利用藍藻生產異戊二烯的制作方法
【專利摘要】本發明公開了利用藍藻生產異戊二烯的方法，包括：包含異戊二烯基焦磷酸異構酶和異戊二烯合成酶的融合蛋白。本發明對藍藻進行遺傳改造，在藍藻中表達植物來源的異戊二烯合成酶（IspS），通過多種方法顯著地提高了基因工程藍藻生產異戊二烯的產量，并且這些研究結果可以還應用于基因工程藍藻表達其他外源蛋白，極大地拓展了基因工程藍藻的應用范圍，具有廣泛的工業應用前景。
【專利說明】利用藍藻生產異戊二烯
[0001]本申請是申請號201310128943.8、申請日2013年04月15日、發明創造名稱“利
用藍藻生產異戊二烯”的發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及利用藍藻生產異戊二烯的方法。
【背景技術】
[0003]異戊二烯是重要的大宗基礎原料，主要用于合成異戊橡膠，以用于制造輪胎。同時用于生產甲基庚烯酮、薰衣草醇等多種精細化工產品。還用于生產集成電路用的光刻橡膠以及合成潤滑油添加劑等。此外，最近的研究表明異戊二烯還可以轉化成生物燃料，如航空燃料。
[0004]目前，工業上異戊二烯主要用石油基原料生產，即利用溶劑萃取蒸餾法分離煉油副產物中的C5餾分。 該制備方法費用高且異戊二烯的純度低，隨著化石資源的日益短缺、石油價格的不斷上漲，預計異戊二烯的生產供應將受到限制、成本將進一步提高。還有通過化學合成異戊二烯，如丙酮和乙烯反應，丙烯聚合等，但同樣面臨著效率低，純度低，成本高的問題。另一方面，隨著世界經濟的發展，輪胎的需求量不斷的增加，而天然橡膠的的生產由于種植土地有限、病蟲害等原因受到限制，導致異戊二烯的需求量呈現快速增長。因此，迫切需要開發出一種高純度、低成本的異戊二烯制造技術。
[0005]異戊二烯是種類繁多的萜類化合物的組成單體。目前發現的異戊二烯的生物合成途徑有兩條(圖1):(1)甲羥戊酸(MVA)途徑，以三個乙酰輔酶A分子為原料，形成甲羥戊酸，繼而經過焦磷酸化，脫羧化合成異戊二烯基焦磷酸(IPP)，再經過異構，形成二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP), DMAPP在異戍二烯合成酶(isoprene synthease)的作用下生成異戍二烯。(2)磷酸甲基赤蘚糖(MEP)途徑，以丙酮酸和三磷酸甘油醛為原料，形成脫氧木酮糖-5-磷酸，還原異構生成甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)，繼而經過一系列的反應生成羥甲基丁烯-4-磷酸(HMDPP)，再在HMDPP還原酶的作用下同時生成IPP和DMAPP，DMAPP在異戊二烯合成酶的作用下生成異戊二烯。
[0006]目前僅有植物來源的異戊二烯合成酶基因(ispS)克隆和鑒定出來，分別來自楊樹(Populus alba;Populus tremloides) (Mliter et.al.Planta2001213:483-487;Sasakiet.al.FEBS Letters579(2005)2514-2518)和葛藤(Kudzu) (Sharkey et.al.PlantPhysiologyl37 (2005) 700-712)o植物在特定環境條件下(如熱脅迫等)會釋放異戊二烯，但收集植物釋放的異戊二烯非常困難，效率低，而且植物生長緩慢，所以遠遠不能滿足需求。
[0007]近年來隨著代謝工程和合成生物學技術的迅速發展，利用微生物發酵法生產萜類化合物取得重大進展。美國Genencor公司通過遺傳改造大腸桿菌BL21(E.coli BL21),獲得高產異戊二烯工程菌。具體來說，向大腸桿菌中導入改造后的楊樹來源的異戊二烯合成酶(IspS)，進而導入外源的MVA途徑、并且過表達磷酸葡萄糖酸內酯酶，最后通過發酵條件的優化，使異戊二烯的產量達到60g/L。然而，大腸桿菌發酵法合成異戊二烯，需要消耗大量的葡萄糖和淀粉。
[0008]藍藻等光合微生物能夠通過光合作用固定空氣中的CO2，在光生物反應器中較快生長。因此通過對藍藻進行基因工程改造，將CO2直接生物轉化為異戊二烯，不僅能夠降低底物成本，還可以減少CO2的排放，因而具有重要的現實意義。Melis et.al.首次在聚胞藻(Synechocystis)中成功表達了葛藤來源的異戍二烯合成酶,并檢測到異戍二烯的合成，但產量(50μ g/L)很低，遠遠不能滿足工業化生產的要求。
【發明內容】
[0009]為了解決現有的異戊二烯的生產方法中存在的產量低、成本高的缺陷，本申請的發明人通過比較藍桉、楊樹、葛藤等不同來源的異戊二烯合成酶，并且對其進行密碼子優化后在聚胞藻中表達，進一步通過對異戊二烯合成途徑的代謝流量的優化，結果顯著地提高了聚藻基因工程菌合成異戊二烯的產量。
[0010]因此，本發明的目的在于提供利用藍藻生產異戊二烯的方法。
[0011]為解決上述的技術問題，本發明采用以下技術方案:
[0012]根據本發明的第一個方面，一種融合蛋白，所述融合蛋白包含異戊二烯基焦磷酸異構酶和異戊二烯合成酶。
[0013]根據本發明的優選實施例，所述異戊二烯基焦磷酸異構酶來源自釀酒酵母。
[0014]根據本發明，所述異戊二烯合成酶來源自楊樹、藍桉或葛藤。
[0015]根據本發明的優選實施例，所述異戊二烯基焦磷酸異構酶位于所述異戊二烯合成酶的N端。
[0016]根據本發明的第二個方面，一種利用藍藻生產異戊二烯的方法，在藍藻中表達如上所述的融合蛋白。
