一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法

一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法
【專利摘要】單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法。涉及一種核酸適體篩選技術，建立快速、高效的單克隆表面展示核酸適體篩選新方法。所述方法包括如下步驟：（1）將氨基修飾的正向引物通過NHS-氨基反應偶聯到NHS修飾的微球表面；（2）將寡核苷酸文庫通過液滴單分子微乳PCR以單克隆的形式擴增到偶聯有正向引物的微球表面，每個微球上僅展示一種核酸序列；（3）通過單克隆微球庫與靶標相關作用，可視化地考察表面展示序列與靶標的結合程度；（4）直接挑選獲得能和靶標分子結合的單克隆微球，獲取微球上的DNA序列，即可獲得高質量核酸適體。該方法快速、高效、經濟，實現了分子識別可視化監測，并可在無需克隆、測序、合成的條件下實現了富集庫中核酸適體的快速篩選，獲得選擇性好、親和力強的核酸適體。
【專利說明】一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法【技術領域】
[0001]本 發明涉及一種針對多種靶標的單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，屬于核酸適體篩選技術開發領域。
【背景技術】
[0002]核酸適體作為一類新型的分析、診斷分子，自出現以來，受到科研工作者的廣泛關注。因其優于傳統蛋白單克隆抗體的諸多特性，核酸適體已成為新興的研究領域，在科研、疾病診斷和治療試劑等方面逐步取代傳統的抗體類診斷和生物技術產 品° (1.G.Mayer, The chemical biology of aptamers, Angew Chem Int EdEngl [J].2009,48,2672-2689;2.M.Mascini, 1.Palchetti, S.Tombelli, Nucleic acid andpeptide aptamers: fundamentals and bioanalytical aspects, Angew Chem Int EdEngl [J].2012，51，1316-1332.)核酸適體是指從人工合成的單鏈DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高特異性地和高親和力地與靶標分子結合的單鏈寡核苷酸。核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間弱作用力形成特殊的三維結構，如發夾、假結、凸環、G-四聚體等，從而特異地識別靶物質甚至影響其生物活性。核酸適體本身特有的生化特性使其在生物醫學應用領域具有諸多優勢，如靶分子范圍廣、親和力與特異性強、合成修飾方便快速、分子量較小、良好的生物兼容性、無毒、體外穩定性好等。
[0003]目前人們研究和報道的絕大多數核酸適體都是通過SELEX技術獲得的。SELEX技術即配體指數富集系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)，主要是基于達爾文的進化論思想:變異、選擇、復制，在試管里模擬自然環境中的進化過程，在很短的時間內篩選出符合特定要求的核酸適配體。該方法最早由 Larry Gold、Jack Szostak 及 Gerald Joyce 于 1990 年提出。(3.C.Tuerk, L.Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands tobacteriophage T4DNA polymerase, Science[J].1990, 249, 505-510;4.A.D.Ellington, J.ff.Szostak, Invitro Selection of RNA Molecules That Bind Specific Ligands, Nature[J].1990，346，818-822.)伴隨著功能核酸在生物學、醫藥學、環境和疾病檢測等方面逐步擴大的影響和應用前景，如何準確、高效、經濟地獲得更多的功能核酸也成為人們關注的焦點。在至今的二十多年里，SELEX技術不斷被研究者革新、創新，篩選方式更是變得靈活多樣，篩選的靶分子也從金屬離子、有機小分子、蛋白質等拓展到了細胞、組織等復雜靶標，顯示了該技術強大的應用空間。
