一對用于綿羊dkk4基因打靶的前導rna的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對用于綿羊DKK4基因打靶的前導RNA(sgRNA)，該sgRNA對由sgRNA-F和sgRNA-R組成，sgRNA-F和sgRNA-R分別由101個核苷酸組成，其中5’末端20nt的RNA片段能識別綿羊染色體上DKK4基因，其余81nt的RNA片段為能與Cas9n核酸酶結(jié)合的骨架RNA片段；所述的sgRNA-F如序列表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。本發(fā)明通過Cas9系統(tǒng)在細胞或個體水平上對綿羊DKK4基因進行敲除或修飾，以解析綿羊DKK4基因的功能、構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫，為綿羊育種服務。
【專利說明】—對用于綿羊DKK4基因打靶的前導RNA
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領域】，具體而言，涉及一對用于綿羊DKK4基因打靶的前導 RNA。
【背景技術(shù)】
[0002]DKK基因家族是WNT信號通路的抑制因子，而WNT信號轉(zhuǎn)導調(diào)控毛囊的生長發(fā)育。DKK4是DKK基因家族的重要成員。Sick等使用反應-擴散模型預測，DKK的表達量下降或降解加速會導致毛囊間距降低(Wnt and dkk determine hair follicle spacingthrough a react ion-diffus ion mechanism.Science.Sick et al,2006)。與這一予頁測相一致的是，抑制BMP信號導致毛囊密度增加(Making waves with hairs.J Invest Dermatol.Plikus etal, 2004),而抑制 BMP 可能降低 DKK4 表達(The Wnt antagonist Dickkopf-1isregulated by Bmp signaling and c-Jun and modulates programmed cell death.EMBOJ.Grotewold et al，2002)。由此可見，DKK4是細毛羊育種的重要候選基因。在細胞或個體水平上對綿羊DKK4基因進行敲除或修飾，可解析綿羊DKK4基因的功能，為細毛羊的羊毛細度育種服務。
[0003]ZFN和TALEN打靶技術(shù)是目前研究較為成熟的兩種定點突變技術(shù)，但是這兩種技術(shù)構(gòu)建程序較為繁瑣，每一個位點需要構(gòu)建一對相應的核酸酶，而CRISPR / Cas9系統(tǒng)對特異位點的識別靠小的crRNA的引導，CRISPR區(qū)可以有一系列的crRNA組成，每個針對特異位點的crRNA只有幾 十個堿基，整個載體較小，相對于ZFN和TALEN載體，更加容易構(gòu)建(CRISPR / Cas9新型基因打靶系統(tǒng)的研究進展.江蘇農(nóng)業(yè)學報.李輝等，2013)。
[0004](CRISPR) / CRISPR-associated (Cas)是細菌和古細菌一種不斷進化適應的免疫防御機制。CRISPR / Cas9利用一段小RNA來識別并剪切DNA以降解外來核酸分子。Cong等(Multiplex Genome Engineering Using CRlSPR / Cas Systems.Science.2013)及Mali 等(RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013)證明 Cas9系統(tǒng)能在293T、K562、iPS等多種細胞中，進行有效的靶向酶切，非同源重組(NHEJ)、同源重組(HR)效率在3-25%之間，與TALEN酶切效果相當。他們還證明，多個靶點可以同時進行祀向酶切。但是，隨后的研究表明，Cas9存在較為明顯的脫祀效應(High-frequencyoff-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.NatureBiotechnology.Fu et al, 2013 ;High_throughput profiling of off-target DNAcleavage reveals RNA-programmed Cas9nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak etal, 2013)。麻省理工學院Feng Zhang團隊使用雙切刻技術(shù)將Cas9的特異性提高了 50 倍以上(Double nicking by RNA-guided CRlSPR Cas9for enhanced genomeediting specificity.Cell.Ran et al, 2013),維護了 Cas9 在基因打祀【技術(shù)領域】的地位。借助于這一技術(shù)，動植物基因功能研究及育種等等都將得到迅猛的發(fā)展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一對用于綿羊DKK4基因打靶的前導RNA(SgRNA)。本發(fā)明利用編碼這對sgRNA部分序列的短片段DNA構(gòu)建表達載體，該表達載體能夠表達出這對sgRNA，這對sgRNA能夠特異性地識別綿羊DKK4基因。本發(fā)明還利用這對sgRNA引導Cas9n核酸酶(即Cas9切刻酶)對綿羊DKK4基因進行準確、高效的靶向修飾。
[0006]具體地，本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