[0017]本發明的有益效果:通過構建表達Id1-1spS融合蛋白，發現可以顯著提高基因工程藍藻的異戊二烯合成，可應用于藍藻合成各種萜類化合物的研究。
[0018]本發明對藍藻進行遺傳改造，在藍藻中表達植物來源的異戊二烯合成酶(IspS)，并檢測到異戊二烯的生成，繼而通過融合蛋白表達的方法研究，顯著地提高了基因工程藍藻生產異戊二烯的產量，并且這些研究結果還可以應用于基因工程藍藻表達其他外源蛋白，極大地拓展了基因工程藍藻的應用范圍，具有廣泛的工業應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為異戊二烯的生物合成途徑示意圖。
[0020]圖2為pKS2的質粒示意圖。
[0021 ]圖3為pKS3的質粒示意圖。
[0022]圖4為藍藻合成異戊二烯的MEP途徑示意圖。
[0023]圖5A為重組菌株ss005、ss016和ss017合成異戊二烯的累積產量圖。
[0024]圖5B為重組菌株ss016的異戊二烯生產產率結果圖。
[0025]圖5C為重組菌株ss005、ss016和ss017的生長曲線圖。
[0026]圖6A為重組菌株ss016、ss019、ss020、ss021合成異戊二烯的累積產量圖。
[0027]圖6B為重組菌株ss016、ss019、ss020、ss021的生長曲線圖。[0028]圖7為重組菌株ss016、ss022和ss023合成異戊二烯的累積產量圖。
【具體實施方式】
[0029]以下通過具體實施例，對本發明做進一步詳細說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。
[0030]本發明涉及異戊二烯合成途徑在藍藻中的構建、優化及其應用。具體而言，通過構建表達Id1-1spS融合蛋白，發現可以顯著提高基因工程藍藻的異戊二烯合成，研究了具有不同Linker (連接肽)的融合蛋白對異戊二烯合成的影響，可應用于藍藻合成各種萜類化合物的研究。
[0031]本發明中所用的菌株和生長條件如下:
[0032]克隆宿主大腸桿菌DH5a和蛋白表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)購自Novagen公司。所有的大腸桿菌在含有相應的抗性LB培養基中，37°C培養。
[0033]聚胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803由日本國立環境研究所微生物菌種保藏中心(NIES Microbial Culture Collection)提供。聚胞藻 PCC6803 在 BGll 液體培養基中培養。固體培養基在BGll液體培養基中添加1.5%的瓊脂和0.15%的硫代硫酸鈉。發酵培養基在BGll液體培養基中添加0.lmol/L的碳酸氫鈉，調節pH至7.5，過濾除菌。培養條件:30°C，光強2000~35001ux。對于轉化后的重組菌添加20 μ g/ml的相應的抗生素；
[0034]其中，所述BGll液體培養基的組成如下=NaNO3L 5g/L、MgSO4.7H200.075g/L、CaCl2.2Η200.036g/L、HEPES (20mM) 4.76g/L、StcokllmL、Stock2 (Trace metal mix A5)1mT,.Stock31mL ；
[0035]Stockl:檸檬酸.Η206.567g/L、檸檬酸鐵銨 6g/L、EDTANa.2Η201.107g/L ；
[0036]Stock2:H3B032.86g/L、MnSO4.H2Ol.545g/L、ZnSO4.7H200.222g/L、CuSO4.5H200.079g/L、Na2MoO4.2H200.391g/L、CoCl2.6H200.0404g/L ；
[0037]Stock3 =K2HPO4.3H2052g/L、Na2C0320g/L。
[0038]本發明中所用的質粒信息如下:
[0039]所有質粒均為pBluescript KS+ (購自Stratagene公司)衍生質粒,用于通過同源重組整合到聚胞藻PCC6803基因組中表達目的基因。
[0040]本發明中所用的引物信息如表1所示。
[0041]表1、引物信息
[0042]
【權利要求】
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含異戊二烯基焦磷酸異構酶和異戊二烯合成酶。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述異戊二烯基焦磷酸異構酶來源自釀酒酵母。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述異戊二烯合成酶來源自楊樹、藍桉或葛藤。
4.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述異戊二烯基焦磷酸異構酶位于所述異戊二烯合成酶的N端。
5.—種利用藍藻生產異戍二烯的方法,其 特征在于,在藍藻中表達如權利要求1-4中任一項所述的融合蛋白。
【文檔編號】C12R1/01GK103789293SQ201410076573
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年4月15日 優先權日:2013年4月15日
【發明者】楊琛, 高翔, 劉鄧, 高方 申請人:上海工業生物技術研發中心