一種改進的海馬神經元原代培養方法
【專利摘要】本發明屬于細胞生物學領域，涉及一種神經元分離和培養方法及試劑。本發明的目的在于針對現有技術存在的問題，改進當前海馬神經元體外分離和培養的方法，解決了海馬神經元原代培養的增殖性和活性無法保持的問題。本發明建立了一套比較成熟的體外培養海馬神經元的方法，本發明得到的神經細胞數量充足，生長狀態較好，能夠從哺乳動物的海馬組織中分離出高活性、高數量的海馬神經細胞，符合原代海馬細胞培養的要求，可滿足神經科學研究中細胞生物學實驗的需求。
【專利說明】一種改進的海馬神經元原代培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，涉及一種海馬神經細胞分離與原代培養方法及試劑。
【背景技術】
[0002]海馬(hippocampal)是中樞神經系統的重要組成部分，作為神經元高度集中的區域，具有中樞神經系統的典型特性，在學習、記憶、情緒反應及自主神經功能等方面發揮重要作用。神經元細胞培養模型是研究神經元發育分化、神經再生、神經疾病的發生機制等重要的實驗模型，體外培養海馬神經元已成為研究阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病的重要技術手段。原代培養(primary culture)是指從活體細胞獲得細胞、組織或器官，在體外條件下進行的第一次培養。神經元原代培養是將胚胎哺乳動物中樞神經系統的部分組織，如海馬組織、大腦皮層、小腦、下丘腦、海馬、脊髓和神經叢從機體直接取出，再接種培養的方法。目前國內、外有關神經元培養的方法較多，但在原代培養中神經元的純度和產量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經元是一種高度分化的細胞，動物出生后很少分裂，相對于其它細胞而言，神經元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養神經元要求的培養方法和營養條件均較為特殊。
[0003]目前，導致難以獲得足夠數量和活力的原代海馬神經元的因素有以下幾方面:(I)海馬神經組織分離過程中 ，多數人用D-hanV s或hanV s作為漂洗液，離體哺乳動物海馬組織中去除紅細胞、被膜及結締組織等雜質，分離過程時間較長，有時候需要2小時以上，在漂洗液中時間會更長，海馬神經元即已部分死亡，從而出現假陰性的培養結果。實驗上無法開展海馬神經元的常規培養，主要可能是因為沒有合適的用于海馬組織標本的神經元培養用漂洗液/解剖液之故。在組織分離過程中，即使冰浴，神經元依然進行著很大程度代謝，hank' s液的無糖環境對神經元分離很不利，在hank' s液中添加DMEM或者高糖來供給大腦的代謝，但葡萄糖濃度太高，易增加細菌污染的機會；添加DMEM培養液會堿性化，不利于神經元細胞存活。中國專利CN102978162A“一種神經元分離和培養方法及試劑”、中國專利CN102994452A “一種高效分離和培養神經元的方法”和中國專利CN102994451A “一種神經元分離和培養的改進型方法”，取腦組織放入盛有I X PBS的培養皿中，所采用清洗液均為PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，考慮到了神經元能量代謝需要，但未添加任何抗菌物質，葡萄糖濃度太高，就容易增加細胞污染的機會。(2)采用大劑量胰蛋白酶消化后，海馬神經細胞勢必受到相當程度的生比和機械損害；細胞表面的粘附分子或膜蛋白極易受到破壞，對于這類具有立體結構用以維持細胞增殖及自我更新的細胞來說，很難迅速恢復細胞狀態，往往伴隨著大范圍的細胞死亡/凋亡，細胞“老化”嚴重，細胞活力將明顯減弱，組織中不能獲得大量活細胞；(3)細胞種植液對原代培養海馬神經元至關重要，細胞種植液不同于接下來的細胞維持液，需要給予神經細胞特殊的生長因子，這樣才能保證獲得足夠數量和活力的海馬神經元。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，本發明提供了一種哺乳動物的海馬神經元體外原代培養的方法，目的是建立一種簡單易行、高純度的海馬神經元體外原代培養的方法及試劑，滿足神經科學研究的需求。
[0005]本發明提供的技術方案之一為:
[0006]本發明的青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)LJM-001,已于 2010 年08月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis),保藏編號為 CGMCC N0.4090。
[0007]本發明的青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)LJM-001分離于一名浙江省健康青年人糞便中。
[0008]本發明的青春雙歧桿菌LJM-001菌株具有下述微生物學特征:
[0009](I)菌落形態:青春雙歧桿菌LJM-001菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質地軟、邊緣整齊，直徑I~1.5mm。
[0010](2)個體形態:G+無芽孢桿菌，桿狀。
[0011](3)生理生化特征:D_核糖(+) ;L_阿拉伯糖(+);乳糖(+);纖維二糖㈠；松三糖(+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸鈉(-);木糖(+);甘露糖(-);果糖(+);半乳糖(+);蔗糖(+);麥芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水楊素(-);F6PPK酶⑴；對氧的反應(在好氣固體培養基上不生長)；硝酸鹽還原㈠；觸酶㈠；靛基質反應(_)。
[0012]厭氧下生長良好，有氧環境中不生長。最適生長溫度37~41°C ;最低生長溫度25~28°C;最高43~45°C;生長最適ρΗ6.5~7.0 ;在ρΗ4.5~5.0或8.0~8.5不生長。
[0013]所述青春雙歧桿菌LJM-001，CGMCC N0.4090應用于海馬神經元的細胞種植液中。
[0014]我們實驗過程中意外發現:青春雙歧桿菌LJM-001菌株的活性發酵濾液既能提供營養成分，又可促進神經元生長，獲取神經元的數量可以滿足實驗的需要。
[0015]本發明提供的技術方案之二為:海馬神經元的分離、原代培養方法，包括以下步驟:
[0016]1.漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細胞、被膜及結締組織，用漂洗液沖洗2~5次；
[0017]2.消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細胞。
[0018]3.制備細胞懸液:收集步驟2消化后初次細胞懸液，經200目細胞篩過濾后，800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細胞種植液，重懸細胞，制成5 X IO5~10 X IO5個/mL的單細胞懸液；