[0007]一對用于綿羊DKK4基因打祀的sgRNA,由sgRNA-F和sgRNA-R組成；所述sgRNA由101個核苷酸組成，其中5’末端20nt的RNA片段(分別命名為sgRNA_F20和sgRNA_R20)可以識別綿羊染色體上DKK4基因的特定DNA序列，其余81nt稱為骨架RNA片段。骨架RNA片段可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與Cas9n核酸酶結(jié)合，從而引導Cas9n核酸酶切割靶標DNA單鏈，兩個單鏈切口導致雙鏈斷裂(DSB)，細胞利用自身修復功能，使得靶標位點附近的序列發(fā)生變化；另外，這對sgRNA識別的DNA靶序列呈“頭對頭”的排布方式(即二者的5’末端相互靠近)，二者相距39bp，即有39bp的間隔。
[0008]所述sgRNA-F具體可如序列表的序列2所示。
[0009]所述sgRNA-R具體可如序列表的序列4所示。
[0010]本發(fā)明另一個目的在于提供一對DNA分子(命名為特異DNA分子對)，由編碼所述sgRNA-F的DNA分子甲和編碼所述sgRNA-R的DNA分子乙組成。
[0011]所述DNA分子甲具體可如序列表的序列I所示。
[0012]所述DNA分子乙具體可如序列表的序列3所示。
[0013]本發(fā)明第三個目的是提供上述一對sgRNA在特異識別和靶向修飾綿羊DKK4基因中的應用。所述綿羊DKK4基因，其基因組序列是NCBI GI為417531883的一段區(qū)域(35707361-35713520)。
[0014]本發(fā)明第四個目的是提供上述一對sgRNA在構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫中的應用。所述綿羊DKK4基因，其基因組序列是NCBI GI為417531883的一段區(qū)域(35707361-35713520)。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一對特異識別綿羊DKK4基因的sgRNA，并提供了該sgRNA對的編碼DNA片段，從而通過Cas9系統(tǒng)在細胞或個體水平上對綿羊DKK4基因進行敲除或修飾，以解析綿羊DKK4基因的功能、構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫，為綿羊育種服務。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為sgRNA靶點設計結(jié)果示意圖，其中”代表省略若干堿基，箭頭處代表單鏈切刻位點(兩個單鏈切口產(chǎn)生一個雙鏈斷裂)。
[0017]圖2為質(zhì)粒對pX335-sgRNA-F與pX335_sgRNA-R共轉(zhuǎn)染綿羊SEF細胞48小時后提取DNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆后的部分測序結(jié)果(突變序列)，其中.”代表省
略若干堿基。
【具體實施方式】
[0018]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中，如無特殊說明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。
[0019]pX335載體購自Addgene，貨號42335。Bbs I內(nèi)切酶購自NEB公司，貨號R0539S。DNA寡核苷酸均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0020]實施例1、sgRNA表達質(zhì)粒對的構(gòu)建
[0021]1、sgRNA 靶點設計
[0022]在GI =417531883的序列中提取綿羊DKK4基因的一段序列(包括第一外顯子的編碼區(qū)及其5’端部分非翻譯區(qū)域，region:35713285_35713472，如下所示)，設計靶標位點(http: / / zifi 七.partners, org / ziFiT)。
[0023]I ccatctcggc caaagctcca ctgcgggtgc agagctgccc agcttcaaag aggacgcggg
[0024]61 gaggtctgag agggtcgagg atgatgctgg tggtcctgct ggggctcggc tggctgtgcg
[0025]121 ccccccttgg agccctggtt atggatttca gcgttaagaa ctctgctgat gaacaagagg
[0026]181 cccaggag
[0027]正向靶序列是GATGATGCTGGTGGTCCTGC (80-99)、反向靶序列是GGGCAGCTCTGCACCCGCAG (21-40)。兩個靶序列呈“頭對頭”的排布方式，二者相距39bp，即有39bp的間隔。分別命名為正向靶標Tl、反向靶標T2。靶標設計如圖1所示。
[0028]2、sgRNA表達 質(zhì)粒對的構(gòu)建
[0029]首先根據(jù)設計的靶序列送北京六合華大基因科技股份有限公司合成單鏈寡核苷酸，具體序列如下:
[0030]Tl-F:CACCGATGATGCTGGTGGTCCTGC
[0031]Tl-R:AAACGCAGGACCACCAGCATCATC
[0032]T2-F: CACCGGGCAGCTCTGCACCCGCAG
[0033]T2-R:AAACCTGCGGGTGCAGAGCTGCCC
[0034]其中Tl-F與Tl-R退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)Bbs I酶切，連入pX335載體中，獲得pX335-sgRNA-F載體；T2_F與T2-R退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)Bbs I酶切，連入pX335載體中，獲得pX335-sgRNA-R載體。兩個質(zhì)粒均送北京六合華大基因科技股份有限公司測序驗證，測序引物bbsR的序列為:5’ AAAGTCCCTATTGGCGTTAC3'。