[0004]SELEX最基本的篩選途徑是:首先，將大容量的隨機寡核苷酸序列庫(1013~1015個隨機寡核苷酸序列)與靶分子共同孵育，通過各種分離途徑將靶標分子-寡核苷酸復合物與未結合的寡核苷酸序列分離。再通過熱變性等洗脫方式獲得與靶分子結合的寡核苷酸序列，并對這些序列進行聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增生成次級文庫，用于下輪篩選。如此數輪反復篩選后得到富集文庫，對該富集文庫進行細菌單克隆并測序，最終獲得能夠特異性識別靶分子的寡核苷酸序列，即核酸適配體。用于篩選的隨機寡核苷酸庫的兩端通常為固定序列，與PCR擴增的引物序列匹配；中間為15~60個堿基的隨機序列，幾乎涵蓋了所有可能的立體構象，理論上可以針對任何靶分子篩選出特異性的核酸適配體。
[0005]SELEX技術是一個相對復雜的過程，其篩選成功率受到眾多因素影響，如文庫的設計、分離技術的針對性和普適性、靶分子的結構性質、緩沖液的類型以及所含離子種類等。目前尚未有報道針對任意靶標的標準SELEX篩選方法。通常蛋白質或小分子靶標須進行8-12輪篩選，細胞、組織等甚至需要20輪，耗費大量人力和時間，也同時限制了核酸適體的發展。[0006]近年來，一些新的核酸適體篩選技術被不斷開發。在SELEX篩選過程中，有效地分離出能與靶分子識別的序列是最關鍵的步驟。一些新的技術例如基于毛細管電泳、流式細胞儀、微流控芯片、等的分離方法被提出，為核酸適體的篩選提供了新的發展方向。(5.S.D.Mendonsa, Μ.T.Bowser, In vitro evolution of functionalDNA using capillary electrophoresis,J Am Chem Soc[J].2004，126，20-21;6.M.S.Raddatz, A.Dolf, E.Endl, et al.Enrichment of cel 1-targeting andpopulation-specific aptamers by fluorescence-activated cell sorting,AngewChem Int Ed Engl [J].47, 28, 5190-5193; 7.X.Lou, J.Qian, Y.Xiao, et al.Micromagneticselection of aptamers in microfluidic channels,Proc Natl Acad Sci U SA[J].2009, 106，2989-2994.)這些新的技術能有效提高分離效率，減少篩選輪數。另一方面，在傳統的SELEX過程結束后，需將最后得到的富集庫進行細菌克隆并測序，再通過結構分析等方式從幾十到數百條候選序列中挑出占比例最多、最具有結合潛質的二級結構作為候選序列，帶有很強的人為主觀性。然后通過化學方法合成這些序列，單獨計算每一條序列與靶標的親和力，最終得到最優核酸適體。后續處理過程冗長、耗時耗力且成本較高。而這一方面的改進工作卻鮮有報道。
[0007]我們有理由相信，隨著SELEX技術的發展和完善，核酸適體將在臨床檢測、治療藥物及生物分離等方面擔當更重要的角色。

【發明內容】

[0008]現有的核酸適體篩選方法復雜、繁瑣、低效、昂貴等問題，本發明的第一目的在于提供一種快速、簡單、高效、低成本的單克隆表面展示核酸適體篩選方法。
[0009]本發明的第二目的在于提供一種快速、簡單、高效、低成本地單克隆表面展示核酸適體篩選方法用于細胞核酸適體的篩選。
[0010]本發明的本發明的第三目的在于提供一種快速、簡單、高效、低成本地單克隆表面展示核酸適體篩選方法用于蛋白和小分子的核酸適體篩選。
[0011]所述單克隆表面展示核酸適體篩選方法包括如下步驟:(I)將氨基修飾的正向引物通過NHS-氨基反應偶聯到NHS修飾的微球表面；(2)將寡核苷酸文庫通過液滴單分子微乳PCR以單克隆的形式擴增到偶聯有正向引物的微球表面，每個微球上僅展示一種核酸序列；(3)通過單克隆微球庫與靶標相關作用，可視化地考察表面展示序列與靶標的結合程度；(4)直接挑選獲得能和靶標分子結合的單克隆微球，獲取微球上的DNA序列，即可獲得高質量核酸適體。
[0012]在步驟(1)中，所述的微球為NHS修飾的瓊脂糖微球。也可利用其他偶聯化學。[0013]在步驟(2)中，所述的液滴由振蕩、攪拌或微流控芯片方式生成。單克隆微球的形成依賴于將寡核苷酸文庫稀釋至單分子水平，保證每個液滴內僅有0.3-1條DNA。
[0014]其中，采用振蕩方式生成含有微球的油包水液滴時，優選以篩選所需的寡核苷酸文庫為PCR擴增模板，加入偶聯有正向引物的微球和PCR所需試劑作為水相，油相的組成為40%(w/w)道康寧 5225C，30%(w/w)道康寧 749，30%(w/w)硅油 Ar20。
[0015]本發明靶標可以為細胞、蛋白質或小分子，如靶標為小分子或蛋白質時，優選將靶標偶聯于微球等固相載體表面以便于觀察和分離。
