邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及家禽育種領域，具體涉及一種邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記及應用。本發明公開了作為邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記的應用。所述應用是擴增得到MSTN基因（162bp）的目的片段，目的片段經限制性內切酶BbvI酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本的肌纖維特性進行判斷；可以根據制定的育種目標選擇MSTN基因中不含BbvI酶切位點的個體（AA型）或含有BbvI酶切位點的純合型樣本（GG型）。本發明方法簡單快捷，且不受外界環境的影響，可以用于邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記，進行標記輔助選擇。
【專利說明】邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及家禽育種領域，具體涉及一種用分子遺傳標記分析邊雞肌纖維特性的方法。
【背景技術】
[0002]大量研究發現畜禽的肌肉品質與其肌肉組織學特性有顯著的相關性，特別是肌纖維密度、肌纖維直徑對肌肉品質的影響非常顯著，而肌纖維特性大多是數量性狀，一般受微效多基因控制。Staunllsl證實肌纖維直徑和肌纖維密度等性狀主要由遺傳因素所決定，遺傳力較高。在肌纖維的形成過程中，肌細胞的增殖、分化由一些正向調控因子和負向調控因子進行雙向調節。肌纖維特性是一個活體無法測量的性狀，因而要找到一個能夠在畜牧生產上切實應用分析肌纖維特性的有效方法，必須尋找控制肌纖維特性性狀的主基因或與其連鎖的遺傳標記，然后通過這些標記或基因實現對目標性狀的活體和早期選育。
[0003]肌肉生長抑制素(my0statin，MSTN)基因，研究證實它具有抑制骨骼肌生長的作用，是骨骼肌生長的負調控因子，主要通過抑制MyoD家族成員的轉錄活性負向調控肌細胞的生長發育。McPherron和Lee通過基因敲除技術使小鼠的MSTN基因C端生物活性區缺失，得到的突變純合體小鼠，研究表明突變小鼠肌肉肥大的原因既有肌細胞的增生也有肌纖維的肥大。因而研究雞肌肉生長抑制素基因的突變對肌纖維特性狀的影響，進而用于標記輔助選擇具有很大的 可能性。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種利用分子標記分析邊雞肌纖維特性的方法，該方法利用MSTN基因BbvI酶切圖譜對邊雞肌纖維特性進行標記輔助選擇，不受環境影響。
[0005]本發明公開了 MSTN基因作為邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記的應用。
[0006]基于上述應用的分析邊雞肌纖維特性的方法是:提取待測樣本的基因組DNA，經序列如SEQ ID NO:1-2所示的特異性引物擴增得到162bp的目的片段，目的片段經限制性內切酶BbvI酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本的肌纖維特性進行判斷并選留符合育種目的的個體。僅有162bp條帶的為肌纖維密度低、肌纖維直徑長和肌纖維面積大的純合型樣本，僅有127bp條帶的為肌纖維密度高、肌纖維直徑短和肌纖維面積小的純合型樣本。
[0007]本發明的原理是:利用前期研究發現的MSTN基因外顯子I的BbvI酶切位點，針對該位點設計特異性引物擴增邊雞基因組DNA，擴增產物經BbvI酶切產生3種基因型(GG、GA和AA)。該單核苷酸突變能穩定遺傳，選擇的檢測方法簡單快捷，且不受外界環境的影響，可以用于邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記，進行標記輔助選擇。
[0008]所述分子遺傳標記在應用于育種篩選時，可以根據制定的育種目標選擇MSTN基因中不含BbvI酶切位點的個體(AA型)或含有BbvI酶切位點的純合型樣本(GG型)。【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1是MSTN基因BbvI酶切產物圖，Marker為GM331。
[0010]圖2是邊雞腿肌10 X 40倍組織切片。
[0011]圖3是邊雞腿肌10 X 10倍組織切片。
【具體實施方式】
[0012]實施例1
[0013]1.試驗材料
[0014]第7世代邊雞核心群母雞血樣299份、公雞血樣81份,所建立的第一世代AA和GG系母雞各30只均采自山西省農科院畜牧獸醫研究所。用肝素鈉作為抗凝劑，從第7世代邊雞核心群母雞靜脈各采集血樣0.5mL，采用常規苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，測定DNA的濃度后備用。
[0015]2.引物設計和PCR擴增
[0016]2.1酶切弓丨物的設計
