一種基因測序的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基因測序的方法，利用三種不同波長的激光激發三種熒光標記的核苷酸分子，所述的核苷酸分子為A、C、G和T四種核苷酸分子中的任意三種，剩余一種核苷酸分子無熒光核酸標記，該方法以無熒光激發為標志重新定義了測序儀，是一種采用三色熒光邊合成邊測序的方法。該方法簡化了合成步驟，且成像裝置較為簡單，成本低；而且采用的熒光標記核酸熒光分子只有3種，每個測序周期都不會在DNA鏈上留下多余的殘留分子，不會影響DNA聚合酶與待測的DNA鏈的結合，可以大幅度地提高測序準確率和讀長。
【專利說明】一種基因測序的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因測序【技術領域】，具體涉及一種基因測序的方法。
【背景技術】
[0002]DNA測序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的排列方式。快速，準確和低廉的DNA測序方法將極大地推動生物學和醫學的研究和發現。現在，已經可以測定了包括人類基因組和其他許多動物、植物和微生物物種的完整基因序列，有助于更深入地了解生命的本質。臨床上，許多和疾病有關的基因測定則讓醫護人員更好地診斷和治療病患，逐漸體現基因測序的巨大應用前景。
[0003]早在1977年，Sanger等發明雙脫氧鏈末端終止法。同時的Maxam和Gilbert則發明了化學降解法進行堿基序列的測定。第一代DNA測序儀器使用的是Sanger的方案。后來經過改進成為四色熒光，利用毛細管電泳的高度自動化測序系統。第一代DNA測序儀的產生具有劃時代的意義，90年代美國的人類基因組計劃就是利用大規模的Sanger測序儀獲得第一個完整的人類基因組。由于其準確性高，所以作為基因組的"參照"序列而被采用。
[0004]但是第一代DNA測序儀器的消耗成本巨大，樣品通量小，導致測序花費時間長。要花數十億美元的資金，上萬的科研人員和超過十年的時間才能獲得一個人的完整基因，所以在應用上受到很大的限制。
[0005]進入21世紀后，陸續出現了更為強大的第二代基因測序技術。主要是Roche公司的焦磷酸測序法，11 Iumina公司的DNA合成終止法測序以及Life Technologies公司的DNA連接測序法。這些公司利用商業化提供的儀器，以短的連續性的片段序列和測序閱讀長度的形式，可以將獲得一個人的基因組的時間縮小到數周，成本只需要數十萬美元左右。
[0006]但是現有的基因測序技術存在如下問題:(l)R0Che公司的方法對連續相同序列的DNA測序準確率差，因為其方法沒有采用合成終止技術，而且需要利用多種酶，效率低，成本高，已逐漸被市場淘汰；(2) Life Tech公司的DNA連接測序缺點是使用連接酶而不是聚合酶，所以準確率不好，而且成本很高；(3) Illumina公司比上述兩個公司的方法更好，其主要缺點是利用4種熒光分子，成本高，裝置復雜，而且每個測序周期都會在DNA鏈上留下多余的殘留分子。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種用于基因測序的方法，該方法簡化了合成步驟，且成像裝置較為簡單，成本低；而且采用的熒光標記核酸熒光分子只有3種，每個測序周期都不會在DNA鏈上留下多余的殘留分子，不會影響DNA聚合酶與待測的DNA鏈的結合，可以大幅度地提高測序 準確率和讀長。
[0008]本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的:一種基因測序的方法，利用三種不同波長的激光激發三種熒光標記的核苷酸分子，所述的核苷酸分子為A、C、G和T四種核苷酸分子中的任意三種，剩余一種核苷酸分子無熒光核酸標記，以該方法為基礎重新定義了基因測序儀，是一種采用三色熒光邊合成邊測序的方法。
[0009]該方法采用三色熒光邊合成邊測序，與目前市場主流的四色熒光測序儀有本質的區別。
[0010]作為本發明的一種優選的實施方案，本發明提供的基因測序的方法，具體含以下步驟:
(1)合成一套基因測序用核酸分子，包括三種熒光標記核酸分子和一種無熒光標記核酸分子，所述的三種熒光標記核酸分子為A、C、G和T四種核苷酸分子中的任意三種，剩余一種即為無熒光標記的核酸分子；
(2)將待測的單鏈DNA連接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面；
(3)將互補的DNA引物與連接有待測DNA的通用的DNA序列配對，并且引物上設有3，-OH官能團；
(4)利用DNA聚合酶，將上述熒光標記核酸加入到引物的3’-OH上，獲得待測樣品；
(5)使用3種不同波長的激光分別先后照射待測樣品，每種激光會激發相應的熒光基團，并且產生相應的 熒光，通過顯微鏡成像系統，信號通過3種不同的濾波片，讀出每段DNA上帶有的不同熒光信號，其中3種不同波長的激光為波長之間差別在30nm以上的激光；
(6)化學切除保護基團，引物3’-OH上的-N3,以及熒光分子和堿基之間的-N3 ；
(7)進行下一輪的測序，測得引物的DNA序列，從而測得待測DNA的序列。
[0011]本發明步驟(1)中采用的一套基因測序用核酸分子，包括三種熒光標記的核酸分子A，C和G，以及一種無熒光標記的核酸分子T，各核酸分子的結構式如下:
【權利要求】
1.一種基因測序的方法，其特征是:利用三種不同波長的激光激發三種熒光標記的核苷酸分子，所述的核苷酸分子為A、C、G和T四種核苷酸分子中的任意三種，剩余一種核苷酸分子無熒光核酸標記，以該方法為基礎重新定義了基因測序儀，是一種采用三色熒光邊合成邊測序的方法。
2.根據權利要求1中的基因測序方法，其特征是包含以下步驟: (1)合成一套基因測序用核酸分子，包括三種熒光標記核酸分子和一種無熒光標記核酸分子，所述的三種熒光標記核酸分子為A、C、G和T四種核苷酸分子中的任意三種，剩余一種即為無熒光標記的核酸分子； (2)將待測的單鏈DNA連接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面； (3)將互補的DNA引物與連接有待測DNA的通用的DNA序列配對，并且引物上設有3，-OH官能團； (4)利用DNA聚合酶，將上述熒光標記核酸加入到引物的3’-OH上，獲得待測樣品； (5)使用3種不同波長的激光分別先后照射待測樣品，每種激光會激發相應的熒光基團，并且產生相應的熒光，通過顯微鏡成像系統，信號通過3種不同的濾波片，讀出每段DNA上帶有的不同熒光信號，其中3種不同波長的激光為波長之間差別在30nm以上的激光； (6)化學切除保護基團，包括引物3’-OH上的-N3,以及熒光分子和堿基之間的-N3 ； (7)進行下一輪的測序，測得引物的DNA序列，從而測得待測DNA的序列。
3.根據權利要求2所述的基因測序方法，其特征是:步驟(1)中采用的一套基因測序用核酸分子，包括三種熒光標`記的核酸分子A，G和C，以及一種無熒光標記的核酸分子T，各核酸分子的結構式如下:
4.根據權利要求3所述的基因測序方法，其特征是:所述的熒光分子ISrhodamineX或Alexa Fluor 594，所述的熒光分子2為Cy5或Alexa Fluor 647，所述的熒光分子3為BOIDIPY-FL 或 Alexa Fluor 488。
5.根據權利要求3所述的基因測序方法，其特征是:所述的熒光標記核酸分子C通過以下合成工藝制得:
6.根據權利要求1或2所述的基因測序方法，其特征是:所述3種不同波長的激光，激光波長為任意三種可見光波段的、與熒光分子對應的、彼此相差30納米以上的激光組合。
7.根據權利要求6所述的基因測序方法，其特征是:所述3種不同波長的激光，所述激光的波長為 488nm, 568nm 和 643nm ;或 512nm, 568nm 和 633nm。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866010SQ201410069473
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2014年2月28日
【發明者】郭誠 申請人:郭誠