[0016]在步驟(3)中，優選采用在顯微鏡下觀察單克隆微球庫與靶標的相互作用。
[0017]在步驟(4)中，優選直接用毛細管通過毛細作用挑出與靶標結合的微球。
[0018]本發明的優點在于:首先，通過微乳液滴PCR將寡核苷酸文庫中的每一條序列以成百上千的拷貝展示于單克隆微球表面，將原SELEX計時的寡核苷酸文庫轉變為微球文庫；其次，每一條核酸序列與靶標的親和作用通過各自的克隆微珠獨立展示出來，并且核酸序列與靶標的相互作用可以被直接觀察；再次，通過挑選微球可直接從單克隆微球上獲得核酸適體序列；此外，通過改變洗滌力度，可以根據需要調節所獲得的核酸適體的親和能力。與傳統SELEX技術相比，該方法更加快速、經濟、高效，實現了分子識別可視化監測，并可在無需克隆、測序、比對、合成的條件下實現了富集庫中核酸適體的快速篩選，獲得選擇性好、親和力強的核酸適體，將為人工體外篩選、進化功能核酸的道路中開辟一條捷徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為NHS-瓊脂糖微球與氨基正向引物的化學偶聯(A);聯有正向引物的瓊脂糖微球通過與熒光標記的正向引物互補DNA結合進行偶聯表征(B);瓊脂糖微球偶聯前(C)和偶聯后(D)的熒光成像及流式細胞分析結果。
[0020]圖2為EpCAM蛋白的核酸適體篩選。(A)偶聯寡核苷酸文庫的微球文庫與靶細胞KatoIII結合；(B)偶聯正向引物的微球不與靶細胞結合；(C)挑選出來的7個單克隆微球上的序列與靶蛋白的結合力均強于第五輪的富集文庫；(D)從洗去的上清溶液中取出的兩個微球上的序列與靶蛋白不結合。
[0021]圖3為測序獲得的核酸適體EpCAM-5與EpcAM蛋白的結合情況。流式細胞術表征結果，核酸適體EpCAM-5能特異性結合EpCAM-微珠(A)，而與參照N1-微珠(B)不結合。核酸適體EpCAM-5跟EpCAM蛋白的結合解離常數為33±3nM (C)。
[0022]圖4為核酸適體EpCAM-5與細胞的結合情況。流式細胞術表征結果，核酸適體EpCAM-5不與不表達EpCAM蛋白的細胞如HEK-293 (A)和Ramos (B)結合，而特異性地結合EpCAM高表達的細胞如T47D (C)和KatoIII (D)0 (E)熒光共聚焦表征結果，核酸適體EpCAM能特異性識別KatoIII細胞，不結合Ramos細胞。
[0023]圖5為黃曲霉素偶聯于氨基修飾微球表面的實驗流程。
[0024] 圖6為黃曲霉素的核酸適體篩選。(A)黃曲霉素的結構式；(B)偶聯寡核苷酸文庫的微球文庫與黃曲霉素微球的結合；(C)挑選出來的3個克隆微球上的序列與祀標黃曲霉素的結合力均強于第五輪的富集文庫；(D)核酸適體AFB1-1與黃曲霉素的結合常數(Kd)表征。【具體實施方式】
[0025]實施例1NHS-瓊脂糖微球與氨基正向引物的偶聯
[0026] NHS-瓊脂糖微球(Hi Trap NHS-activated HP)通常保存在100%異丙醇中防止水解失活，使用前需去除異丙醇并用冷HCl活化。稱量0.2g NHS-瓊脂糖微球于1.5mL離心管中，加入500mL0.1M冷HCl，振蕩混合10s，離心棄上清，重復一次。加入500mL冷超純水，振蕩混合10s，離心棄上清，重復兩次充分洗去殘留HC1。加入IM PBS緩沖液(IOX)IOOyL,50 μ M氨基正向引物(5，-NH2-AGCGTCGAATACCACTACAG-3’ ) 90 μ L,置于室溫旋轉混勻過夜Sh0離心棄上清，加入超純水反復清洗微球，除去沒有反應的氨基正向引物正向引物。將偶聯好的正向引物-瓊脂糖微球于4°C保存在750 μ L超純水中，每μ L儲存液約含1.7 X IO4個正向引物-瓊脂糖微球。(圖1Α)
[0027]實施例2利用流式細胞儀與激光共聚焦熒光顯微鏡驗證偶聯效果
[0028]取5μ L偶聯好的正向引物-瓊脂糖微球，加入到15 μ L50 μ M熒光標記的正向引物互補 DNA (FAM-FP-cDNA, 5’-FAM-CTGTAGTGGTATTCGACGCT-3’)水溶液中，再加入 20 μ L 結合緩沖液(PBS緩沖液，MgCl25mM, pH7.4)混勻。置于干浴器上95°C加熱5min使DNA變性，包好錫紙避光，室溫旋轉復性2h，使FAM-FP-cDNA與瓊脂糖微球上偶聯的引物互補結合。把反應完的溶液推入自制的濾芯槍頭，過濾掉反應液，并用100 μ L PBS清洗微球3次，以充分洗掉沒有結合的FAM-FP-cDNA。把微球推出到300 μ L PBS中，用流式細胞儀分析，記數大于3000個微球。將剩余樣品取10 μ L點在玻片上進行激光共聚焦熒光顯微鏡觀察。(圖1B-D)計算得微球上正向引物的濃度大約為300amole/微球。
[0029]實施例3油包水液滴的生成及破乳方法
