_mediated gene targeting.Cell Research23, 720-723.(do1:10.1038/cr.2013.46)
[0225]8、T7EN1 酶切檢測
[0226](I)將收集的細胞在裂解液(10 μ M Tris-HCl10.4Μ NaCl, 2μ M EDTA, 1%SDS)中用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50 μ I去離子水中。
[0227](2)使用序列如 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.13 的引物 hPDl test For 和 M3Dltest Rev進行PCR擴增，用AxyPr印PCR cleanup純化獲得PCR回收產物，取200ng統一稀釋到 20 μ I 進行變性、退火，程序如:95°C,5min ；95 - 85°C at_2°C /s ；85 - 25°C at-0.1°C /s ；hold at4°C。
[0228](3)在20 μ I體系中加入Τ7ΕΝ1 0.3 μ 1，37 °C酶切30分鐘后，加入2 μ IIOXLoading Buffer,用2.5%的瓊脂糖膠電泳檢測。
[0229]9、TA克隆測序
[0230](I)將T7EN1酶切檢測步驟(2)獲得的PCR回收產物用rTaq進行加A反應。加A反應體系為:
[0231]700 ~800ng PCR 回收產物
[0232]5 μ I IOX Buffer (Mg2+free)
[0233]3 μ I Mg2+
[0234]4 μ I dNTP`
[0235]0.5 μ I rTaq (TAKARA, ROO1ΑΜ)
[0236]補水至50 μ I體系。
[0237]37°C溫育30分鐘后，取I μ I產物與pMD19_T vector (TAKARA, 3271)連接并轉化DH5a 感受態細胞(TransGen, CD201)。
[0238](2)挑取單克隆以序列如序列表SEQ ID N0.9的通用引物U6測序，根據測序結果(如序列表SEQ ID N0.21所示)發現:靶基因PDl缺失sgRNA靶向的序列，基因敲除成功。
[0239]實施例6利用CRISPR_Cas9特異性敲除人PDl基因
[0240]用于靶向HH基因的sgRNA為兩個sgRNA共靶向，其序列如序列表SEQ IDN0.52和82所示，這兩個sgRNA在PDl基因上的靶向起始位點相距5bp，可以顯著提高敲除效率。
[0241]1、線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質粒。
[0242]酶切體系和條件如下:
[0243]2 μ g pGL3_U6_sgRNA (400ng/μ I)；
[0244]I μ I CutSmart Buffer ；
[0245]I μ I BsaI (NEB, R0535L)；
[0246]補水至50μ 1，37°C孵育3~4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發
至管蓋上。
[0247]酶切完成后用AxyPr印 PCR Clean up Kit (AP-PCR-250)純化回收至 20 ~40 μ I滅菌水中。
[0248]2、將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.1和2所示)與線性化的 pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsgl 質粒。
[0249]將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.3和4所示)與線性化的pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsg2 質粒。
[0250]連接體系如下:
[0251]3 μ I 50 μ M退火產物(雙鏈sgRNA寡聚核苷酸,其forward oligo如序列表SEQ IDN0.1所示,其reverse oligo如序列表SEQ ID N0.2所示)或者(雙鏈sgRNA寡聚核苷酸，其 forward oligo 如序列表 SEQ ID N0.3 所不，其 reverse oligo 如序列表 SEQ ID N0.4所示)
[0252]1μ 1線性化的 pGL3_U6_sgRNA 質粒(25ng/ μ I)
[0253]1μ 1Τ4 ligation Buffer
[0254]0.5 μ 1Τ4 ligase (NEB, M0202S)
[0255]4.5 μ 1滅菌水
[0256]16°C孵育1小時。
[0257]4、將上述步驟獲得的連接產物分別轉化DH5a感受態細胞(TransGen,⑶201)并涂Amp+平板(50 μ g/ml),并挑取克隆。
[0258]5、用如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6，用常規測序的方法鑒定獲得陽性克隆。
[0259]6、37 °C搖床搖菌過夜培養陽性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提質粒，獲得 pGL3-U6-hPDlsgl (如序列表 SEQ ID N0.14 所示)和pGL3-U6-hPDlsg2 (如序列表 SEQ ID N0.15 所示)。
[0260]7、細胞培養與轉染
[0261](1)冊1(2931'細胞接種培養于01^]\1高糖培養液中(取(:101^，SH30022.01B)，其中含10%FBS, penicillin (100U/ml)和 streptomycin (100 μ g/ml)。
[0262](2)在轉染前分至12孔板中，待70%~80%密度時進行轉染。
[0263](3)按照 LipofectamineTM2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手冊，將0.5 μ g pGL3-U6-hPDlsgl (如序列表SEQ ID N0.14所示)和0.5 μ gpGL3-U6-hPDlsg2 (如序列表 SEQ ID N0.15 所示)與 1.5 μ g 的 pST1374_NLS_f lag_Cas9_ZF質粒(如序列表SEQ ID N0.11所示)混勻，共轉染至每孔細胞中，6~8小時后換液，并加入Blasticidin (Sigma, 15205)和 Puromycin (Merck, 540411)藥篩，48 小時后收取細胞。
