一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應用。本發明提供了引物組，包括DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ和DNA片段-Ⅳ；所述DNA片段-Ⅰ、所述DNA片段-Ⅱ、所述DNA片段-Ⅲ和所述DNA片段-Ⅳ均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段-Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段-Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段-Ⅳ如序列表的序列4所示。本發明提供的引物組基于LAMP法，檢測時間短（在恒溫條件下1個小時內就可完成檢測）、實驗條件簡單、可通過多種方式進行結果評判（肉眼觀察濁度、顏色反應）、檢測特異性強、靈敏性度高，非常適合出入境檢驗檢疫口岸及現場檢測。
【專利說明】—種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應用。
【背景技術】
[0002]馬鈴薯帚頂病毒(Potato mop-top virus, PMTV)為屬于帚狀病毒科(Virgaviridae)馬鈴薯帚頂病毒屬(Pomovirus)的RNA病毒,是我國進境檢疫性有害生物，主要分布在愛爾蘭、丹麥、芬蘭、挪威、荷蘭、英國、捷克、日本、美國和加拿大等國家。馬鈴薯帚頂病毒嚴重影響馬鈴薯的產量和品質，受侵染的馬鈴薯塊莖產生環狀或弧狀壞死，由病薯長成的馬鈴薯植株會表現出帚頂、奧古巴花葉和褪綠V型紋等癥狀。
[0003]馬鈴薯帚頂病毒可隨病薯塊或組培苗通過運輸遠距離傳播，在田間可以通過土壤中的馬鈴薯粉痂菌Spongospora subterranea、汁液摩擦接種等途徑傳播。該病毒的傳播介體-馬鈴薯粉痂菌在我國內蒙古、廣東、貴州、江西、浙江、云南、甘肅等地均有報道。由于PMTV可以在馬鈴薯粉痂菌的休眠孢子中保持很長時間的侵染力，同時缺少有效的抗PMTV馬鈴薯品種，PMTV很難被控制。近年來，我國多次從馬鈴薯起源中心地區(如秘魯、智利等)引進馬鈴薯品種資源，也從荷蘭、英國、美國等馬鈴薯產業強國引進種薯、組培苗，加大了PMTV的傳播風險，若其一旦傳入國內，將會給我國馬鈴薯產業造成巨大損失，必須引起重視。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種引物組及其在鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應用。
[0005]本發明首先提供了引物組A，包括DNA片段-1、DNA片段-11、DNA片段-1II和DNA片段-1V ;所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示。
[0006]所述引物組A可由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V組成。
[0007]所述引物組A還可包括DNA片段-V ;所述DNA片段-V為單鏈DNA片段，如序列表的序列5所示。
[0008]所述引物組A可由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V組成。
[0009]本發明還提供了引物組B，包括DNA片段-V1、DNA片段-vn、DNA片段-VDI和DNA片段-1X ;所述DNA片段-VKDNA片段-VI1、所述DNA片段-VDI和所述DNA片段-1X均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互補序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互補序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互補序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互補序列所示。[0010]所述引物組B還可包括DNA片段-X ;所述DNA片段-X為單鏈DNA片段，如序列表的序列5的反向互補序列所示。
[0011]所述引物組B可由所述DNA片段-V1、所述DNA片段-VI1、所述DNA片段-珊、所述DNA片段-1X和所述DNA片段-X組成。
[0012]本發明還保護以上任一所述引物組A或以上任一所述引物組B在輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應用。
[0013]本發明還保護一種輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒的方法，依次包括如下步驟:
[0014](1)以待測病毒的RNA為模板，用所述引物組A或所述引物組B進行RT-LAMP反應；
[0015](2)通過檢測步驟(1)的產物輔助鑒定待測病毒是否為馬鈴薯帚頂病毒。
[0016]可采用實時濁度儀進行所述步驟(2)的檢測，如果出現擴增曲線、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果沒有出現擴增曲線、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。
[0017]可通過目測進行所述步驟(2)的檢測，如果出現白色混濁物、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果沒有出現白色混濁物、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。本方法無需采用特定儀器，對于條件較艱苦的地域和單位更為實用。
[0018]RT-LAMP反應體系中含有鈣黃綠素熒光染料時，可通過自然光或紫外燈下觀察進行所述步驟(2)的檢測 。自然光下，如果體系顯示為綠色、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果體系顯示為橙黃色、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。紫外光下，如果體系顯示熒光、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果體系不顯示熒光、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。本方法無需采用特定儀器，對于條件較艱苦的地域和單位更為實用。
[0019]可通過電泳進行所述步驟(2)的檢測，如果出現階梯狀條帶、待測病毒為候選的馬鈴薯帚頂病毒，如果沒有出現階梯狀條帶、待測病毒為候選的非馬鈴薯帚頂病毒。本方法無需采用特定儀器，對于條件較艱苦的地域和單位更為實用。
[0020]所述待測病毒為馬鈴薯帚頂病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯V病毒或甜菜土傳病毒。
[0021]本發明還保護以上任一所述引物組A或以上任一所述引物組B在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
[0022]本發明還保護一種試劑盒，包括以上任一所述引物組A或以上任一所述引物組B ;所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