[0019]4.接種、培養:將步驟3細胞懸液種植于預先鋪好多聚賴氨酸的培養皿及培養瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養箱中，種植后24~72小時換成細胞維持液，之后每隔兩天用細胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。 [0020]試劑購買:
[0021]DMEM/F12神經基礎培養基、Neurobasal培養基和B27購于Gibco公司；多聚賴氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺購于美國Sigma公司；青鏈霉素混合液(雙抗)，購于美國HyClone公司。
[0022]試劑的配置:
[0023](1)所述的D-Hank ' s液，經過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g，Na2HPO4.12H200.12g，KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約 500mL 三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存備用。
[0024](2)所述的漂洗液，經過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻,加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存備用。
[0025](3)所述的消化液，經過如下步驟得到:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻，加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.22 μ m濾膜過濾除菌,0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時,氫氣終濃度達到為0.5mmol/L, Y射線消毒滅菌,分裝,4°C保存備用。
[0026](4)所述的活性發酵濾液，經過如下步驟得到:
[0027]①青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)LJM_001,該菌株已于 2010年08月17日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.4090 ；
[0028]②青春雙歧桿菌LJM-001采用改良MRS培養基培養，培養基配方為:以重量計，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g,乙酸鈉5g，K2HP042g, MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫_801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。
[0029]③將青春雙歧桿菌LJM-001接種于冷卻至40±2°C的步驟②改良MRS培養基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養24小時，用分光光度計測定上述培養液A58tol值為1.2時，將上述培養液在轉數5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發酵液濾液，4°C保存備用。
[0030](5)所述的多聚賴氨酸，經過如下步驟得到:IOmg多聚賴氨酸溶于IOmL三蒸水中，混勻，加三蒸水定容至IOOmL, 0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,分裝,冰凍備用。
[0031](6)所述的細胞種植液，經過如下步驟得到:DMEM/F12培養基加入胎牛血清、活性發酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存備用。
[0032](J)所述的細胞維持液,經過如下步驟得到:Neurobasal培養基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2 %，谷氨酰胺終濃度I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存備用。
[0033](8)所述的雙抗,為青霉素-鏈霉素溶液(100 X),青霉素含量為10000U/mL,鏈霉素含量為10mg/mL。1%雙抗:青霉素含量為100U/mL,鏈霉素含量為0.lmg/mL。
[0034]本發明具有以下優點及效果:
[0035]1.漂洗步驟中，海馬組織浸潤在氫氣環境下，最大化減少組織的分離操作對海馬神經細胞的損傷，而且，氫氣具有極強的生物學活性，最大限度保護海馬神經細胞不受傷害，可提高了原代海馬神經細胞的存活率和生物活性。[0036]2.漂洗液含有海藻糖，替換常規使用的蔗糖，蔗糖粘度較大，不利于組織分離操作。海藻糖對生物體具有神奇的保護作用，在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護神經細胞，維持生命體的生命過程和生物特征，而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖類，均不具備這一功能。
[0037]3.消化步驟中，采用了富含氫氣的消化液，使得胰蛋白酶與所消化組織充分接觸和作用，氣體攪拌均勻，胰蛋白酶消化效率大大提高，胰蛋白酶使用劑量和經歷的時間有所縮短(從原來的10~20分鐘縮短到不超過10分鐘)，同時又增加了海馬神經元生理呼吸，氫氣本身又是健康因子，使海馬神經元細胞更多地保持了原有的生物活性。短時間、低濃度胰酶即達到必要的消化效果，對神經元損傷更小，也提高了神經元的體外存活率。
[0038]總之，本發明建立了一套比較成熟的原代培養海馬神經元的方法，即在氫氣環境下漂洗和酶消化，漂洗液含有保護功能的海藻糖，低濃度、短時間的酶分離細胞和含活性發酵濾液的特殊種植培養基；本發明得到的神經細胞數量充足，生長狀態較好，能夠從哺乳動物的海馬組織中分離出高活性、高數量的海馬神經細胞，符合海馬細胞神經元原代培養的要求。
【具體實施方式】
[0039]以下結合具體實施例，實驗材料取新生SD大鼠的海馬組織，對本發明進行詳細說明。
[0040]實施 例1
[0041]本發明的青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)LJM-001,已于 2010 年08月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis),保藏編號為 CGMCC N0.4090。
[0042]本發明的青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)LJM-001分離于一名浙江省健康青年人糞便中。