[0264]質粒pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF 的制備方法參見文獻:Shen etal.2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA_mediated gene targeting.Cell Research23, 720-723.(do1:10.1038/cr.2013.46)
[0265]8、T7EN1 酶切檢測
[0266](1)將收集的細胞在裂解液(10 μ M Tris-HCl,0.4Μ NaCl, 2μ M EDTA, 1%SDS)中用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50 μ I去離子水中。
[0267](2)使用序列如 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID 勵.13的引物詘01 test Foi^PhPDltest Rev進行PCR擴增，用AxyPr印PCR cleanup純化獲得PCR回收產物，取200ng統一稀釋到 20 μ 1進行變性、退火，程序如:95°C,5min ；95 - 85°C at_2°C /s ；85 - 25°C at-0.1°C /s ；hold at4°C。
[0268](3)在 20μ I 體系中加入 T7EN10.3μ 1，37°C 酶切 30 分鐘后，加入 2μ I IOXLoadingBuffer,用2.5%的瓊脂糖膠電泳檢測。
[0269]如圖2所示，通過瓊脂糖膠電泳可以發現:發生斷裂末端連接修復的基因組會因為與原基因組不完全匹配，而被T7EN1切割。顯示出較小的條帶。
[0270]9、TA克隆測序
[0271](I)將T7EN1酶切檢測步驟(2)獲得的PCR回收產物用rTaq進行加A反應。加A反應體系為:
[0272]700 ~800ng PCR 回收產物
[0273]5 μ I IOX Buffer (Mg2+free)
[0274]3 μ I Mg2+
[0275]4 μ I dNTP
[0276]0.5 μ I rTaq (TAKARA, ROO1ΑΜ)
[0277]補水至50 μ I體系。
[0278]37°C溫育30分鐘后，取I μ I產物與pMD19_T vector (TAKARA, 3271)連接并轉化DH5a 感受態細胞(TransGen, CD201)。
[0279](2)挑取單克隆以序列如序列表SEQ ID N0.9的通用引物U6測序，根據測序結果(如序列表SEQ ID N0.22所示`)發現:靶基因PDl缺失了兩個sgRNA靶序列的中間一段，基因敲除成功(如圖3所示)。
[0280]實施例7利用CRISPR_Cas9特異性敲除人PDl基因
[0281]用于靶向HH基因的sgRNA為兩個sgRNA共靶向，其序列如序列表SEQ IDN0.57和78所示，這兩個sgRNA在PDl基因上的靶向起始位點相距8bp，可以顯著提高敲除效率。
[0282]1、線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質粒。
[0283]酶切體系和條件如下:
[0284]2 μ g pGL3_U6_sgRNA (400ng/μ I)；
[0285]I μ I CutSmart Buffer ；
[0286]I μ I BsaI (NEB, R0535L)；
[0287]補水至50μ 1，37°C孵育3~4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發
至管蓋上。
[0288]酶切完成后用AxyPr印 PCR Clean up Kit (AP-PCR-250)純化回收至 20 ~40 μ I滅菌水中。
[0289]2、將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.5和6所示)與線性化的 pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsg3 質粒。
[0290]將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0.7和8所示)與線性化的pGL3-U6-sgRNA 質粒相連獲得 pGL3_U6_hPDlsg4 質粒。
[0291]連接體系如下:
[0292]3 μ I 50 μ M退火產物(sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDN0.5所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID N0.6所示)或者(sgRNA寡聚核苷酸,其forward oligo 如序列表 SEQ ID N0.7 所不，其 reverse oligo 如序列表 SEQ ID N0.8 PJf示)
[0293]I μ I 線性化的 pGL3-U6_sgRNA 質粒(25ng/ μ I)
[0294]I μ I T4 ligation Buffer
[0295]0.5 μ I Τ4 ligase (NEB, M0202S)
[0296]4.5 μ I 滅菌水
[0297]16O孵育I小時。
[0298]4、將上述步驟獲得的連接產物分別轉化感受態細胞DH5a (TransGen,⑶201)并涂Amp+平板(50 μ g/ml),并挑取克隆。
[0299]5、用如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6，用常規測序的方法鑒定獲得陽性克隆。
[0300]6、37 °C搖床搖菌過夜培養陽性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提質粒，獲得pGL3-U6-hTOlsg3質粒(如序列表SEQ ID N0.16所示)和pGL3-U6-hPDlsg4 質粒(如序列表 SEQ ID N0.17 所示)。
[0301]7、細胞培養與轉染