[0023]本發明提供的弓丨物組基于LAMP法，檢測時間短(在恒溫條件下I個小時內就可完成檢測)、實驗條件簡單、可通過多種方式進行結果評判(肉眼觀察濁度、顏色反應等)、檢測特異性強、靈敏性度高，非常適合出入境檢驗檢疫口岸及現場檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為實施例3的步驟一的結果。
[0025]圖2為實施例3的步驟二的結果。
[0026]圖3為實施例4的結果。[0027]圖4為實施例5的結果。
[0028]圖5為實施例6的步驟一的結果。
[0029]圖6為實施例6的步驟二的結果。
[0030]圖7為實施例7的步驟一的結果。
[0031]圖8為實施例7的步驟二的結果。
[0032]圖9為實施例7的步驟三的結果。
[0033]圖10為實施例7的步驟四的結果。
[0034]圖11為實施例7的步驟五的結果。
【具體實施方式】[0035]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0036]馬鈴暮帝頂病毒(Potato mop-top virus, PMTV):RNA病毒，參考文獻:SatuLatvala-Kilbyj Johanna M.Aura, NedaPupolaj et al.Detection of Potato mop-topvirus in Potato Tubers and Sprouts: Combinations of RNA2and RNA3Variants andIncidence of Symptomless Infections.The American Phytopathological Society,2009，99(5):519-531)0
[0037]馬鈴墓Y 病毒(Potato virus Y，PVY):RNA 病毒；參考文獻:Bushra Tabassum，Idrees Ahmad Nasir，Tayyab Husnain.Potato Virus Y mRNA Expression KnockdownMediated by siRNAs in Cultured Mammalian Cell Line.Virologica Sinica，2011,26(2):105-113o
[0038]馬鈴薯X病毒(Potato virus X, PVX):RNA病毒；參考文獻:姚東校,洪鮑,楊立昌等.馬鈴薯X病毒貴州分離物的分子鑒定.廣東農業科學，2013，(13):139-141.。
[0039]馬鈴薯A病毒(Potato virus A, PVA):RNA病毒；參考文獻:劉洪義，張永江，劉忠梅，馬鈴薯A病毒液相芯片快速檢測方法的建立.中國農學通報，2013，29 (15): 37-41。
[0040]馬鈴薯V 病毒(Potato virus V, PVV):RNA 病毒；參考文獻:FatemehShamsadden — Saeed，Hossain Massumi, Sakineh Morad1.1ncidence andcharacterization of Potato virus V infections in Iran.1ndian Journal ofVirology, 2014，25(I):78-84。
[0041]甜菜土傳病毒(Beetsoil-borne virus，BSBV):RNA 病毒；參考文獻:R.Koenig，C.W.A.Plei j, G.Biittner.Structure and variability of the3/ end of RNA3of Beetsoil-borne pomovirus - a virus with uncertain pathogenic effects.Archives ofVirology.2000，145(6):1173_1181。
[0042]Loopamp RNA擴增反應試劑盒:日本Eiken Chemical公司，貨號為LMP244。
[0043]Loopamp DNA擴增反應試劑盒:日本Eiken Chemical公司，貨號為LMP204。
[0044]實施例中所用的實時濁度儀均為日本Eiken Chemical公司的LA-320C實時濁度儀。[0045]實施例1、構建標準品質粒
[0046]1、提取馬鈴薯帚頂病毒的總RNA并反轉錄為cDNA。
[0047]2、以步驟I得到的cDNA為模板，采用Fl和Rl組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
【權利要求】
1.引物組A，包括DNA片段-1、DNA片段-11、DNA片段-1II和DNA片段-1V;所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示。
2.如權利要求1所述的引物組A，其特征在于:所述引物組A由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1II和所述DNA片段-1V組成。
3.如權利要求1所述的引物組A，其特征在于:所述引物組A還包括DNA片段-V;所述DNA片段-V為單鏈DNA片段，如序列表的序列5所示。
4.如權利要求3所述的引物組A，其特征在于:所述引物組A由所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V組成。
5.引物組B，包括DNA片段-VKDNA片段-VIKDNA片段-VDI和DNA片段-1X;所述DNA片段-V1、DNA片段-νπ、所述DNA片段-VDI和所述DNA片段-1X均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互補序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互補序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互補序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互補序列所示。
6.如權利要求5所述的引物組B，其特征在于:所述引物組B還包括DNA片段-X;所述DNA片段-X為單鏈DNA片段，如序列表的序列5的反向互補序列所示。
7.權利要求1至6中任一所述的引物組在輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒中的應用。
8.一種輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒的方法，依次包括如下步驟: (1)以待測病毒的RNA為模板，用權利要求1至6中任一所述的引物組進行RT-LAMP反應； (2)通過檢測步驟(1)的產物輔助鑒定待測病毒是否為馬鈴薯帚頂病毒。
9.權利要求1至6中任一所述的引物組在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): Ca)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
10.一種試劑盒，包括權利要求1至6中任一所述的引物組；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑒定馬鈴薯帚頂病毒；(b)輔助鑒定植物是否被馬鈴薯帚頂病毒侵染。
【文檔編號】C12Q1/70GK103834644SQ201410076470
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月4日 優先權日:2014年3月4日
【發明者】趙竹, 丁小蘭, 李明福, 張永江, 許瑾, 宋云, 何增磊 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院