[0030]可采用振蕩、攪拌或微流控芯片方式生成含有微球的油包水液滴。例如，采用手動振蕩混勻的方式生成含有瓊脂糖微球的油包水液滴。首先配制油相，準備潔凈干燥的圓底燒瓶，按比例加入40%(w/w)道康寧5225C，30%(w/w)道康寧749，30%(w/w)硅油Ar20，磁子攪拌30min。向離心管中加入150yL水溶液，加入6yL瓊脂糖微球(共約IO5個)，振蕩混勻，立即于其上覆蓋400 μ L混合硅油，在Labnet渦旋振蕩器上以中間轉速振蕩5s。振蕩好的油包水液滴呈乳白色。
[0031]混合硅油不溶于水，易溶于丙酮、異丙醇等有機試劑。通過洗滌溶劑和離心轉速的條件摸索，最終依次采用極性由低到高的丙酮、異丙醇、水清洗油包水乳液，除去油相從而重新獲得瓊脂糖微球。步驟如下:向油包水乳液中加入10倍體積的丙酮，在渦旋振蕩器上混勻，于離心機中以轉速500rpm離心4min，吸棄上層有機相，重復洗滌一次后；加入10倍體積的異丙醇并用同樣的條件洗滌兩次；最后，加入10倍體積的超純水洗去異丙醇，提高離心轉速至7000rpm。將最終得到的瓊脂糖微球保存在超純水中。
[0032]實施例4單克隆微球的形成及單分子微乳液滴PCR
[0033]核酸文庫的起始容量為1014，兩端為20個核苷酸引物，中間包括40個核苷酸的隨機序列。文庫如下:5' -AGCGTCGAATACCACTACAG-(N)4(l-CTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'。針對該核酸文庫以偶聯有EpCAM-His蛋白的Ni微珠為靶標進行了 5輪的傳統篩選，將獲得的第5輪富集庫作為模板，模板量約4X IO5條，正向引物-瓊脂糖微球約IO5個，自由正向引物為微球上偶聯引物總量的萬分之一(計算約5X107)，自由反向引物為大過量，水相條件如表1所示。[0034]表1:微乳液滴的水相條件
[0035]
【權利要求】
1.一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，將DNA文庫單克隆展示于微球表面，實現分子識別可視化監測；所述方法包括如下步驟:(1)將氨基修飾的正向引物通過NHS-氨基反應偶聯到NHS修飾的微球表面；(2)將寡核苷酸文庫通過液滴單分子微乳PCR以單克隆的形式擴增到偶聯有正向引物的微球表面，每個微球上僅展示一種核酸序列；(3)通過單克隆微球庫與靶標相關作用，可視化地考察表面展示序列與靶標的結合程度；(4)直接挑選獲得能和靶標分子結合的單克隆微球，獲取微球上的DNA序列，獲得高質量核酸適體。
2.如權利要求1和權利要求2所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(2)中，利用振蕩、攪拌或微流控芯片方式生成含有微球的油包水液滴，每個液滴中至多包含一條寡核苷酸模板。
3.如權利要求2所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(2)中，采用振蕩方式生成含有微球的油包水液滴，其以篩選所需的寡核苷酸文庫為PCR擴增模板，加入偶聯有正向引物的微球和PCR所需試劑作為水相，油相的組成為40%(w/w)道康寧 5225C，30%(w/w)道康寧 749，30%(w/w)硅油 Ar20。
4.如權利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(2)中將這些連有核酸的微球破乳、回收，并對雙鏈DNA進行變性單鏈化，最終獲得用于篩選的核酸展示單克隆微球。
5.如權利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:靶標為細胞、蛋白質或小分子，如靶標為小分子或蛋白質時，將靶標偶聯于固相載體表面便于觀察和分離。
6.如權利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(4)中核酸展示單克隆微球與靶標孵育，去除不結合的微球，在顯微鏡下挑出結合的微球。
7.如權利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(4)中挑選出來的結合微球在試管內進行PCR擴增，獲得高親和性的核酸適體，直接進行測序，獲得序列信息。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911432SQ201410076295
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月4日 優先權日:2014年3月4日
【發明者】楊朝勇, 朱志, 宋彥齡, 李聰, 鄒遠, 朱玲, 安源 申請人:廈門大學