[0017]根據GenBank中雞MSTN基因序列(GenBank登錄號為AF346599)針對外顯子I的BbvI位點設計I對引物，擴增產物大小為162bp。引物序列如下:
[0018]Pl:F:5/ -GCATTAGCAGGGACGTTAT-3' (SEQIDN0:1)
[0019]R:5/ -ACTCCGTAGGCATTGTGAT-3' (SEQ ID NO:2)
[0020]2.2PCR 擴增
[0021]PCR擴增反應為25 μ L體系，包括:上、下游引物(10 μ mol/L)2 μ L ；dNTPs (2mmol/L) 2.5μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L ;DNA 模板(50ng/μ L) 2 μ L ；Mg2+ (25mmol/L)
1.5μ L ;10XPCI^^4^2.5yL ;超純水 14.3 μ L0 PCR 擴增反應程序:94°C 變性 6min ；94°C變性30s，56。。復性30s，72。。延伸30s，進行30個循環；最后72°C延伸IOmin ;10°C保存。
[0022]PCR反應完成后，用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增結果，硝酸銀染色，UV凝膠成像系統進行凝膠成像。
[0023]2.3PCR-RFLP 檢測及選育
[0024]PCR產物用BbvI酶切，以檢測多態性。酶切反應總體積為20 μ L，超純水16.5 μ L, BbvI 酶(lOu/μ L)0.5μ L, 10Xbuffer2 μ L，37。C 酶切 2h，酶切產物用交聯度為(AcriBis) 29:1的10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，200V電泳5h，硝酸銀染色。酶切圖譜如圖1所示，顯示3種基因型，僅有162bp目的片段的樣本不含BbvI酶切位點，命名為AA型；僅有127bp的為含有BbvI酶切位點的純合型，命名為GG型；同時含有162bp和127bp的為雜合型樣本，命名為GA型。當編碼區234bp處為G時，BbvI酶切產生127bp和35bp的片段；當C.234bp處為A時，無BbvI酶切位點。
[0025]根據邊雞公母雞MSTN基因BbvI酶切圖譜中條帶的數量和大小辨別擴增產物中是否含有BbvI酶切位點。根據基因型判定結果分別選留AA型公母雞以及GG型公母雞作為種雞。人工受精后米集種蛋，建立AA和GG系邊雞群體。
[0026]2.4邊雞AA和GG系母雞肌纖維特性的比較
[0027]在16周齡時，分別屠宰30只建立的AA和GG系母雞，制作腿肌的石蠟切片。通過萬能視屏成像系統 裝置，在10X40倍下隨機選取5個視野拍攝,用Image-Pro Plus軟件統計肌纖維的數目，計算肌纖維的密度(表1)。結果表明，AA和GG系邊雞腿肌的肌纖維密度分別為221.19根/mm2和292.27根/mm2，AA型邊雞肌纖維密度極顯著的低于GG系(Ρ〈0.01)。
[0028]通過萬能視屏成像系統裝置，在10X10倍下拍攝一個清晰的視野，用Image-PiOPlus軟件隨機選取50根肌纖維進行測定，分析肌纖維的直徑和橫截面積(表1 )。結果表明，AA型邊雞腿肌的肌纖維直徑為66.72 μ m,橫截面積為3897.70 μ mm2，GG型邊雞腿肌的肌纖維直徑為58.82 μ m，橫截面積為3107.58 μ mm2 ；AA型邊雞的肌纖維直徑和橫截面積都顯著的高于GG型(P〈0.05)。
[0029]在育種時可以根據制定的育種目標選擇MSTN基因中不含BbvI酶切位點的個體(AA型)或含有BbvI酶切位點的純合型樣本(GG型)。MSTN基因BbvI酶切位點可作為邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記用于輔助選擇。
[0030]表1邊雞母雞AA和GG系肌纖維特性的比較
[0031]
【權利要求】
1.肌肉生長抑制素基因MSTN作為邊雞肌纖維特性的分子遺傳標記的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，提取待測樣本的基因組DNA，經序列如SEQID NO:1-2所示的特異性引物擴增得到162bp的目的片段，目的片段經限制性內切酶BbvI酶切，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的酶切圖譜，根據圖譜中條帶的數量和大小對待測樣本的肌纖維特性進行判斷并選留符合育種目的的個體；其中僅有162bp條帶的為肌纖維密度低、肌纖維直徑長和肌纖維面積大的純合型樣本，僅有127bp條帶的為肌纖維密度高、肌纖維直徑短和肌纖維面積小的純合型樣本。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805709SQ201410067767
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】張跟喜, 丁馥香, 王金玉, 張麗, 謝愷舟, 戴國俊, 張李俊 申請人:揚州大學