[0035]實施例2、通過測序驗證實施例1構(gòu)建的sgRNA表達質(zhì)粒對的生物活性
[0036]綿羊胎兒成纖維細胞(SEF):分離培養(yǎng)方法參見文獻:孟凡華，肖紅梅，張東，周歡敏.蒙古綿羊胎兒皮膚成纖維細胞分離培養(yǎng)與特性分析.《中國畜牧獸醫(yī)》2012年第3期，136-140.[0037]1、將重組質(zhì)粒pX335-sgRNA-F與pX335_sgRNA-R各4yg通過電轉(zhuǎn)化的方式共轉(zhuǎn)染IXlO6SEF細胞，得到重組細胞。轉(zhuǎn)染的具體步驟是:使用核轉(zhuǎn)儀(Amnaxa，型號:AAD-100IS)及配套的哺乳動物成纖維細胞轉(zhuǎn)染試劑盒(Amnaxa，貨號:VPI_1002)進行轉(zhuǎn)染。首先使用0.05%胰蛋白酶(Gibco，貨號:610-5300AG)消化貼壁細胞，用胎牛血清(Gibco，貨號:16000-044)終止消化，磷酸鹽緩沖液(Gibco，貨號:10010-023)洗滌細胞兩次，添加轉(zhuǎn)染試劑，使用程序T-016轉(zhuǎn)染細胞。
[0038]2、將步驟I得到的重組細胞37°C (培養(yǎng)48小時，然后收集細胞。具體步驟是:首先使用0.05%胰蛋白酶(Gibco，貨號:610-5300AG)消化貼壁細胞，用胎牛血清(Gibco，貨號:16000-044)終止消化，磷酸鹽緩沖液(Gibco，貨號:10010-023)洗滌細胞兩次，添加200微升細胞裂解液GA (TIANGEN公司DNA提取試劑盒DP304中的組分)。
[0039]3、提取步驟2收集的細胞的基因組DNA并作為模板，用PCRF與PCRR組成的引物對進行 PCR 擴增，回收 260bp 的 PCR 擴增產(chǎn)物(PCRF:5’ CTGGCTTATGGCATTTCAC3’ ；PCRR:5’ CCTGGGCCTCTTGTTCATC3’)。DNA提取具體步驟是:使用TIANGEN公司DNA提取試劑盒(貨號:DP304)提取DNA。在上一步所得裂解產(chǎn)物中添加20微升蛋白酶K溶液，混勻。加入200微升緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加入200微升無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將上述溶液加入一個吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升緩沖液GD，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入700微升緩沖液Pw，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200微升洗脫緩沖液TE，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0040]4、將步驟3得到的PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T載體(寶生物，貨號:D101A)連接，得到連接產(chǎn)物。具體的連接步驟是:在微量離心管中配置下列DNA溶液:pMD18-T載體I微升，PCR產(chǎn)物4微升。加入5微升Solution I。16°C反應30分鐘。
[0041]5、取5微升連接產(chǎn)物加入50微升DH5 α感受態(tài)細胞(寶生物，D9057S)中，冰上放置30分鐘。42°C加熱90秒，再在冰上放置I分鐘。加入500微升SOC培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘。涂布于氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，隨機挑取20個克隆并進行測序，計算突變的克隆占總體克隆數(shù)的比例，從而估算出該對sgRNA質(zhì)粒的效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個克隆在預期切 割位點附近出現(xiàn)突變(詳見圖2)，即重組質(zhì)粒pX335-sgRNA-F與pX335-sgRNA-R組成的質(zhì)粒對在SEF細胞基因組中的切割效率達10%。
【權(quán)利要求】
1.一對用于綿羊DKK4基因打靶的SgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R組成，sgRNA-F和sgRNA-R分別由101個核苷酸組成，其中5’末端20nt的RNA片段能識別綿羊染色體上DKK4基因，其余81nt的RNA片段為能與Cas9n核酸酶結(jié)合的骨架RNA片段；所述的sgRNA-F如序列表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。
2.—對DNA分子，由編碼權(quán)利要求1中的所述sgRNA-F的DNA分子甲和編碼權(quán)利要求1中的所述sgRNA-R的DNA分子乙組成。
3.如權(quán)利要求2所述的一對DNA分子，其特征在于:所述的DNA分子甲如序列表的序列I所示。
4.如權(quán)利要求2所述的一對DNA分子，其特征在于:所述的DNA分子乙如序列表的序列3所示。
5.權(quán)利要求1所述的一對sgRNA在特異識別和靶向修飾綿羊DKK4基因中的應用。
6.權(quán)利要求1所述 的一對sgRNA在構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103805599SQ201410069931
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】趙金山, 柳楠, 劉積鳳, 李和剛, 劉開東 申請人:青島市畜牧獸醫(yī)研究所