[0302](1)冊1(2931'細胞接種培養于01^]\1高糖培養液中(取(:101^，SH30022.01B)，其中含10%FBS, penicillin (100U/ml)和 streptomycin (100 μ g/ml)。
`[0303](2)在轉染前分至12孔板中，待70%~80%密度時進行轉染。
[0304](3)按照 Lipofectamine?2000Transfection Reagent (Invitrogen,11668-019)的操作手冊，將0.5yg PGL3-U6-hPDlsg3質粒(如序列表SEQ ID N0.16所示)和0.5 μ gpGL3-U6-hPDlsg4質粒(如序列表SEQ ID N0.17 所示)與 1.5 μ g 的pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF質粒(如序列表SEQ ID N0.11所示)混勻，共轉染至每孔細胞中，6~8小時后換液，并加入Blasticidin (Sigma, 15205)和 Puromycin (Merck, 540411)藥篩,48 小時后收取細胞。
[0305]質粒pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF 的制備方法參見文獻:Shen etal.2013, Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA_mediated gene targeting.Cell Research23, 720-723.(do1:10.1038/cr.2013.46)
[0306]8、T7EN1 酶切檢測
[0307](I)將收集的細胞在裂解液(10 μ M Tris-HCl,0.4Μ NaCl, 2μ M EDTA, 1% SDS )中用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50 μ I去離子水中。
[0308](2)使用序列如 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID 勵.13的引物詘01 test Foi^PhPDltest Rev進行PCR擴增，用AxyPr印PCR cleanup純化獲得PCR回收產物，取200ng統一稀釋到 20 μ I 進行變性、退火，程序如:95°C,5min ；95 - 85°C at_2°C /s ；85 - 25°C at-0.1°C /s ；hold at4°C。
[0309](3)在20μ I體系中加入T7EN1 0.3 μ 1，37 °C酶切30分鐘后，加入2 μ I 10ΧLoading Buffer,用2.5%的瓊脂糖膠電泳檢測。
[0310]如圖2所示，通過瓊脂糖膠電泳可以發現:發生斷裂末端連接修復的基因組會因為與原基因組不完全匹配，而被T7EN1切割。顯示出較小的條帶。
[0311]9、TA克隆測序
[0312](I)將T7EN1酶切檢測步驟(2)獲得的PCR回收產物用rTaq進行加A反應。加A反應體系為:[0313]700 ~800ng PCR 回收產物
[0314]5 μ I IOX Buffer (Mg2+free)
[0315]3 μ I Mg2+
[0316]4μ I dNTP
[0317]0.5 μ I rTaq (TAKARA, ROO1AM)
[0318]補水至50 μ I體系。
[0319]37°C溫育30分鐘后，取I μ I產物與pMD19_T vector (TAKARA, 3271)連接并轉化感受態細胞 DH5a (TransGen, CD201)。
[0320](2)挑取單克隆以序列如序列表SEQ ID N0.9的通用引物U6測序，根據測序結果(如序列表SEQ ID N0.23所示)發現:靶基因PDl缺失了兩個sgRNA靶序列的中間一段，基因敲除成功(如圖3所示)。`
【權利要求】
1.在CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因中用于特異性靶向PDl基因的SgRNA，其特征為: (1)所述SgRNA在HH基因上的靶序列符合5’-GGN (19) GG、5’ -GN (20) GG或者5’ -N (21)GG的序列排列規則； (2)所述SgRNA在PDl基因上的靶序列位于基因的外顯子； (3)所述SgRNA在PDl基因上的靶序列位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上； (4)所述SgRNA在PDl基因上的靶序列是唯一的。
2.如權利要求1所述的在CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因中用于特異性靶向HH基因的sgRNA，其特征為:其對應的DNA序列如序列表SEQ ID N0.24-203任意一條序列所/Jn ο
3.如權利要求1所述的在CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因中用于特異性靶向HH基因的sgRNA，其特征為:其對應的DNA序列如序列表SEQ ID N0.40、51、52、57、63、78、82、96、101、126、128或者136任意一條序列所示。
4.如權利要求1所述的在CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因中用于特異性靶向HH基因的sgRNA，其特征為:其對應的DNA序列如序列表SEQ ID N0.52、57、78或者82任意一條序列所示。