[0043]本發明的青春雙歧桿菌LJM-001菌株具有下述微生物學特征:
[0044](I)菌落形態:LJM-001菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質地軟、邊緣整齊，直徑1-1.5_。
[0045](2)個體形態:G+無芽孢桿菌，桿狀。
[0046](3)生理生化特征:D_核糖(+) ;L_阿拉伯糖(+);乳糖(+);纖維二糖㈠；松三糖(+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸鈉(-);木糖(+);甘露糖(-);果糖(+);半乳糖(+);蔗糖(+);麥芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水楊素(-);F6PPK酶⑴；對氧的反應(在好氣固體培養基上不生長)；硝酸鹽還原㈠；觸酶㈠；靛基質反應(_)。
[0047]厭氧下生長良好，有氧環境中不生長。最適生長溫度37_41°C ;最低生長溫度25-280C ;最高 43-450C ;生長最適 pH6.5-7.0 ;在 ρΗ4.5-5.0 或 8.0-8.5 不生長。
[0048]所述青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis) LJM-001, CGMCC N0.4090應用于海馬神經元的細胞種植液中。
[0049]我們實驗過程中意外發現:青春雙歧桿菌LJM-001菌株的活性發酵濾液既能提供營養成分，又可促進神經元生長，獲取神經元的數量可以滿足實驗的需要。
[0050]實施例2
[0051]試劑購買:
[0052]DMEM/F12神經基礎培養基、Neurobasal培養基和B27購于Gibco公司；多聚賴氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺購于美國Sigma公司；青鏈霉素混合液(雙抗)，購于美國HyClone公司。
[0053]試劑的配置:
[0054](I)所述的D-Hank ' s液，經過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g,Na2HPO4.12H200.12g，KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約 500mL 三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存備用。
[0055](2)所述的漂洗液，經過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻,加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存備用。
[0056](3)所述的消化液，經過如下步驟得到:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻，加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.22 μ m濾膜過濾除菌,0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌,分裝,4°C保存備用。
[0057](4)所述的活 性發酵濾液，經過如下步驟得到:
[0058]①青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)LJM_001,該菌株已于 2010年08月17日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.4090 ；
[0059]②青春雙歧桿菌LJM-001采用改良MRS培養基培養，培養基配方為:以重量計，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g,乙酸鈉5g，K2HP042g, MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫_801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。
[0060]③將青春雙歧桿菌LJM-001接種于冷卻至40±2°C的步驟②改良MRS培養基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養24小時，用分光光度計測定上述培養液A58tol值為1.2時，將上述培養液在轉數5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發酵液濾液，4°C保存備用。
[0061](5)所述的多聚賴氨酸，經過如下步驟得到:10mg多聚賴氨酸溶于IOmL三蒸水中，混勻，加三蒸水定容至IOOmL, 0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,分裝,冰凍備用。
[0062](6)所述的細胞種植液，經過如下步驟得到:DMEM/F12培養基加入胎牛血清、活性發酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存備用。
[0063](J)所述的細胞維持液,經過如下步驟得到:Neurobasal培養基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2 %，谷氨酰胺終濃度I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存備用。
[0064](8)所述的雙抗,為青霉素-鏈霉素溶液(100 X),青霉素含量為10000U/mL,鏈霉素含量為10mg/mL。1%雙抗:青霉素含量為100U/mL,鏈霉素含量為0.lmg/mL。[0065]實施例3
[0066]以SD大鼠海馬神經元的分離、原代培養方法包括以下步驟:
[0067]以實施例1和實施例2所準備的試劑和配置試劑。
[0068](I)漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細胞、被膜及結締組織，用漂洗液沖洗2~5次；
[0069](2)消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細胞。
[0070](3)制備細胞懸液:收集步驟2消化后初次細胞懸液，經200目細胞篩過濾后，800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細胞種植液，重懸細胞，制成
5X IO5~10 X IO5個/mL的單細胞懸液；
[0071](4)接種、培養:將步驟3細胞懸液種植于預先鋪好多聚賴氨酸的培養皿及培養瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養箱中，種植后24~72小時換成細胞維持液，之后每隔兩天用細胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。