5.CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因的方法，其特征為包括如下步驟: (I)權利要求1-4任意一項所述的sgRNA，在其對應DNA序列的5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已經有I或者2個G，那么就對應的省略I或者2個G，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ;權利要求1_4任意一項所述的sgRNA,獲得其對應DNA序列的互補鏈,并且在互補鏈的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;將合成的I對互補的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸； (2 )線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質粒；將退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得pGL3_U6-hroisg質粒；pGL3-U6-hPD I Sg質粒轉化感受態細菌并涂Amp+平板，挑選陽性克隆并用序列如序列表SEQID N0.9所示的通用引物U6測序的方法鑒定出陽性克隆；37° C搖床搖陽性克隆菌過夜并用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AP-MN-P-250)抽提 pGI^-TO-hFOlsg 質粒； (3)用脂質體裝載pGL3-U6-hroisg質粒和序列為SEQID N0.11的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF 質粒，共轉染細胞； (4)用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認PDl基因已經被敲除并獲得基因敲除的細胞。
6.如權利要求5所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因的方法，其特征為:步驟(3)所述的脂質體為 Lipofectamine ? 2000 Transfection Reagent。
7.如權利要求6所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PD I基因的方法，其特征為:步驟(1)所述的sgRNA其對應的DNA序列為序列表SEQ ID N0.52、82、57或者78任意一條序列所示，分別對應的步驟(2)和(3)所述的pGL3-U6-hroisg質粒的序列為序列表SEQ ID N0.14、15 、16或者17任意一條序列所示，即sgRNA序列為SEQ IDN0.52 對應的 pGL3-U6-hPDlsg 質粒為 SEQ ID N0.14，sgRNA 序列為 SEQ ID N0..82 對應的 pGL3-U6-hPDlsg 質粒為 SEQ ID N0.15，sgRNA 序列為 SEQ ID N0.57 對應的 pGL3-U6-hPDlsg 質粒為 SEQ ID N0.16，sgRNA 序列為 SEQ ID N0.78 對應的pGL3-U6-hPDlsg 質粒為 SEQ ID N0.17。
8.在如權利要求7所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因的方法中用到的pGL3-U6-hPDlsg質粒，其特征為序列如序列表SEQ ID N0.14、15、16或者17任意一條所述。
9.CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因的方法，其特征為包括如下步驟: (I)權利要求1-4任意一項所述的sgRNA，在其對應的DNA鏈5’加上CCGG合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ;權利要求1-4任意一項所述的sgRNA,獲得其對應DNA的互補鏈，并且在互補鏈的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;將合成的I對互補的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸； (2 )線性化序列如序列表SEQ ID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質粒；將退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得pGL3_U6-hroisg質粒；pGL3-U6-hPD I Sg質粒轉化感受態細菌并涂Amp+平板，挑選陽性克隆并用序列如序列表SEQID N0.9所示的通用引物U6測序的方法鑒定出陽性克隆；37° C搖床搖陽性克隆菌過夜并用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AP-MN-P-250)抽提 pGI^-TO-hFOlsg 質粒； (3)用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent裝載兩種或者兩種以上不同的pGL3-U6-hPDlsg質粒和 序列為 SEQ ID N0.11 的 pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF質粒，共轉染細胞； (4)用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認PDl基因已經被敲除并獲得基因敲除的細胞。
10.如權利要求9所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因的方法，其特征為:步驟(3)所述的不同的pGL3-U6-hroisg質粒為兩種，且這兩種不同的pGL3-U6_hroisg質粒對應所含的兩個sgRNA片段在PDl基因上的靶向起始位點相距5 -8bp。
11.如權利要求9所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PDl基因的方法，其特征為:步驟(3)所述的兩種不同的pGL3-U6-hroisg質粒的序列為SEQ ID N0.14和15，這兩個pGL3-U6-hPDlsg質粒對應所含的兩個sgRNA片段在PDl基因上的靶向起始位點相距5 bp ；或者步驟(3)所述的兩種不同的pGL3-U6-hroisg質粒的序列為SEQ ID N0.16和17，這兩個pGL3-U6-hroisg質粒對應所含的兩個sgRNA片段在PDl基因上的靶向起始位點相距8bp ο
【文檔編號】C12N15/113GK103820454SQ201410077474
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月4日 優先權日:2014年3月4日
【發明者】胡邊, 黃行許 申請人:黃行許