[0072](5)鏡檢判定:神經細胞種植后12小時后，倒置顯微鏡觀察，顯示:大部分細胞貼壁，形態呈圓形，其中少數神經細胞外觀為長梭型，并開始伸出I~2個突起。第2天更換細胞維持液，培養24小時后，細胞形態多樣，如梭形、三角形、椎體形或不規則形，伸出突起的神經細胞逐漸增多長短不一。培養第72小時，神經元胞體增大，飽滿；3天后神經元形狀已很典型:胞體飽滿，多呈梭形、錐形，少數呈多邊形，胞漿豐富，核大，核仁隱約可見，突起明顯增長，背景中仍然可見極少數扁平狀多邊形的神經膠質細胞鋪墊。
[0073]在培養第3~5天，進行顯微鏡鏡檢，培養細胞出現體積變大、且大部分細胞出現典型的神經元形態，沒有雜細胞增殖，則說明培養成功。
[0074]本發明方法建立的海馬神經元原代培養細胞可存活5~9天，能夠滿足開展神經元細胞功能研究的需要。
[0075](6)細胞純化
[0076]如果觀測到有雜細胞存在，則進行細胞純化處理。
[0077]如果細胞培養48~72小時，觀察到有雜細胞存在，每孔加入阿糖胞苷(濃度為2~10 μ g/mL) lmL，再加入與阿糖胞苷溶液等體積的步驟(3)配制的細胞種植液，使阿糖胞苷終濃度為I~5μ g/mL，24~48小時后，用步驟(4)配制的細胞維持液完全換液。
[0078]實施例4
[0079]1.細胞活力試驗
[0080]表1培養的海馬神經元的細胞活力
[0081]
【權利要求】
1.一種海馬神經元的分離和原代培養方法包括以下步驟: (1)漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細胞、被膜及結締組織，用漂洗液沖洗2~5次； (2)消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細胞。 (3)制備細胞懸液:收集步驟2消化后初次細胞懸液，經200目細胞篩過濾后，800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細胞種植液，重懸細胞，制成5X IO5~IOXlO5個/mL的單細胞懸液； (4)接種、培養:將步驟3細胞懸液種植于預先鋪好多聚賴氨酸的培養皿及培養瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養箱中，種植后24~72小時換成細胞維持液，之后每隔兩天用細胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。
2.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述漂洗液，經過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmL D-Hanki s液中，混勻，加D-HanV s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存備用。
3.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述消化液，經過如下步驟得:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmL D-Hank' s液中，混勻，加D-Hank; s液定容至1000mL，0.22 μ m濾膜過濾除菌，0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存備用。
4.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述細胞種植液，經過如下步驟得到:DMEM/F12培養基加入胎牛血清、活性發酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存備用。
5.根據權利要求1所述的一種海馬神經元的分離和原代培養方法，其特征在于所述細胞維持液，經過如下步驟得到=Neurobasal培養基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2%，谷氨酰胺終濃度1%，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存備用。
6.根據權利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述D-Hank's液經過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g, Na2HPO4.12H200.12g, KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約500mL三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存備用。
7.根據權利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述雙抗是青霉素-鏈霉素溶液(100X):青霉素含量為10000U/mL，鏈霉素含量為10mg/mL。
8.根據權利要求4所述的細胞種植液，其特征在于所述活性發酵濾液經過如下步驟得到: ①青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis) LJM-001,該菌株已于 2010 年 08 月17日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.4090 ； ②青春雙歧桿菌LJM-001采用改良MRS培養基培養，培養基配方為:以重量計，取蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,酵母膏5g，葡萄糖20g,乙酸鈉5g，K2HP042g, MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫_801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。 ③將青春雙歧桿菌LJM-001接種于冷卻至40 ± 2 °C的步驟②改良MRS培養基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養24小時，用分光光度計測定上述培養液A58tlnm值為.1.2時，將上述培養液在轉數5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活 性發酵液濾液，4°C保存備用。
【文檔編號】C12R1/01GK103789267SQ201410066557
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月21日 優先權日:2014年2月21日
【發明者】劉洛賢 申請人:劉洛賢